Yöntem makalesi

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

DOI:

10.3791/55461

⸱

15 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) kardiyomiyositlerini -türevlenmiş dan Burada, insan mühendisliği kalp dokusu üretimini göstermektedir. Biz hERG kanalı inhibitörü e-4031 ile büzülme kuvveti ve kasılma biçimi örnek değişiklik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, kalp ilaç taraması için sağlamlık ve uygunluğu yüksek seviyesini gösterir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak doku mühendisliği üç boyutlu güç üreten işlenmiş dokular oluşturacak teknikleri tarif etmektedir. temel araştırmalar ve klinik öncesi ilaç geliştirilmesinde bu prosedürlerin uygulanması için, standart koşullar altında otomatik üretimi ve analiz için protokoller geliştirmek önemlidir. Burada, farklı türlerin (fare, sıçan, insan) kardiyomiyositlerden projelendirilmiş kalp dokusu (EHT) üretmek için bir yöntem sunulmaktadır. teknik 24 oyuklu bir formatta elastik polidimetilsiloksan (PDMS), destekler arasındaki ayrışmış kardiyomiyositlerde içeren bir fibrin jel montajı dayanır. Üç boyutlu, kuvvet üreten EHTs dökümden sonra iki hafta içinde oluşturmaktadır. Bu işlem, haftada birkaç yüz EHTs üretilmesine imkan tanır ve teknik olarak kardiyomiyositlerin mevcudiyeti ile kısıtlanır (0.4-1.0 x 10 6 / EHT). auxotonic kas kasılmaları Değerlendirilmesi mechan ile değiştirilmiş bir inkübasyon odası içinde gerçekleştirilirik 24 oyuklu plakalar için kilitleme ve bu haznenin üzerine yerleştirilen bir kamera. Bir yazılım kamera her EHT bir XYZ eksen sistemine taşındı kontrol eder. EHT kasılmalar otomatik bir şekil tanıma algoritması ile tespit edilir, ve bir güç PDMS mesajların EHT kısalması ve elastik eğilimi ve geometrisine göre hesaplanır. Bu prosedür standardize ve steril koşullar altında EHT yüksek sayıda otomatik analizi için izin verir. Kardiyomiyosit kasılması üzerindeki ilaç etkileri güvenilir algılama kardiyak ilaç geliştirme ve emniyet farmakoloji açısından çok önemlidir. İnsan EHT sistemi kardiyak ilaç güvenliği taraması için gelecek vaat eden bir araç olarak gösteren, insan kalbin kasılma kinetiği üzerindeki ilaç yanıtları çoğaltır, hERG kanalı inhibitörü E-4031 örneği ile, gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böyle ilaca bağlı uzun QT sendromu gibi kardiyak yan etkiler son yıllarda pazar çekme yol açmıştır. İstatistikler her çekme yaklaşık% 45'i kardiyovasküler sistem 1 istenmeyen etkileri nedeniyle olduğunu göstermektedir. Pahalı gelişimsel süreç ve onayından sonra bu ilaç yetmezliği ilaç firmaları için en kötü durum senaryosu. Araştırma ve geliştirme departmanları bu nedenle erken dönemlerinde bu istenmeyen kardiyovasküler etkilerin tespiti odaklanır. Ekonomik ve etik kaygılar, hayvan deneyleri azaltmak ve yeni in vitro tarama deneyleri ile bunların yerine çabaları için devam etmektedir.

Yerleşik tahlilleri kümesi Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) proaritmik ilaç etkileri 2 preklinik değerlendirilmesi için kılavuzlar dahil edilir. farklılaşması, ardından somatik hücrelerin yeniden programlama teknolojisiİnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) Bu araştırma alanı 3 artırdı. Şimdi in vitro insan kardiyomiyositlerindeki yeni ilaç adayları elemek mümkün kılmakta ve türler arası farklılıkları ile ilgili sorunları önler. Son kardiyak farklılaşma protokolleri 4, 5 etik kaygı olmadan kardiyomiyositlerinin sınırsız kaynağı sağlamak. Bununla birlikte, en önemli ve en iyi kardiyomiyositlerin in vivo parametre özelliği kasılma kuvveti ölçümü, iyi kurulmuş değildir. Bu yetişkin kardiyomiyosit kıyasla insan uyarılmış bir pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde (hiPSC-CM) olgunlaşmamış 6 ile ilgilidir. Olası bir ilerletme tek hücreler 7 (mühendisliği kalp dokusu, EHT) 3-boyutlu kalp dokusu mühendislik etmektir. EHT protokolü, tek sıçanlara ait ve insan kardiyomiyositlerde 8 gömme dayanır sup>, iki esnek polidimetilsiloksan (PDMS), mesaj 24 oyuklu bir formatta 11 arasında, fibrin hidrojel 9, 10. Birkaç gün içinde kardiyomyositler tek hücreleri olarak kendiliğinden sözleşme başlar ve hücresel ağlar oluşturmaya başlar. 7-10 gün sonra, bütün doku makroskopik kasılmaları görebilir. Bu işlem sırasında, hücre dışı matris çap ve uzunluk bir azalmaya yol açar, tekrar oluşturulur. PDMS eğilme EHT sonucu kısa sürede sürekli yük gelişmekte EHT kardiyomi tutulması, dinlenme sırasında bile sonrası. EHTs birkaç hafta içinde auxotonic kas kasılmaları gerçekleştirmeye devam ediyor. İnsan EHTs ilaç tarama ve hastalık 7 modellemek için uygunluklarını göstermektedir fizyolojik ve farmakolojik uyarılması sırasında olan tepkileri gösterir.

Bu yazıda Generati için sağlam ve kolay protokol mevcutİnsan EHT ve hERG kanalı inhibitörleri varlığında daralma desenin, konsantrasyona bağımlı değişikliklerin otomatik kontraktilite analizi ile.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aşağıdaki adımlar, bir hücre kültürü protokol açıklar. Steril şartlarda gerçekleştirmek ve önceden ısıtılmış medyayı kullanın.

hiPSC 1. Kalp Farklılaşma

  1. hiPSC Yetiştirmek
    1. Kaplama 6 oyuklu plakalar (1 ml / havuz) ya da daha düşük büyüme faktörü taban membran matrisi ile T75 şişesi (7 mL / şişe) (örneğin geltrex, 1: 200, malzeme tabloya bakınız) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında seyreltildi (DMEM) için 37 ° C'de 30 dakika. Karıştırılarak FTDA ortamı 12 hazırlayın temel DMEM / F-12 ortamı, 2 mM L-Glutamin,% 0.5 penisilin / streptomisin, 5 mg / l transferrin, 5 mg / L selenyum,% 0.1 insan serum albümini, 1 x lipit karışımı, 5, mg / l insülin, 50 nM dorsomorphin, 2.5 ng / ml aktivin A, 0.5 ng / ml insan TGFß1 ve 30 ng / ml, FGF2.
    2. 37 ° C'de,% 5 CO2, günlük bir değiştirilen ortam içinde% 21 O2 (en FTDA orta ve kültürde Tohum hiPSC (~ 3 x 10 5/10 cm²)Şekil 1A). (: 2-1: 6 1) (0.5 mM, inkübasyon süresi yaklaşık 4 dakika EDTA), etilen diamin tetraasetik asit,% 80 konflüansa, geçit de.
  2. Embriyoit cisimlerin formasyonu (EB)
    1. yüksek yoğunluğa T75 şişeleri içinde hiPSC geliştirin.
      1. Kalsiyum ve magnezyum (PBS), fosfat tamponlu salin ile iki kez konfluent hücreler ile şişeler yıkanır ve 10 dakika ~ 0.5 mM EDTA içinde inkübe edilir. Hücreler şişe dibinden ayırmak olmadığından emin olun.
      2. Cam pipet ile EDTA kaldırma hücreleri ayırmak için tezgah 10 ml PBS ile hücrelerin, dokunun şişeleri kapalı yıkayın.
        NOT: Kullanım hücre kazıyıcı gerekirse.
      3. Hacminin ¼ ekleyin 50 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak (örneğin, 10 ml Kan numuneleri, 40 mL hücre süspansiyonu) ve RPMI 1640 ortamı (ya da herhangi bir başka standart 1.8 mM kalsiyum içeren ortam) 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj.
    2. FTDA ortam içinde tekrar süspansiyon hücre topağı, 4 mg / ml polivinil alkol (PVA) ile desteklenmiş ve10 uM Y27632 ve bir Neubauer odası içinde hücreleri sayın.
    3. Hücre süspansiyonu ile bükme şişesi doldurun (30 x 10 6 hücre / 100 ml FTDA orta PVA ve Y-27632 ile takviye edilmiş adım 1.2.2) ve (40 rpm için manyetik bir karıştırma rotor hızını ayarlamak bükücü şişelerde oluşumu EB başlatmak ) karışımı gece boyunca hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2,% 5 O 2).
  3. mezodermal farklılaşması
    1. EB oluşumu sırasında, ceket, hücre kültürü, 37 ° C'de gece boyunca non-iyonik yüzey aktif madde (14 mL / T175) ile süspansiyon kültürü için uygun şişeleri.
    2. Ertesi sabah, PBS (30 ml / T175) ile iki kez yüzey aktif cisimle kaplı şişeler yıkayın. Tekrar PBS ekleyin ve gerektiği kadar kuluçka tutun.
    3. inkübatör bükme şişesi çıkarın.
      Not: Hücre süspansiyonu küçük makroskopik olarak görülebilen EBS (Şekil 1B) ile açık olmalıdır.
    4. 50 ml konik kazanına 50 ml süspansiyon aktarınE ve izin EBS 5-20 dakika razı.
    5. Süpernatantı ve% 2 PVA ve 10 uM, Y-27632 ile desteklenmiş RPMI 1640 7 mL pelet yıkayın. dereceli bir 15 mL konik tüp ve tahmin EB hacim (~ 50-100 uL) aktarın süspansiyonu.
    6. Kaplanmamış T175 balonuna döndürme şişeleri içeriğini aktarın ve en fazla 20 dakika boyunca çökmesi için V-şekilli bir raf üzerinde bırak. Süpernatantı ve yukarıda belirtildiği gibi embriyoit gövdeleri yıkayın. sedimantasyon çok uzun sürer olarak 200'den fazla mL T175 şişesi doldurmayın. ilk dönen şişe hacmi 200 mL aşarsa, çeşitli T175 balonuna EB süspansiyon bölünmüş ve yıkamadan sonra yeniden EBS birleştirir.
    7. mezodermal farklılaşması için bir ortam içinde, yıkama ortamı ve tekrar süspansiyon çıkarın, bu RPMI 4 mg / ml PVA,% 0.5 penisilin / streptomisin, 10 mM ile takviye değerinin 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES),% 0.05 insan serum albümini, 5 ug / ml transferrin, 5 ng / ml, sodyum selenit,% 0.1 lipit karışımı, 250 uM, fosfo-askorbat, 10 uM, Y-27632, 10 ng / mL bone morfojenik protein-4 (BMP-4), ve 3 ng / ml aktivin A, 5 ng / ml sabit FGF2.
    8. yüzey aktif cisimle kaplı T175 şişelerinden PBS çıkarın ve hücre süspansiyonu (40 mL, 200 uL EBS) ile doldurun. Daha küçük EB hacmi için daha küçük şişeler kullanın.
    9. Üç gün (37 ° C,% 5 CO2,% 5 O2) süspansiyon halindeki EBS geliştirin. Değişim (aşama 1.3.7 aynı bileşimin) ortamı% 50 günde (kullanımı V-şekilli sedimantasyon raf). Her gün öncesinde beslemeye orta taze hazırlayın.
  4. Kardiyak farklılaşma
    1. bir gün önce, yeni yüzey aktif cisimle kaplı damarları hazırlamak ve (1.3.2), yukarıda belirtildiği gibi kolu.
    2. mezodermal indüksiyon Üç gün sonra, EBS sedimantasyon raf kadar 5 dakika boyunca dinlenmesine izin verin. sıvı ortamı en iyi çıkarın ve% 0.5 penisilin / streptomisin ve 10 mM HEPES ile takviye edilmiş RPMI 1640 ile yıkayın.
    3. Aktarım 10 EB süspansiyon mL yer değiştirme içinsedimantasyon sonra 15 ml tüp ve tahmin EB hacmi.
    4. Yeniden süspanse EBS dikkatle kalp farklılaşma ortamı içinde% 0.5 penisilin / streptomisin, 10 mM HEPES,% 0.05 insan serum albümini, 5 ug / ml transferrin, 5 ng / mL sodyum selenit,% 0.1 yağ karışımı, 250 uM fosfo ile takviye edilmiş RPMI 1640 içeren -ascorbate, 1 uM, Y-27632, 100 nM, Wnt-inhibitör DS-I-7 13.
    5. Yeni yüzey aktif cisimle kaplı hücre kültür kaplarına EBS aktarın (~ 200 uL EBS 46 mL / T175 olarak).
    6. % 50 ortam değişikliği ile üç gün boyunca (37 ° C,% 5 CO2,% 21 O2) inkübe, ikinci ve üçüncü günde (ortam kompozisyonu adım 1.4.4 bakınız). İlk 48 saat içinde ortamı değiştirmeyin.
    7. Insülin ile 500 uM 1-tiogliserol, 10 mM HEPES,% 0.5 penisilin / streptomisin, 1 uM, Y-27632,% 2 serumsuz Nöral hücre kültürü eki (örneğin B27), 100 nM Wnt ile takviye edilmiş RPMI 1640 içeren bir ortam içinde inkübe -inhibitör DS-ıSonraki dört gün boyunca% 50 ortamı günlük değişimi ile -7. EBS Bu süre içinde dayak başlamalıdır.
    8. kalp farklılaşma Bir hafta sonra, Wnt inhibisyonu olmaksızın serumsuz Nöral hücre kültürü eki ile aynı ortama geçer. İlk gün hariç, her gün orta% 50'sini değiştirin.
  5. İnsan kardiyomiyositlerinin Ayrışma
    NOT: farklılaşma protokolünün iki hafta sonra, EBS kendiliğinden kasılmaları (Şekil 1C) göstermelidir. Eğer öyleyse, ayrışma başlar ve kollajenaz solüsyon hazırlanır.
    1. ((HBSS) ağırlığında ve kalsiyum / magnezyum olmadan kalsiyum içermeyen Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde 200 U / mL çözerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın ve 1 mM HEPES, 10 uM, Y-27632, 30 uM N-benzil-p-toluen sülfonamid ekleme BTS). -20 ° C'de filtre (0.2-um filtre) ve mağaza alikotları ile sterilize edin. gece boyunca 4 ° C'de parçalar çözülme.
    2. sedimantasyon rafa EBS yerleşmek,aspirat orta ve 20-25 ml önceden ısıtılmış HBSS ile değiştirin. Bir kez daha, bu yıkama adımı tekrar edin.
    3. Aspire HBSS ve önceden ısıtılmış kolajenaz çözeltisi (15 mL / T175) ile değiştirin. Hücre kültürü inkübatöründe 4 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2,% 21 O2) inkübe edin.
    4. DMEM,% 1 penisilin / streptomisin ve DNase (12 ug / ml) ile desteklenmiş ile bloke tamponu hazırlayın.
    5. bankta hücre kültürü şişeleri dokunun, EBS parçalanır ve dağılır (değilse, kuluçka süresini arttırmak) olmalıdır ayrışmış. Konik bir 50 ml tüp yavaşça çiğnemek hücre süspansiyonu ve transfer. tamponu (15 mL / T175) blokaj şişeler yıkayıp tüpe aktarın.
    6. 100 x g'de 10 dakika boyunca santrifüje. Sıcak DMEM, triturate hücrelerin tekrar ve hücreleri saymak.

Yapay kalp dokusunun 2. nesil (EHT)

  1. Malzeme (bakınız ticari olarak temin PDMS rafları ve politetrafluoroetilen (PTFE) ara parçaları otoklav veEkipman tablo; Şekil 2) ve bir gün önce EHT nesil, steril koşullar altında aşağıdaki çözümleri hazırlar.
    1. ağırlığında ve PBS, otoklavın uygun hacimde çözülmesiyle% 2 agaroz hazırlayın, hemen 60 ° C'de saklayın.
    2. aprotinin hazırlayın tartma ve su reklam iniectabilia uygun hacimde çözülmesiyle (33 mg / ml), -20 ° C'de steril (0.22 um filtre), bir kısım ve mağaza filtre.
    3. -20 ° C'de steril% 0.9 NaCl (ılık), kısım ve mağaza uygun hacimde steril fibrinojen çözülmesiyle (200 mg / ml) fibrinojen hazırlayın.
    4. Üç parça steril trombin çözülmesiyle trombin (100 U / ml) hazırlayın -20 ° C'de PBS ve 2 kısım su reklam iniectabilia, küçük tüpler 3 uL parça kısımları ve mağaza steril.
    5. 5 ml su reklam iniectabilia 670 mg 10x DMEM tozunun çözülmesiyle 10x DMEM hazırlayın, 4 ° C 'de, steril ve mağaza filtre.
    6. 2x DMEM hazırlayın2 ml ısı ile inaktive edilmiş at serumu, 0.2 ml penisilin / streptomisin ve 5.8 mL su reklam iniectabilia 2 mL 10x DMEM karıştırılarak, 4 ° C 'de, steril ve mağaza filtre.
    7. Hazırlama EHT döküm 4 ° C'de% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal dana serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin (200 mM), deposuyla DMEM karıştırılarak ortamı (ECM).
  2. 1.6 ml sıcak agaroz (% 2 PBS) pipetleme ve kuyulara PTFE ara parçası (Şekil 2A) yerleştirilerek 24 oyuklu plakalar içinde döküm kalıplarının hazırlanması.
    Not: yer boşluk, hemen sonra 8 kuyu maksimum içine pipetleme sonra - agaroz çok hızlı katılaşır. daha uzun 5 dakika boyunca oda sıcaklığında agaroz bırakmayın.
  3. Agaroz katılaşma (~ 10 dakika, agaroz opak dönecek) sonra, PTFE ara parçaları (Şekil 2C) kaldırmak ve PDMS mesajların çiftleri, her bir kalıp (Şekil 2D) içine ulaşacak şekilde döküm kalıpları içine PDMS rafları (Şekil 2B) yerleştirin.
  4. 15 x 10 6 hücre / mL düşük konsantrasyonlu ECM kardiyomiyositlerde yeniden süspanse edin.
  5. , Ice.For 24 EHTs bir yuvarlak tabanlı 15 mL'lik bir tüp içerisinde yeniden oluşturulması karışımı tahmini hacminin% 110 Hazırlama insan, sıçan veya fare kardiyomiyosetlere Tablo 1'de listelenen sulandırma karışımı pipetle (sırasıyla% 10 ilave dahildir).
    Not: sulandırma karışımı Hücre konsantrasyonu insan (10 x 10 6 hücre / mL), sıçan (4.1 x 10 6 hücre / mL) ve fare (6.8 x 10 6 hücre / mL) EHTs için farklıdır. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonuna bağlı olarak, 2.640 uL nihai hacimde ilave ECM ekleyin. Fibrinojen pipetleme için ılık olmalı. Yavaşça pipet ucu doldurup sulandırma karışımına fibrinojen eklerken fibrinojen içeren pipetle soğuk sulandırma karışımı yüzeyine dokunmayın - fibrinojen viskozitesini pipet hemen artacaktır.
  6. sulandırma karışımı toz haline getirin 10 - fibrinojen pıhtı kadar serolojik pipetle 15 kere çözülür. homojenliği için pipet içinde sulandırma karışımını kontrol edin.
  7. Bir trombin kısım (200 uL bir tüp içinde 3 uL) her bir EHT, pipet 100 uL sulandırma dengeyi sağlamak için, karıştırın ve olası (Şekil 2E) kadar hızlı bir şekilde agaroz-yuvalara karışımı pipetleyin. Her EHT için yeni bir filtre ucu kullanın. her 8 EHTs sonra (serolojik pipet 5-10 kez triturasyonunu) sulandırma karışımını tekrar.
  8. Bir kez tüm yuvalar sulandırma karışımı ile doldurulur, hücre kültürü kabı kapağını kapatın ve 2 saat boyunca 37 ° C'de,% 7 CO2 ile inkübe edin.
  9. Steril bir başlık altında inkübatör ve yerden plaka çıkarın. Her bir ortam ile küçük bir miktar (örneğin DMEM, yaklaşık 200-500 ul) Kapak, hafifçe plaka sallayın ve en az 10 dakika boyunca 37 ° C'de tekrar inkübe edin. DMEM eklenmesi agaroz döküm kalıplarından fibrin jel çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.
  10. de% 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu,% 1 penisilin / streptomisin, 10 ug / ml insülin, 33 ug / ml aprotinin ile takviye edilmiş DMEM kapsayan başına 1.5 ml EHT-ortam ile yeni bir 24 oyuklu plaka hazırlanması.
  11. Dikkatle agaroz döküm kalıpları PDMS rafları çıkarın ve orta dolu 24 oyuklu plaka (Şekil 2F) aktarın. Inkübatör (37 ° C,% 7 CO2, insan ve sıçan EHTs% 40 O2, fare EHTs için% 21 O 2) ve besleme Pazartesi, taze hazırlanmış EHT-ortamı ile Çarşamba ve Cuma çanak yerleştirin. EHTs 7-10 gün (Şekil 1D, 2G), döküm sonrasında PDMS rafların mesajlarını saptırma kendiliğinden kasılmaları göstermelidir.
    1. fare için EHTs fibroblast çoğalmasına sınırlamak için 48 saat boyunca kültür ortamına 5-sitosin βDarabinofuranoside 25 ug / ml.

3. Daralma Analizi

NOT: kasılma analizi dayanmaktadırVideo-optik bir ticari olarak temin edilebilir EHT analiz aracı kayıt (malzemelerin Tablo bakınız). Bu aletin ana ünite, inkübasyon odası (Şekil 3A) 'dir. Cihaz ile birlikte sağlanan yazılım bilinen elastik modül ve geometrisi 11 (Ek Şekil 1) PDMS mesajların sapma göre büzülme kuvveti hesaplar.

  1. ölçümünden önce makine 2 saat ısıtma aygıtı açın. kasılma analizden hemen önce gaz tedariki ve eksen sisteminin elektronik beslemesini açın.
  2. Taban kayıt (analiz referans noktası) için, EHT analizi alet içine EHT-ortamı içinde EHTs 24 kuyulu plaka yerleştirmek ve satıcılar kılavuzuna göre daralma analiz yazılımı başlar.
    1. Sağ panelde "Protokol" sekmesine tıklayın ve çalışma adı, kullanıcı, türler, ce ilgili bilgileri girmekll tipi, yaşı, kayıt uzunluğu ve ek açıklamalar.
    2. Sol panelde "Kamera görünümü" sekmesini tıklayın ve otomatik şekil algılama modu ile kamera canlı modunu başlatmak. xyz ile kamera pozisyonu 24-iyi çanak iyi her biri için koordinatları andadjust sağ panelde "Kur" sekmesine tıklayın. EHT pencerenin ortasında ve kameranın odak olduğundan emin olun.
      1. Bu rakam tanıma ve kasılma analizini bozar olarak hücre kültürü çanağı kapak sisli olmadığından emin olun.
        NOT: Şekil tanıma algoritması yüksek kontrast noktalarının tespit edilerek pozisyonda kendi değişikliği izleme dayanmaktadır. yazılımında şekil tanıma bu alanlar EHT küçülmesi ile hareket eden mavi haç ile işaretlenecektir.
      2. Mavi haç pozisyonları EHTs hem üst hem de alt ucunda bulunan ve yalnızca dikey EHTs (Şekil 3B) kasılmaları eşleşen hareketli olduğundan emin olun. S"Tamam pozisyon" düğmesine basarak her kuyunun ave kurulum pozisyonları.
    3. Daha sonra, sol paneldeki "Parametreler" sekmesine tıklayın. Burada görüntülenen parametreler yazılımı daralma zirveye tanımlar ve yeşil bir kare ile işaretler hangi kriterleri tanımlar. Bu değerler, daralma tepe (Şekil 3C) ve hiçbir yanlış veri noktaları (Şekil 3E-F) doğru tanımlanması için çok önemlidir.
      NOT: Bu tür bağımlı parametreleri ve örnekler listesi Şekil 3H de gösterilmiştir. Daha fazla bilgi için yazılım kılavuzuna başvurun.
    4. Sağ panelde "Otomatik" sekmesine tıklayın ve "Başlat" butonuna basmak suretiyle analizi başlatmak. Yazılım sonraki kayıt EHT kasılmaların bir kuyudan sırayla hareket ve (sol paneldeki "Gerçek zaman" sekmesinde görüntülenen) kayıt sırasında kuvvet hesaplar. analizi, pdf Raporun sonunda SummariSonuçları zing otomatik olarak oluşturulur.
  3. Kaydet ve pdf sonuçlarını özetlemek için oluşturulan sistemin rapor analiz.
  4. birkaç gün içinde tekrarlanan ölçümü ile kontraktil parametrelerini izleyin. Bir platoya (genellikle gün kültürünün 15) ulaşana kadar EHT kasılma kuvveti artacak.
  5. İlaç tarama
    1. Bir gün önce ölçüm protein Tyrode çözeltisi hazırlayın ve 24 oyuklu plakalar içinde dengeye (2 ml / çukur) hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 7 CO2,% 40 O2) karışımı gece boyunca 120 mM NaCl, 5.4 mM KCI, 1 mM MgCl2, 0.1-5 mM CaCl2, 0.4 mM NaH2? 4, 22.6 mM NaHCOj 3, 5 mM glikoz, 0.05 mM Na2 EDTA, 25 mM HEPES. Pozitif inotropik etkileri araştırmak için 1.8 mM veya daha önceden belirlenmiş [EC 50] kalsiyum kadar ekleyin.
    2. Tartın ve DMSO içinde ilaç çözülmüş ve gerektiğinde steril filtre.Çalışma konsantrasyonu (DMSO içinde) 6 farklı 1000x-alt stok çözelti hazırlayın (örneğin, 0.3, 1, 3, 10, 30, karşılık gelen nanomolar aralıkta 100 uM).
    3. Tyrode plakalarda ilgili stoku (her bir 2 mL 2 uL) seyreltin ve iyice karıştırın. ihtiyaç duyulana kadar kuluçka plakalar geri koyun.
    4. kuyularda steril kapağı ve pozisyon karbon elektrot altındaki ilk Tyrode ile doldurulmuş 24 kuyulu plaka alarak temel ölçüm başlatın. karbon elektrotların üstüne yerleştirilen EHTs PDMS rafları transfer, kapağı kapatın inkübatörde plaka koymak ve 30 dk'lık bir dengeleme süresi sonunda bekleyin.
    5. EHT analizi enstrümanda kilidine inkübatör EHTs aktarın. (20 s / EHT) aleti kapatın ve spontan taban kasılmasını kaydedin.
    6. ilerleme hızı kablosuna karbon elektrotları bağlayın ve EHTs (2.5 H, 4 msn darbe süresi, insan elektriksel uyarımı başlangıç: ~ 1Hz, sıçan: ~ 2Hz, fare: ~ 4 Hz). "Tempolu" taban çizgisi (10 sn / EHT) kaydedin. Tüm EHTs düzgün tempolu emin olun. Uyarım frekans ve gerilim hücre hattından hücre hattına değişebilir.
    7. taban kayıt sonra aletten EHTs kaldırmak ve birinci ilaç konsantrasyonu ile birlikte 24 oyuklu bir plaka, üst PDMS rafları ile elektrotlar aktarın. Hemen EHT analiz aygıtının kilitleme üzerine geri EHTs aktarın ve orada (standart ilaç inkübasyon süresi örneğin 20 dakika) inkübe edilir.
    8. Pacing kabloları takın Şekil tanıma ayarlamak ve birinci ilaç konsantrasyonuna yanıt EHT kasılmaları kaydeder.
    9. şu ilaç konsantrasyonları için, daha yüksek bir ilaç konsantrasyonu içeren 24 kuyulu bir levha ayak 3.5.7 ve 3.5.8 tekrarlayın.
    10. Tüm pdf kayıtları kaydedin. Daralma tepe ve eşya (Şekil 3 3.2.1 görmek belirlenmesi Şekil tanıma, yeşil kareler doğru konumlandırma için her kayıt kontrol ).
    11. Gerekirse ek çevrimdışı analiz gerçekleştirin.
      1. "Seç run" tıklayarak sol panelindeki "çalışır" veritabanından ilgili çalışmasını seçin. Soldaki "Parametre" sekmesinde, kasılma analizi için parametreyi değiştirin. Şimdi videoları tekrar analiz için doğru panelde "Çevrimdışı" sekmesinde "Çevrimdışı analizini" seçin.
      2. şekil tanıma ayarlamak ve bu nedenle yeni bir video dosyası kaydetmek için "gerçek zamanlı" sekmesinde rakam tanıma düzeltildikten sonra "Örnek inceleme" seçin. NOT: çevrimdışı analiz soldaki "Parametre" panelindeki düğme "Tüm kuyuların kullan parametresini" tıklayarak tüm kuyuları için yeni bir parametre uygulayabilirsiniz oysa örnek inceleme için sadece bir defada bir kuyu tekrar analiz edebilir. çevrimdışı analiz Her iki tür otomatik sonuçlarını gösteren yeni veri dosyaları ve pdf yaratacaktır.
    12. b sonuçlarını birleştirerek deney analiziological çoğaltır ve sıklığı, kasılma kuvveti, kasılma ve gevşeme zamanı (Şekil 5D) ve ortalama daralma tepe (Şekil 5C) arasında / veya grafiksel gösterim için konsantrasyon tepki eğrileri verileri özetler.
      Not: PDMS rafları ve PTFE ara parça tekrar tekrar kullanılabilir (. PDMS maksimum raflar 5 kez ve PTFE boşluk sonsuz). Kullandıktan sonra suyla elle temizleyin demineralize su ve otoklavda iki kez kaynatın. Uyuşturucu PDMS tarafından absorbe edilebileceği gibi, potansiyel carry-over etkileri, zaman rafları yeniden kullanarak farkında olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak Farklılaşma ve EHT Hazırlanması

HiPSC indirgenmiş gelişme faktörü taban membran matrisi genişletilmiş EDTA ve gece boyunca döndürme şişeleri oluşturulmuş embriyoit organları (EBS) ile ayrıştırılmıştır. Üç gün mezodermal indüksiyonundan sonra, kalp farklılaşma, Wnt inhibitörü ile başlatılmıştır. Farklılaşma protokolünün ~ 17 gün sonra, dayak EBS kollajenaz tip II (Şekil 1) ile tek bir hücre içine ayrıştır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tasarlanmış kalp dokusu kardiyovasküler araştırma aracı kutusuna değerli bir seçenek sunuyor. 24-kuyu formatında EHTs hastalık modelleme 8, 14, ilaç güvenliği taraması 7, 8, 10, 11, 15, ya da temel kardiyovasküler araştırma 16, 17 değerli kanı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IM, TE ve AH EHT Technologies GmbH, Almanya'nın ortak kurucuları oldular.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar malzemenin kendi tür katkılarından dolayı Alessandra Moretti ve Dennis Schade minnettarız. Biz Deneysel Farmakoloji ve Uke ait Toksikoloji Bölümü iPS ve EHT çalışma grubunun büyük destek kabul eder. yazarların çalışmaları DZHK (Kardiyovasküler Araştırma Alman Merkez) ve Milli Eğitim Alman Bakanlığı ve Araştırma (BMBF), Alman Araştırma Vakfı (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 hibe ile desteklenmektedir ), İngiliz Ulusal Merkez Değiştirme Sadeleştirme & Research Hayvanların Azaltma (NC3Rs çATLAK-IT 35911-259146 hibe), İngiliz Kalp Vakfı RM / 13/30157 için, Avrupa Araştırma Kurumu (İleri Grant IndivuHeart), Alman Kalp Vakfı ve Freie und Hansestadt Hamburg.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

2+2+

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EHT analiz cihazıEHT Technologies GmbHA0001Yazılımı dahildir
EHT PDMS rafıEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE ara parçasıEHT Technologies GmbHC0002
EHT elektrotEHT Technologies GmbHP0001
EHT pacing adaptörü/kablosuEHT Technologies GmbHP0002
24 kuyulu plakaNunc144530
6 kuyulu hücre kültürü plakasıNunc140675
15 mL falcon tüpü, dereceli Sarstedt62,554,502
Hücre sıyırıcıSarstedt831,830
Eğirme şişesiIntegra182 101
Karıştırıcı Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Rotor hızını 40 rpm'ye ayarlayın
T175 hücre kültürü şişesi Sarstedt 831.812.002
V şeklinde çökeltme rafı natimes'da özel olarak üretilmiştir
; DMEMGibco52100
1-Tiyogliserol Sigma AldrichM6145
2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzuSigma Aldrich49752
Aktivin-A Ar-Ge D sistemleri338-AC
Agaroz Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insülin ve nbsp;Gibco17504-044
BMP-4Ar-Ge D sistemleri314-BP
Kollajenaz II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, tip V (sığır dalağından)Sigma D8764
Dorsomorfin abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Fetal buzağı serumuGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinojen (sığır)Sigma AldrichF8630
Geltrex ve nbsp;GibcoA14133021:200 seyreltme
HBSS;Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
At serumuYaşam teknolojileri26050088
İnsan serum albümini Biyolojik Endüstriler05-720-1B
İnsülin, insanSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234EHT yeniden yapılandırma karışımı.
N-Benzil-p-ToluensülfonamidTCIB3082-25G
PBS, MgCl 2< / sub> / CaCl < sub>2< / sub>Biochrom14190
Penisilin / StreptomisinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Polivinil alkol Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Sodyum selenitSigma AldrichS5261
TGF & szlig; 1Peprotech100-21
TrombinSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCUKE hamburgna
iCell kardiyomiyositleri kitindeHücresel Dinamikler UluslararasıCMC-100-010-001
Plurisit kardiyomiyosit kitiPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC kardiyomiyositler kitiAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis kardiyomiyositleriTakara Bio ABD, Inc.Y10075
UKE Hamburg 10& Kaplama için: Ca/Mg  olmadan özel olarak üretilmiştir Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958(2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312(2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fibrin Gel AssemblyPDMS PostsForce MeasurementCamera Based DetectionFigure Recognition AlgorithmhERG Channel InhibitionE 4031 Drug Response

İlgili makaleler