Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

8.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55466

⸱

16 Mart 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University

Bu makalede

Özet

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

Özet

Anlamak membran proteini kaçakçılığı, montaj ve ifade hücre içi organellerin kalanların ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında farklılık bir yaklaşım gerektirir. Geleneksel floresan bazlı ölçümler farklı organellere ikamet eden zar proteinleri ayırt yeteneği yoksundur. Kesici kenar metodolojileri toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile pH-duyarlı fluorophores bağlanmasıyla geleneksel yöntemlerle aşmak. TIRF aydınlatma, böylece arka plan azalan sinyal gürültü oranını artırmak ve çözünürlük arttırıcı, cam numunesi arayüzünden 150 nm'ye kadar örnek uyarılmaktadır. TIRFM içinde uyarma hacmi gibi periferik ER olarak plazma zarı ve yakındaki organelleri kapsar. Superecliptic pHluorin (SEP) GFP pH'ya duyarlı bir versiyonudur. Genetik olarak ilgi konusu bir membran proteini hücre dışı etki alanına SEP kodlayan fluorofor ile ilgili pozisyonlarıER ve hücre dışı bölgesinde lümen taraf. Eylül pH, 6 daha büyük olduğu zaman, floresan, ancak daha düşük pH değerlerinde kapalı durumda kalır. Bu nedenle, (PM) plazma membranında endoplazmik retikulum (ER) 'de ya da sokulması üzerine bulunan ancak bir trafik vezikül veya Golgi gibi diğer organellere sınırlı değilken Eylül floresan ile etiketlenmiş reseptörleri. ekstrasellüler pH, plazma zarı üzerinde reseptörlerin floresan dikte ayarlanabilir. Aynı hücre için nötr ve asidik hücre dışı pH TIRF görüntüleri arasında floresan farkı, plazma zarı üzerinde reseptör göreli sayısına karşılık gelir. Bu hücre içi ve plazma zarı ikamet reseptörlerinin bir ölçümünü sağlar. ekstrasellüler pH plazma membranı ile füzyonu bir floresan haline geçiş, düşük pH trafik vezikül tekabül eden nötr olduğunda tek vezikül yerleştirme etkinlikleri de ölçülebilir. bu versatilE tekniği membran proteinlerinin lokalizasyonu, ifade ve ticaretini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Reseptör ifadesi, dağıtım, ve montaj değişiklikler Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kistik fibroz, ve madde bağımlılığı, 1, 2, 3, 4, 5 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir yelpazede bağlı olmuştur. Örneğin, nikotin ve nikotinik ligandlar kaçakçılığı, ifadesi ve yukarı doğru düzenleme, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 değişikliklere yol nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR'ler) kaçakçılığı etkilemektedir. Nikotin, bir hücre içinde bir araya nAChR'lerin sayısı artar, plazma zarının kaçakçılığı artırand bazı alt tiplerinin yüksek hassasiyet sürümünü lehine alt birimlerinin montajını değiştirir. bir hastalık modelinde kaçakçılığı, montaj ve reseptörlerin ifadesinde belirgin değişiklikler çözümleniyor ilaç hedefleri tanımlamak için gerekli olan çok önemli mekanistik ayrıntıları sağlar. Ideal bir yaklaşım hızla hücre içi reseptörler ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında ayrım olur. Bu, belirli bir proteinin bir çoğunluğu bu nAChR'lerle gibi, hücre bulunduğu durumlarda, özellikle zordur. nAChR'lerin çoğunluğu endoplazmik retikulum lokalize olduğundan, geleneksel ölçümler salgı yolu boyunca lokalizasyonu ve kaçakçılık değişikliklerini saptamak için gerekli uzay-zamansal çözünürlüğe yoksundur. NAChR'lerin Reseptör kaçakçılığı ve anlatım çalışmaları öncelikle 11 Radyogland bağ, biyotinilasyon deneyleri 12, batı lekeleme 13 veya immünopresipitasyon techniq kullanılarak yapılmıştır ues 12. Bu hücreler, bir raportör molekülü veya tespitin bağlama spesifikliği bağlıdır ve aynı zamanda plazma zarı yerleşik ve hücre içi reseptörler ayırt kabiliyetinden yoksundur. Bu nedenle, iyon kanal montaj ve vezikül dinamikleri çalışmalar büyük ölçüde düşük verimlilik elektrofizyolojik teknikler 14 yararlanmıştır.

Üstün mekansal ve zamansal çözünürlükte floresan mikroskobu gelişmeler ile mümkündür. , Yeşil flüoresan protein (GFP) ve türevleri gibi genetik olarak kodlanmış raportör moleküller, spesifik olmayan bağlama sorunları ortadan kaldırmak ve hassasiyeti 15 artar. Superecliptic pHluorin (SEP) olarak bilinen GFP bir pH duyarlı varyantı, yeri 5, 7, 8 belirlemek için, hücre içinde bölmeler arasında doğal pH farklılıkları yararlanmak için kullanılabilecekref "> 9, 16, 17, 18. Eylül pH 6 daha yüksek olduğunda fluoresces, ancak daha düşük pH değerlerinde bir kapalı durumda kalır. Bu nedenle, lümen tarafında SEP ile etiketlenmiş reseptörleri endoplazmik retikulumda mevcut olduğunda tespit edilir ( bir trafik kesecik sınırlı ER) veya plazma zarı (PM) içine sokulması üzerine, ancak., plazma zarı üzerinde reseptörleri ile temas ekstrasellüler pH manipülasyonu sonuç olarak floresans ve bu reseptörlerin nedenle algılama değiştirir. aynı hücre halinde ardışık olarak nötr ekstrasellüler pH ile 6 daha düşük daha sonra bir pH hem de görüntülenmiş olan, görüntü arasındaki fark, plazma membranı üzerinde bulunan reseptörlere bağlanabilir. Bu, aynı anda hücre içi ölçümünü (periferik ER) ve plazma membran yerleşik reseptörleri 5 karşılaştırın 7, 8 p> 9. hücre dışı pH nötr olduğunda tek vezikül ekleme olaylar da çözülebilir. Düşük pH trafik vezikül plazma membranı ile kaynaştıran sonra, vesikül luminal tarafında floresan 7, 18, 19, 20 bir patlama olarak algılanabilir bir geçiş neden nötr hücre dışı çözeltiye maruz bırakılır. Eylül plazma membranı ve periferik endoplazmik retikulum lokalize reseptörlerin ölçüm sağlar ve bu hücre içi bölgelerde 5, 7, 18 arasında reseptörlerinin kaçakçılığı ölçmek için bir araç sağlar.

plazma membranında yüksek çözünürlük elde etmek için, genetik olarak kodlanmış SEP ile reseptör toplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) tarafından görüntülü. Bu yöntem, özellikle biryararlı reseptörlerin çoğunluğu TIRFM plazma zarı görünürlüğünü arttırır, çünkü hücre içi bölgelere lokalize ise. TIRFM da PM içine sokulması üzerine Eylül-etiketli reseptörleri taşıyan tek veziküllerin kaçakçılığı dinamiklerinin çözünürlüğü sağlar. Toplam iç yansıma bir hücre ve bir cam kapak-slip 21, 22 arasında olduğu gibi, farklı kırılma indislerine sahip malzeme ara yüzeyinde meydana gelir. Cam ve hücre çözümü arayüzünde toplam iç yansıma elde aydınlatmaktadır 488 nm uyarma, ışınlanmış zaman Eylül fluoresces. Bu örnek, bu hacmin içinde sadece heyecanlı fluorophores içine yaklaşık 150 nm nüfuz bir evanescent dalga üretir. ikaz bu aralık içinde nötr pH ortamında reseptörleri içeren sadece Eylül plazma membranı veya periferik endoplazmik retikulum üzerinde bulunan kişilerce karşılık gelen tespit edilir. algılama sınırlı t olduğundanhücre içi bölge kaybolan dalga eşiğe göre O uyarım azalır ve sinyal gürültü oranı, 22 21 arttırılır. Buna ek olarak, hücre toplu nüfuz etmez ışıma, fotohasar zaman içinde canlı hücre görüntüleme sağlayan en aza indirilir. Bunun bir sonucu olarak, TIRFM Eylül salgı yolu boyunca membran reseptörlerinin hücre içi lokalizasyonu ve trafik dinamikleri ölçmek için gerekli olan yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlayan genetik olarak kodlanmış ile birlikte.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu

  1. Büyüme ortamı fare nöroblastom 2a (N2a) hücreleri korumak.
    1. Yüksek glikoz 200 mi Dulbecco'nun Eagle ortamında (DMEM) 500 mi N2a büyüme ortamı yapmak, 250 mi, serum ortamı, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), düşük ve 5 ml penisilin / streptomisin (100 X).
    2. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir T75 şişesi içinde hücreleri korumak.
    3. Bölünmüş hücreler 01:15 gerektiğinde, ya da yaklaşık% 80-90 confluency. Bu genellikle haftada 2-3 kez olduğunu.
  2. Coat 35 mm cam poli-D-lizin ile alt çanak.
    1. Laminer akış biyo-güvenlik kabini, steril 35 mm çanak cam alt bölgesi üzerine 0.1 ug / ml poli-D-lisin 200 ul ekle.
    2. 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde çanak yerleştirin.
    3. Dikkatle GKD 2 O 3-4 kez yemek durulayın.
    4. Birden fazla 1 saat boyunca yemekler tamamen kurumasını bekleyin.
    5. SterilGerekirse biyogüvenlik kabini UV ışık kullanarak yemekleri ize.
  3. TIRFM görüntüleme için N2a hücreler plaka.
    1. yapışık hücrelere büyüme ortamı çıkarın.
    2. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 5 dakika süreyle 1 ml 1 x tripsin (+ EDTA) ile inkübe edilerek şişe bundan sonrakinden hücrelerin ayrılmaları.
    3. 9 ml büyüme ortamı ekleyerek tripsin inaktive. Bir pipet kullanarak medya, tripsin ve müstakil hücreleri karıştırın.
    4. Görme hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve her bir poli-D-lizin kaplı cam alt çanak 90.000 hücre eklemek için doğru hacmi hesaplamak. Bu yoğunluk etkin transfeksiyon ve tek bir hücre TIRF görüntüleme için gereklidir.
    5. 90.000 hücreleri içeren her cam alt çanak 2 ml büyüme ortamı ekleyin.
    6. 16-24 saat süreyle% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin çanak.
  4. N2A transfeksiyon
    1. dahil bir Eylül fluorofor içeren bir plazmid yapı eldeilgili proteinin hücre-dışı bölümü içine. Bu PCR amplifikasyonu 5 gibi standart klonlama teknikleri yapı oluşturmak için de kullanılabilir.
      NOT: endoplazmik retikulum veya trafik veziküllerin lümeni içinde bulunduğu ve plazma membranı üzerinde hücre dışı çözeltisine maruz kaldığı Eylül membran proteini hücre dışı bölgesinin dahil edilmesi gerekir. GFP ve benzeri klonlama stratejileri kullanılabilir SEP boyutu benzer.
    2. 1.5 mi düşük serum ortamında kaplama hücreleri üzerinde büyüme ortamı yerine (örneğin, Opti-MEM), yaklaşık 30 dakika transfeksiyon reaktifi ilave edilmeden önce.
      NOT: reseptörleri ilacın yol açtığı değişiklikleri incelemek için, ilacın, uygun bir konsantrasyonu, transfeksiyon zamanı eklenebilir.
    3. 250 ul düşük serum ortamı oluşturmak her istenilen plazmid 500 ng ekleyin (tüp 1).
    4. Ayrı bir tüp c transfeksiyon reaktifi 2 ul ekleindirgenmiş serum ortamı içeren gruptur 250 ul. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında boru 2 inkübe edin. DNA plazmid transfeksiyon reaktifi oranı her bir ilgi proteini ifade etmek üzere optimize edilmelidir.
    5. transfeksiyon reaktifi ve plasmid karışımı, 500 ul içeren bir solüsyonun hazırlanması için tüpler 1 ve 2 bir araya getirin. 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. tabak başına 2 ml'lik toplam hacmi 500 ul transfeksiyon karışımı önceden kaplama hücreleri ekleyin.
    7. 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
    8. 24 saat sonra, transfeksiyon karışımı çıkarın ve büyüme ortamı ile hücrelerin yıkayın ve daha sonra her bir tabak için büyüme ortamının 2 ml ekleyin.
      NOT: Bir ilaç transfeksiyon zamanı ilave edildi, bu, bu aşamada daha doldurulan olabilir.
    9. 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
    10. Görüntü hücreleri transfeksiyondan 48 saat sonra.

Toplam In tarafından 2. Canlı Hücre Görüntülememodu, harici Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

  1. Görüntüleme kurmak
    1. Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir tarama aşaması ile ters flüoresan mikroskop kurulumu ile görüntüleme gerçekleştirin. Bu 488 nm DPSS lazer kaynağının hizalanmasını gerektirir bir kademeli motor 488 nm ışın pozisyonu ve yüksek sayısal aralığı (1.49 NA) 60X ya 100X yağ daldırma objektif ayarlayın.
    2. Uygun uyarma filtresi (bant geçiş 488/10 nm) aracılığıyla lazer ışını geçirin. Bir step motora monte edilmiş bir başlatıcısı bağlı bir tek modlu fiber üzerinden polarize lazer ışını aynı hizaya getirin. Epifloresans modunda, uyarma ışın hedefi arka diyafram ortasında merkezli.
    3. kritik açı ulaşıldığında ve kiriş artık numune boyunca iletilir ve yerine tamamen cam cel yansıyan kadar TIRF elde etmek için, objektif lens arka diyafram boyunca odaklanmış bir lazer ışını çevirmek için step motor kullanmakl arayüzü.
    4. Uygun emisyon filtresi ile görüntüleme yazılımı (örneğin Metamorph) ile kontrol edilen bir EMCCD (512 x 512 piksel) kullanarak Yakalama görüntüleri emisyon yolunda monte (525/50 nm).
  2. Görüntüleme çözüm hazırlayın
    1. GKD 150 mM NaCI, 4 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glükoz karıştırılarak 200 mi hücre dışı çözelti (EİS) hazırlanması 2 O stok çözeltileri NaCI, KCI, MgCI2, ve CaCl2 önceden hazırlanmış ve görüntüleme gününde taze HEPES ve glikoz ile kombine edilebilir.
    2. pH 7,4-100 mi ECS ihtiva eden bir çözeltinin pH'ının ayarlanması. 5.4 arasında bir pH değerine ECS kalan 100 ml ayarlayın. ECS 2 ml (pH 7.4) ile transfekte hücrelerin durulayın.
    3. görüntüleme önce transfekte hücrelere ECS 2 ml (pH 7.4) eklenir.
  3. TIRF Canlı hücre görüntüleme
    1. includin tüm sistemi açıng 488 nm lazer, kamera, çeviri sahne ve görüntüleme programı. Epifloresans ışını Odak ve 60X objektif yaklaşık 1 mW güç ayarlayın.
    2. amaç yağ ekleyin ve çeviri sahnede transfekte hücrelerin bir tabak koyun. Hücreler birden çok kez görüntülenmiş olabilir bu yüzden sahneye göre hareket etmiyor sağlamak için sahne bağlar kullanarak yerine çanak sabitleyin.
    3. Epifloresans modunda, mikroskop odak ve floresan, transfekte hücreler bulun. Hücreler çeşitli odak düzlemleri boyunca odaklanmaya devam edecektir. TIRF ile devam etmek tek izole hücreler bulun.
    4. görüntüleme programı, 200 milisaniye maruz kalma zamanını ayarlamak ve EM kazanç ayarlayarak floresan yoğunluğu optimize.
    5. step motor kullanılarak kademeli bir şekilde objektif karşısında ışını çevirerek TIRF içine lazer ışınını Geçiş. o th yakınsar kadar kritik açı yaklaşırken, kiriş gözle görülür yemeğin kenarı boyunca tercüme edecektirÖrnek uçakta toplam iç yansıma e noktası.
    6. Hücreler odak düğmesini ayarlayarak TIRF modunda olduğundan emin olun. TIRF, hücrelerin sadece bir düzlemde, plazma membranının yüksek çözünürlüğe sahip bir çok tanımlanmış bir görüntü üreten (cam arayüzünden, yani yaklaşık olarak 150 nm) odaklanabilir.
  4. Hücre içi lokalizasyonu belirlemek için görüntüleme Eylül
    1. Görüntüleme düzlemde sağlıklı, transfekte tek hücreleri bulun.
    2. pH 7.4 hücrenin odaklanmış bir görüntü kazanır. Eylül görünür olmalıdır plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde reseptörleri etiketli.
    3. Hızlı photobleaching önlemek için örnek ulaşmasını lazer ışınını bloke eder.
    4. Birden fazla xy yeri kayıt yeteneğine mikroskop görüntüleme yazılımı kullanarak her hücreye karşılık gelen sahne pozisyonları ezberleyin.
    5. yazılımı kullanırken çanak başına 20-30 hücreleri için adımları tekrarlayın 2.4.1-2.4.4 her hücrenin konumunu kaydetmek için.
    6. AfpH 7.4'te tüm hücre görüntüleri toplanan ter, elle pipet kullanarak pH 7.4 ECS çözüm kaldırmak. Bu ezberlemiş sahne pozisyonları hareket olabilir gibi çanak dokunmayın.
    7. Dikkatle çanak pH 5.4 ECS 2 ml ekleyin ve 10 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, önceden edinilmiş görüntüleri kaydetmek.
    8. PH 7.4 görüntüleri toplamak kaydedilen her pozisyona sahne taşımak ve pH 5.4 de aynı hücrede bir görüntü elde etmek için kullanılan koşullar aynı set altında. algılanan tüm floresan reseptörleri etiketli Eylül sınırlı endoplazmik retikulum kaynaklı beri Hücreler daha az tanımlanmış bakmak gerekir. pH 5.4 hücre görüntüleri kaydedin.
  5. Canlı hücrelerde Görüntüleme tek vezikül ekleme olaylar
    1. 2 mi, pH 7.4 ECS ile transfekte edilmiş hücrelerin büyüme ortamı yerine veya Leibovitz L-15 ortamı ile. Leibovitz L-15 ortam maddesinin pH değeri, gerekirse görüntüleme uzun bir süre boyunca meydana sağlayan CO2 bağımsızdır.
    2. Placmikroskop sahnede transfekte hücrelerin çanak e. Güvenli ve yukarıdaki Adım 2.3 aşağıdaki TIRF tek bir hücreyi odaklanır.
    3. Varsa odak görüntüleme süresi boyunca kayması değil böylece, otofokus ayarlayın.
    4. Sürekli 200 msn bir kare hızında fotoğraf çekimi, 1.000 kare bir dizi kaydedin. floresan patlamaları dışı pH 7.4 SEP açığa plazma zarı ile kaynaştırarak düşük pH kaçakçılığı veziküller karşılık, bu süre içinde görünür olacaktır.
    5. başka bir tek hücreyi bulup yukarıdaki adımı tekrarlayın. Gerekirse otofokus sıfırlayın.

3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme

  1. Eylül floresan analiz hücre içi lokalizasyonu belirlemek için
    1. Bu Metamorph ya ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) gibi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak hücre görüntüleri açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak hem pH 5.4 ve pH 7.4 görüntüleri arka plan çıkarın.
    2. tek bir hücreden floresan ölçmek için bir yoğunluk threshold kullanın. El ile pH 7.4 görüntüdeki hücrenin çevresinde ilgi bir bölge seçin.
    3. , Hücre alanını ölçün yoğunluğu ortalama ve entegre yoğunluk ImageJ bir eklenti kullanarak veya Analiz sekmesi altında "Tedbir" fonksiyonu yerleşik kullanarak.
    4. dikkatle aynı şekilde ilgi yoğunluğu tabanlı eşiği ve bölgeyi ayarlama, pH 5.4 aynı hücre için adımlar 3.1.1-3.1.3 tekrarlayın.
    5. Entegre yoğunluğu hem pH 7.4 ve 5.4 hücre görüntüler için elde edildikten sonra, pH 7.4 değeri, pH 5.4 değeri çıkarılarak plazma zarı entegre yoğunluğunu hesaplar. Fark TIRF uyarma bölgede plazma zarı üzerinde göreli sayı reseptörlerine karşılık gelir.
    6. İnsan ticareti bir tedbir olarak, SEP göreceli yüzdesi TIRF excitati görünür kalan reseptörlerine kıyasla plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler etiketli hesaplamak100 ile çarpılarak pH 7.4'de toplam entegre yoğunluğu ile yoğunluğu entegre plazma zarı, bölerek birimde.
  2. Tek vezikül ekleme olayları analiz
    1. görüntü analiz yazılımı kullanılarak 1.000 tiff görüntü serisi açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak tüm kareleri arka planı çıkarma.
    2. Ekleme olayları mesaneye gelen yoğun bölgeleri maksimize etmek kaydın renk dengesini ayarlar. El ile daha uzun 3 kare (> 600 msn) süren floresan patlamaları saymak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir reseptör olarak Eylül dahil canlı bir hücreye reseptörün doğrudan tespit edilmesine olanak sağlar. TIRFM ile birleştiğinde, bu plazma zarı ve TIRF uyarma bölgede hücre içi yerlerinizdeki reseptörlerin dağılımı üzerindeki bağıl ifade seviyelerinin değerlendirilmesini sağlar. Tek vezikül kaçakçılığı olayları da çözülebilir.

Plazma Zarında Eylül-etiketli Reseptör göreli İfade Düzeyleri

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

SEP pH duyarlılığı, plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler endoplazmik retikulum hücre içi reseptörler ayırt edilmesini sağlar ve sokma olayları çözmek için kullanılabilen reseptör taşıyan veziküller 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Yüzey biyotinilasyon ve ligand dahil olmak üzere çeşitli teknikl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü T32 DA 016176, Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü DA 038817 ve Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü DA 040047 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif/Malzeme
Filtre Kapaklı Hücre Kültürü Şişeleri, Steril, Greiner Bio One, 75 cm2VWR82050-856
35 mm cam tabanlı Petri kapları, sterilCell E& GGBD00002-200
Poli-D-lizinvwr215017510
Dulbecco Modifiye Eagle Medium‎ (DMEM), Yüksek GlikozFisher Scientific11-965-084 
Opti-MEM I Azaltılmış Serum BesiyeriGibco / Fisher Scientific31-985-088
Fetal Sığır Serumu, Sertifikalı, ABD Menşeli, Standart (Steril Filtreli) Gibco / Fisher Scientific16-000-044
TrypLE Express Enzim (1x), fenol kırmızısı yokFisher Scientific12604-021
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiVWR45000-652
Leibovitz'in L-15 Orta, fenol kırmızısı yokGibco / Fisher Scientific21083027İsteğe Bağlı
LipofiktaminFisher Scientific 11668030Yavaşça karıştırın; Sodyum klorürü girdap yapmayın
Fisher ScientificBP358-1
Potasyum klorürFisher ScientificP217-10
Magnezyum klorürFisher ScientificBP214-500
Kalsiyum klorürFisher ScientificC79-500
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-GlikozFisher ScientificD16-1
Objektif daldırma yağı OlympusTipi F
İsimCompanyKatalog NumarasıYorumlar
Equipment
MikroskopOlympusIX81
Fotoğraf MakinesiAndoriXon Ultra 897
60X, 1.49 NA yağa daldırma objektifiOlympusAPON 60XOTIRF
Motorlu sahneÖncekiIXPROXY
Motorlu aktüatör (step motor)ThorlabsZST213
MetaMorph (veya başka bir görüntüleme programı)Metamorph
488 nm lazerPazar Teknolojisi
Tek modlu fiberThorlabsSM450
AynalarThorlabsBB1-E01
Dikroik 488 nm LPSemrockDi02-R488-25x36
Bant geçiren filtre, 488 nmSemrockLL01-488-12.5
Bant geçiren filtre, 525/50SemrockFF03-525/50-25

Kaynaklar

  1. Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
  2. Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
  3. Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
  4. Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
  5. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  6. Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
  7. Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
  8. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
  11. Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
  12. Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
  13. Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
  14. Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
  15. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  16. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  17. Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
  18. Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
  19. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
  20. Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
  21. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  22. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
  23. Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Membran Proteini TaşınımıToplam İç Yansımalı FloresanTIRF MikroskopisiHücre Dışı pH AyarlamasıPlazma Membranı ReseptörleriEndoplazmik RetikulumTekil Vezikül YerleşimiFloresan Görüntüleme Yöntemi
pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.