Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

11.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55463

⸱

31 Mart 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Özet

külleme mantar ekonomik açıdan önemli fungal bitki patojenlerinin bir gruptur. Nispeten küçük nedeniyle iyi gelişmiş genetik ve genomik kaynak eksikliğinden kısmen, moleküler biyoloji ve bu patojenlerin genetik az şey bilinmektedir. Bu organizmalar, genom sekanslama ve montaj engelleyici zorlaştırmıştır büyük, tekrarlayan genomlara sahiptir. Burada, tek bir toz halinde küf türleri, Golovinomyces cichoracearum yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA toplanması, ekstraksiyon, saflaştırma ve kalite kontrol değerlendirilmesi için yöntemleri tarif eder. Açıklanan protokol, optimize edilmiş bir fenol / kloroform genomik DNA izolasyonu, ardından sporlar mekanik bozulmasını içerir. Tipik verim 150 mg konidia başına 7 ug DNA kullanılmıştır. Bu prosedür kullanılarak izole edilmektedir genomik DNA, uzun okuma sekanslama (yani> 48.5 kbp) için uygundur. Kalite kontrol önlemleri, genomik DNA'nın boyutu ile, verim ve saflığı sağlamak için de vardırBu metot dahilinde tarif. Burada tarif edilen kalite genomik DNA dizilenmesi düzeneği ve bu da daha iyi bir anlaşılmasına yol, birden çok külleme genomlarının, karşılaştırılması için izin verir ve bu tarımsal patojen kontrolü gelişmiş olur.

Giriş

Pudra küfleri zorunlu biotrophic mantar bitkinin bir grup birlikte alındığında, bitki hastalık dünya çapında 1 büyük nedenidir, bu patojenler bulunmaktadır. Taksonomik ailesi Erisyphaceae 2 içinde beş kabileler halinde gruplandırılmış olan külleme 900'ün üzerinde açıklanan türler vardır. ekonomik önemleri ve onların ana geliştirmek samimi bir ilişki için her iki dolayı, külleme hastalıkları> 100 yıldır araştırma konusu olmuştur. enfeksiyon üzerine, toz küfler bu patojenin yararlanmak için, hücreli yapının, metabolizma ve ana moleküler biyolojide önemli değişiklikler ortaya çıkarır. Bununla birlikte, toz küfü çalışma nedeniyle bunların zorunlu yaşam tarzı ve saf kültürde mantar büyümesi yapılmamış 5, 4, 3 tarif edilmemiştir için özellikle zor olduğu,"xref"> 6, 7, 8. Geçici transformasyon bazı türler 9, 10, rapor edilmiştir, ancak toz küfü güvenilir ve sabit bir genetik transformasyon ayrıca henüz gerçekleştirilmiş değildir.

külleme genomunun sıralama ve montaj nedeniyle genomun kendisinin bir dizi özellik zor olduğu kanıtlanmıştır. Diğer mantar genomların - (180 Mbp 120) göreli ve 60 oluşur - Toz halinde küf genomları büyüktür% 90 eşit olarak dağıtılmış tekrar eden kısımlar 11. Bu elemanlar, uzun terminal tekrarı, hem de edilmemiş tekrarlayan elementleri içerir. Tek külleme türleri, Blumeria graminis f iki formae SPECIALES. sp. hordei ve f. sp. tritici (BGH sırasıyla BGT) hem de üzüm külleme Erysiphe necator, arın sıralandı ve birkaç diğerleri için taslak genomları 12, 13, 14 tamamlanmıştır. Genomların tekrarlayan doğası düzeneği zorlaştırmıştır ve tamamlanan BGH genom 2 arasında bir L50 Mb 12 ile 6,989 supercontigs içine monte edilmiştir.

Büyük genomesi rağmen, toz küfler sırasıyla BGH'nin ve Bgt tahmin 5.845 ve 6,540 genleri ile, protein kodlama genlerinin az sayıda sahip gibi görünmektedir. Birbirini izleyen toz küfler de hayatta kalma 11, 12, 13, 14 ev sahibi bitki üzerinde mantar bağımlılığı ile tutarlıdır başka mantarlar içerisinde gerekli olan en az 99 çekirdek genlerden yoksun görünmektedir.

telomerlerin, sentromer, ribozomal RN yakın Tekrarlanan dizilerBir gen dizileri ve transpoze edilebilir elemanları zengin bolgelerın zayıf kısa okuma dizileme stratejilerinden monte edilir ve yeterince temsil genom tertibatları 15 genellikle edilir. Bu bölgelerin genom dizileri meydana boşlukların çok sorumlu olduğu düşünülen ve bu tekrar eden kısımlar 16 kendi geniş genişleme ile toz küfü için geçerli olan. Yüksek plastik genom bölümlerinin genellikle tekrar eden bölgeler 3 bulunmaktadır. Bunlar kromozom yeniden düzenlemelerinin bir alanı olarak hizmet ve genellikle bu efektör proteinlerini kodlayan genler ve ikincil metabolizma enzimleri kodlayan genler gibi güçlü selektif basınç altındaki genleri kodlayan. Tek moleküllü uzun okuma sekans teknolojilerini gelişmeler genomları 15 tekrarlamalı bölgelerde dizileme için potansiyel bir çözüm sağlar. Örneğin, Faino ve diğ. (2015) da dahil olmak üzere, uzun-dizi teknolojisi ve optik m okuma bulunduapping gen açıklamaları gen ek açıklama sayısını artırarak (ve kısmen sayısını azaltarak ya da eksik, genom içinde tekrar eden DNA dizilerinin oranını üçe bunları fungal bitki patojen Verticillium Dahlia iki soy için bir boşluk daha az genom dizisi üretmek için izin ) ve ortaya genom 17 yeniden düzenlemelerinin.

en az boyutları> 20 kbp bu uzun okuma dizileme teknolojileri, yüksek kaliteli, genomik DNA, yüksek konsantrasyonlarda kullanılması için, ihtiyaç vardır. Burada conidia gelen konidial toplanması, yüksek molekül ağırlıklı DNA 'nın arıtılması için yöntemleri tarif eder ve külleme türün Golovinomyces cichoracearum kullanarak kalite kontrol değerlendirmeleri salatalık 18 üzerinde büyümüş. Bu protokol B. Keller laboratuvar grubunda (Zürich Üniversitesi, Zürih İsviçre) 13, 19 geliştirilen bir protokol dayanmaktadırve artmış DNA verimlerine yol açan çok sayıda modifikasyonları ve büyüklüğü, DNA> 48.5 kbp daha yüksek bir oranını içermektedir. Protokol ayrıca Enstitüsü 20, 21, 22 Enerji Ortak Genom United States Department of tavsiyelerine göre kalite kontrol adımlarını içerir.

Liziz tamponu içerisinde yer alan her bir reaktif, ve her bir saflaştırma aşaması için mantık fonksiyonu olarak (2008) 23 Henry tarif edilmiştir. Bitki ve mikrobiyal dokularından, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA'nın izolasyonu için uygun yayınlanmış protokoller bu protokol 24, 25, 26, 27, 28 tasarımında başvurulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Mantar Malzemesinin 1. Hazırlanması

  1. Külleme Büyüyen
    1. Aşağıdaki koşullara büyüme odalarına bitkilerin büyümesi: 22 ° C gündüz sıcaklığı, 20 ° C gece sıcaklığı,% 80 nispi nem, 14 saat gün uzunluğu ve 125 uE / m2 / s 'lik bir ışık yoğunluğu (floresan aydınlatma sağladığı ).
    2. 18, 29 tarif edilen şekilde Golovinomyces cichoracearum gerilme UCSC1 salatalık bitkileri (Cucumis sativa çeşitli Bush Champion) Infect.
  2. Hasat Küllemesi Konidyumlar
    1. conidia toplandığı bir in-line filtre (11 um) ile bir küçük vakum kullanılarak aşılamadan sonra 10 gün - 7 enfekte bitkilerden hasat conidia. hafif basınç uygulanması, konıdi toplamak için yaprağın yüzeyi boyunca vakum memesi çalıştırın.
      Not: G. cichoracearum ortalama verimi ağır INFE gelen konidia 20 mg olanbölgede yaklaşık 130 cm2 CTED salatalık yaprağı.
    2. temiz bir kağıt tabakası üzerine filtreden (7-8 enfekte salatalık yapraklarına yaklaşık 375 uL hacmi veya conidia) conidia yaklaşık 150 mg bir fırça. Buradan (sıvı azot içinde) önceden soğutulmuş iki 5/32 inç çapında çelik öğütme topları ile 2 ml cryovials içine konıdi aktarın. Hemen sıvı nitrojen tüpleri döndürür. -80 ° C'de saklayın borular.
  3. Topu Mamüller tarafından Breaking Açık Konidyumlar
    1. Sıvı nitrojen içinde bilyalı değirmen alüminyum plakalar dondurma. Yük bilyeli değirmen rafa cryovials. Şiddetle (oda sıcaklığında) 30 döngü / s'de 30 s için bilyeli değirmende conidia ve çelik topları ile cryovials sallayın. Hemen sıvı azot içinde cryovials dondurursam.
      NOT: Başlangıçta, öğütme sırasında hücre duvarı kopma verimliliği için 100X büyütme mikroskobu ile Konidyumların bir örneğe erişmek. 30 döngü / S, B 30 saniyelik 2 mermi - Gerekirse, ek 1 öğütmekut minimuma mermi sayısını tutmak. Optimal koşullar kurulduktan sonra bu aşamada mikroskopla konidial kırılma Rutin değerlendirme gereksizdir.

2. genomik DNA saflaştırma

  1. Konidyumlar Liziz
    1. hızla çalışarak, çözdürme konidianıri önlemek bir mıknatısla cryovials çelik topları kaldırmak için. Karışım bir bulamaç elde edilinceye kadar 10 s - 700 ul 65 ° C lizis tamponu (Tablo 1) ve bir girdap 5 ekleyin.
    2. 300 uL (65 ° C) önceden ısıtılmış% 5 (h / h) sarkosil ekleyin ve yavaşça karıştırmak için beş kez (3 s başına 1 inversiyon) ters çevirin. 65 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin; 10, 20 ve 30 dakika yavaşça 3 kez ters çevirin. Geniş çaplı bir pipet kullanarak, yeni 2 mL mikrosantrifüj tüpüne tüm çözüm aktarın. takip eden tüm adımlar da, yumuşak, yavaş ters çevirme ile karıştırmak ve geniş çaplı bir pipet uçları olan bir DNA-içeren çözeltiler aktarın.
  2. DNA Ekstraksiyon I
    1. kloro 1 hacim eklemeformu: izoamil alkol: yavaşça lizis çözeltisine (24 1 hacim / hacim) ve beş kez çevrilerek karıştırılmıştır. yavaşça inkübasyonun sonunda tekrar orta noktada beş kez karıştırmak ve tersini, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 14,000 x g 'de 15 dakika süre ile oda sıcaklığında santrifüje. Geniş çaplı bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde yeni bir 2 ml mikrosantrifüj tüpüne Sulu tabaka transferi; arayüzünden madde içeren kaçının.
  3. DNA, yağış I
    1. 1 hacim oda sıcaklığında% 100 izopropanol (yaklaşık 750 uL) ilave edilir ve yavaşça, altı kez çevrilerek karıştırılmıştır. 14,000 x g 'de 15 dakika süre ile oda sıcaklığında santrifüje. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
    2. 450 uL önceden soğutulmuş (-20 ° C)% 70 etanol ekleme. 14.000 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. dikkatli bir şekilde ince bir pipet ucu ile süpernatantı ve atın, 3 s 1,000 x g'de santrifüjleyin. 15 dakika a için pelet hava-kurutunt, oda sıcaklığı. daha uzun 15 dakika kurutmayın.
    3. 300 uL TE pelet (10 mM Tris-CI, 1 mM etilen diamin tetra-asetik asit, pH 8.0) içinde yeniden süspanse edin. 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Yavaşça çözelti içine gitmedi kalan malzemeyi yeniden süspanse etmek fiske.
  4. RNA kontaminasyonu temizlemek 10 mL RNaz A (10 mg / ml) ekleyin. Yavaşça üç kez karıştırmak için ters. 3 s 1,000 x g'de santrifüjleyin. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  5. DNA Ekstraksiyon II
    1. 300 ul fenol ekleyin: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1 h / h) ve yavaşça beş kez çevrilerek karıştırılmıştır. nazikçe inkübasyon sonunda yine yarım işaretinde beş kez karıştırın ve için tersini, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 14.000 x g'de oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj. Geniş çaplı bir pipet kullanarak, yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
  6. DNA, yağış II
    1. 0.01 hacim 3 M sodyum asetat pH 5.2 (approximatel eklemey3 uL) yavaşça beş kez çevrilerek karıştırılmıştır. 2.5 hacim önceden soğutulmuş (-20 ° C),% 100 etanol (yaklaşık 750 uL) ilave edilir. Yavaşça beş kez karıştırmak için ters. -20 ° C de bir gece boyunca inkübe
    2. Santrifüj 14,000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
    3. 450 uL önceden soğutulmuş (-20 ° C)% 70 etanol ekleme. 14,000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. 3 s 1,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatle ince pipet ucu ve tamamen yok olan süpernatant kaldırmak.
    4. Oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca pelet hava-kurutun. 27.5 uL TE içinde pelletini. 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Yavaşça çözelti içine gitmedi kalan malzemeyi yeniden süspanse etmek fiske.
    5. Kısım kalite kontrol testleri için 22.5 uL TE (nihai hacim 25 ul) halinde 2.5 uL (aşağıya bakınız). dizileme için gönderilmeden önce 4 ° C'de saklayın DNA örnekleri. Uzun süreli depolama, mağaza örnekleri içinve -80 ° C 'de yırtılmayı önlemek için donma-erime döngülerinden en aza indirir.
      Not: doğru pipetle zor olabilir, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA olarak bu aşamada pipetleme dikkat ediniz, ve "QC kısım", genomik DNA örneği doğru bir temsili olduğundan emin olmak için önemlidir.

3. Kalite Kontrol

  1. Numune Saflık
    1. TE boş kullanarak, küçük hacimli spektrofotometrede QC alikot 1 uL yükleme ile DNA numunesi, saflığı analiz. Tutanak A260 / A280 ve A260 / A230 okumaları. Saf DNA, 1.8 ve 2.2 arasında, yaklaşık 1.8 ve A260 / A230 oranı olan bir A260 / A280 oranı olacaktır.
  2. Genomik DNA miktar belirlemesi,
    1. üreticinin talimatlarına göre bir ticari çift sarmallı DNA miktar deney kiti kullanılarak QC kısım ölçümü gerçekleştirmek.
  3. DNA Kalite Değerlendirmesi I
    1. Yük yaklaşık olarak 60 ng genomik DNA ve bir1x TAE (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA, pH 8.0) içinde bir% 0.7 agaroz jeli üzerinde DNA merdiveni. 70 V 40 çalıştırmak jel tertibatına - genomik DNA bantları kadar, 45 dakika, yaklaşık merdiven iyi ve bant ayırma 2 cm belirgindir. Bu koşullar mevcut jel elektroforez aygıtı göre ayarlanması gerekebilir.
  4. DNA Kalite Değerlendirmesi II
    1. Yük, yaklaşık 60, 0.5 x TBE (44.5 mM Tris, 44.5 mM borik asit, 1 mM EDTA, pH 8.3) ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde genomik DNA ve (değişken alanlı jel elektroforez için uygun), yüksek moleküler ağırlıklı DNA merdiveni ng 16 saat boyunca 80 kbp'lik dalga palslı-alan jel elektroforezi protokolü - 5 ile 0.5x TBE tamponunda çalıştırın.
  5. Bakteri, mantar, ve Bitki Kirleticilerin Değerlendirilmesi
    1. primerler ve amplifikasyon koşulları listesini kullanarak ribozomal genlerinin uygun iç transkripsiyonlu aralayıcılar (ITS) bölgelerin yükseltilmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmekTablo 2'de ed. Bir jel üzerinde elde edilen reaksiyon yük 10 uL.
      Not: ITS bölgesi ITS primerler mantar ile amplifiye edilmelidir külleme temsil eden bir grup. bu amplikonun ve bakteriyel veya bitki primerleri ile üretilen herhangi bir amplikon DNA kirlenme kaynağı belirlemek üzere dizilenmiştir edilmelidir. Sadece külleme ITS dizileri mantar amplikonuna bulunmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

G. saflaştırılan genomik DNA 60 ng temsili bir örneği, jel elektroforezi kullanılarak bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür cichoracearum ve palslı-alan jel elektroforez kullanılarak sırasıyla Şekil 1 ve 2 de gösterilmiştir. Marjinal geçmek ve kalite kontrolü başarısız geçiren Genomik DNA preparasyonu temsil edilmektedir. tamamen kalite kontrolü yapılan genomik DNA preparatları uzun okuma genom dizileme yaklaşımlar kull...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zorunlu biotrophic külleme mantar saf, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA elde etmek için, daha önce tarif edilen yöntemlerin değiştirilmiş bir versiyonu 30 geliştirilmiştir. Bu optimize edilmiş bir protokol kullanılarak ortalama verim 150 mg conidia başına 7 mg DNA, bir önceki protokol ile elde edilenin iki katıdır. Ayrıca, ortalama boyutu 48.5 kbp boyunca yaklaşık 20 kbp yükselmiştir. Bu protokol cucumber- G. cichoacearum sisteminde optimize edildi. biotrophic mantarların, diğer kü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu protokol, Ortak Genom Enstitüsü-Topluluk Dizileme Projesi'ni (#1657) desteklemek için geliştirilmiştir. Çalışma kısmen Philomathia Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı (#0929226) ve Enerji Biyobilimleri Enstitüsü tarafından S. Somerville'e desteklendi; ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (#310030_163260) tarafından B. Keller'e. Meslektaşlarımız M. Figureroa ve M. Miller'a (Minnesota Üniversitesi), R. Panstruga'ya (RWTH Aachen Üniversitesi), C. Pedersen (Kopenhag Üniversitesi), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja'ya (California Berkeley Üniversitesi), M. Wildermuth (California Berkeley Üniversitesi), R. Wise (Iowa Eyalet Üniversitesi) ve S. Xiao'ya (Maryland Üniversitesi) cömert tavsiyeleri ve burada açıklanan protokolü geliştirirken protokollerine gönüllü oldukları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MM400 Bilyalı DeğirmenRetsch20.745.0001Veya eşdeğer bilyalı değirmen
Bilyalı değirmen için 2 mL tüpSarstedt 72.694.007
5/32" paslanmaz çelik freze bilyalarıOPS DiagnosticsGBSS 165-5000-01
Mikroişlemci kontrollü 280 Serisi Su Banyosu 65 &� C'ye Önceden Ayarlanmış; C Thermo Fisher Scientific2825Veya muadili su banyosu
Mikroişlemci kontrollü 280 Serisi Su Banyosu 37 °C olarak önceden ayarlanmış; CThermo Fisher Scientific2825Veya eşdeğeri su banyosu
Eppendorf 5417R soğutmalı mikrosantrifüjKrakeler Scientific 38-022621807Veya eşdeğer mikrosantrifüj
Klorform: IAA (24: 1 v / v)Sigma-Aldrich C0549Cilt teması veya soluma durumunda tehlikelidir. Nitril eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü giyin ve kimyasal başlıkta çalışın
Fenol:Kloroform:IAA
(25:24:1 v/v)		Thermo Fisher Scientific15593031Cilt teması veya soluma durumunda tehlikelidir. Nitril eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü giyin ve kimyasal başlıkta çalışın
100% İzopropanolSigma-Aldrich 
%100 EtanolSigma-Aldrich 34923-20 ° C'ye kadar soğutun; C önceki kullanım
Sodyum AsetatSigma-Aldrich S2889
Rnase, Dnaz içermez (10 mg / mL)Thermo Fisher ScientificEN0531
Potasyum metabisülfitSigma-Aldrich P2522
Sodyum Lauril SakroinatSigma-Aldrich L9150
Tris tabanıSigma-Aldrich 
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-Aldrich EDS
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-Aldrich S9888
Setiltrimetil amonyum bromür (CTAB)Sigma-Aldrich H6269
Uvex by Honeywell Futura Gözlükler S345C, UvextremeStaples423263Veya muadili gözlük
High Five COBALT nitril eldiven, LARGENeta ScientificHFG-N193Veya muadili eldivenler
GelRed Nükleik Asit Jel Suda 10.000xBiotium41003
Etidyum Bromür 10 mg/mLBiotium40042Cilt teması halinde tehlikelidir. Nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA MerdiveniThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb CHEF DNA boyut standartlarıBio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172Veya eşdeğer nabız alanlı jel aparatı
Whatman kalitatif filtre kağıdı, Grade 1Sigma-Aldrich WHA1001042Veya eşdeğer büyüme odası
Percival Büyüme OdasıPercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 UV-Vis SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-8000-GLVeya eşdeğeri spektrofotometre
Quant-iT PicoGreen dsDNA Test KitiThermo Fisher ScientificP11496
TAE Tampon (Tris-asetat-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49Kullanmadan önce 1/50 oranında su ile seyreltin (1x'e kadar)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
Tris-Borat-EDTA, 10x Çözelti (Elektroforez)Thermo Fisher ScientificBP13334Kullanmadan önce 1/10 oranında suyla seyreltin (1x'e kadar)
Sıvı NitrojenSıvı nitrojen (-196 &°; C) donma tehlikesidir. Ayrıca ısındıktan sonra hızla genişleyecektir ve sıkıca kapalı bir kapta tutulmamalıdır
W29290710708976001 leke

Kaynaklar

  1. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
  2. Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
  3. Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
  4. Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
  5. Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
  6. Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
  7. Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
  8. Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
  9. Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
  10. Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
  11. Hacquard, S. Advances in Botanical Research. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).
  12. Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
  13. Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).
  14. Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081(2014).
  15. Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
  16. Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
  17. Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
  18. Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
  19. Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
  20. Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf (2016).
  21. Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf (2014).
  22. Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf (2016).
  23. Plant genotyping II: SNP technology. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).
  24. Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
  25. Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
  26. Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).
  27. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
  28. Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470(2014).
  29. Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
  30. User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

K lleme DNA EkstraksiyonuFenol Kloroform EkstraksiyonuUzun Okumal Dizileme DNA sPulsed Alan Jel ElektroforeziGenomik DNA PurifikasyonuFungal DNA zolasyonuDNA Kalite KontrolKonidya DNA EkstraksiyonuJel Elektroforezi Analizi
Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.