Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak Suncus murinus

Summary

Sunkus murinustaki ekstrahepatik safra yolundaki nörofilament protein ekspresyonunu görselleştirmek için bütünüyle monte edilen bir immünohistokimyasal yaklaşım . Burada sunulmaktadır. Bu protokol, S. murinus veya diğer türlerdeki tüm iç organların innervasyonunu analiz etmek için kullanılabilir.

Abstract

Bu çalışma, tüm montaj immünohistokimyası boyama yöntemini detaylı olarak anlatmaktadır; nörofilament protein antikoru, Sunci murinus ( S. murinus) ' daki safra yolunun innervasyonunu etiketlemek için kullanmaktadır   ). İlk olarak, numune S. murinus'dan ayrılmış ve% 4 paraformaldehitle (PFA) sabitlenmiştir. İkincisi, bir enzimatik tedavi ve potansiyel endojen peroksidaz inaktivasyonu gerçekleştirildi. Sonra, numune birincil antikor anti-nörofilament protein antikoruna 3-6 gün maruz bırakılmıştır. Ardından, yaban mersini peroksidazı ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe edildi. Renk reaksiyonu, numunenin bir 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substratı ile reaksiyona sokulmasıyla ortaya çıkmıştır. Bu yöntem bütün iç organların innervasyonunu analiz etmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu protokol, diğer nöronal antikorları test etmek için de adapte edilebilir, ancak antibodilerin optimizasyonuEsler önce yapılmalıdır. Bu yöntem başlangıçta Kuratani ve Tanaka tarafından tanıtıldı ^{1 , 2 , 3} .

Introduction

Ev sinek fıtığı , Suncus murinus , Insectivora ve Soricidae ailesine aittir. Bu minik memeli, Güneydoğu Asya'da dağılmıştır ve insan yerleşim yerleri veya sığır kalemlerinin yakınında bulunan evlere ve çimenlik alanlara yerleşmiştir. Bu tür, fare, sıçan ve tavşan gibi diğer laboratuar hayvanlarına göre insanlara daha fazla benzeyen genel morfolojik özellikleri sergilemektedir. Daha önce, pankreas ⁶ , büyük duodenal papilla ⁷ , pilor ⁸ , safra kesesi ⁵ ve ekstrahepatik safra yolu ^9'daki periferik sinirleri etiketlemek için S. murinus nevrofilament proteini (NFP) için bir periferik nöron işaretleyici ile birlikte tümüyle bağlanan immün boyama yapıldı.

NFP olgun nöronal hücre iskeletinin bir parçası olan makromoleküler bir kompleksdir. Nörofilamanla ilgili proteinNFP ve zigosom arasındaki etkileşime aracılık eder. Hem enzim fonksiyonu hem de bağlayıcı proteinlerin yapısı NFP ¹⁰ tarafından düzenlenir. NFP kompleksi üç polipeptidden oluşur: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) ve NF-H (200 kDa). NFP hem merkezi hem de periferik sinir sisteminde nöronal aksonlarda bulunabilir. Anti-insan NFP antikorunun, merkezi ve periferik sinir sisteminin aksonlarını işaret ettiği gösterilmiştir. Anatomik ve elektrofizyolojik araştırmalar sfinkter, safra kesesi ve proksimal gastrointestinal sistemin ^{11 , 12 , 13 , 14'e} bağlı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, nöronal bağlantılarının morfolojik özellikleri henüz tanımlanmamıştır.

Bu çalışma, S. murinus bil'in innervasyonunu etiketlemek için tam monte bir immünohistokimyasal boyama yönteminin kullanılmasını göstermektedirBir NFP antikoru ile birlikte.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler Tokyo Büyükşehir Belediyesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Hayvanlar, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca muhafaza edildi ve işlendi . Japonya'nın Tokyo Büyükşehir Belediyesi Sınır Sağlık Bilimleri Bölümü Fonksiyonel Morfoloji Laboratuvarı'nda yetiştirilen ve bakımını sürdürdükleri hayvanları kullandık.

1. Hayvan Bakımı ve Konut

1. Kapalı yetiştirme kolonisinden 7 S. murinus (3 kadın ve 70-90 g ağırlığında 4 erkek) elde edin.
2. S. murinus'u, kağıt şeritleri içeren ahşap yuva kutusuna sahip plastik kafeslerde sütten kesildikten (doğumdan 20 gün sonra) ayrı ayrı tutun. Onları geleneksel şartlara sahip bir hayvan odasında tutun: 23-27 ° C, nem kontrolü yok ve 12:12 saatlik ışık: karanlık döngü. Ticari olarak tedarikAlabalık topakları ve su ad libitum.

2. Doku Hazırlama

1. % 4 (w / v) paraformaldehid (PFA) hazırlamak için, 40 mL PFA'nın 1,000 mL 0.01 M Fosfat Tamponlu Tuzu içinde (PBS, pH 7.4) çözündürülmesi. Duman kabininde, solüsyon berrak oluncaya kadar bir girdap kullanarak karıştırın. 4% PFA O / N'yi 4 ° C'de saklayın.
   Dikkat: PFA kullanırken uygun Kişisel Koruyucu Ekipmanları (PPE) giyin.
2. Hayvanı perfüze ile tamir etmek için eteri anesteziyle eter ile inceltin ve daha sonra intraperitoneal bir somnopentil enjeksiyonu yapın (pentobarbital sodyum, 0.6 mL / kg vücut ağırlığı).
3. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, 3 cm uzunluğunda bir orta hat abdominal insizyon oluşturarak bisturi ile karın boşluğunu açın. İnferior vena kava çıkartılarak inceltilirken, bu arterin bifurkasyonunun hemen üzerindeki iliyak arterlerin hemen üstündeki seviyede abdominal aorta retrograd olarak bir kateter takın.
4. Somnopentil enjekte edin (pentobarbital yaniDium, 1.0 mL / kg vücut ağırlığı). Ötenazi sona erdikten sonra, bir duman dolabında 0.01 M PBS (pH 7.4) ve daha sonra% 4 PFA ile seyreltin.
5. Perfüzyondan sonra, kan damarlarını etiketlemek için 2-3 mL beyaz neopren lateks (distile Su (DW) ile seyreltik beyaz neopren lateks 3: 2) enjekte edin.
6. Karaciğer, safra kesesi, safra kanalları, duodenum ve pankreas en blokları dahil olmak üzere karın organlarını ilgili sinir ve damarlarla çıkarın.
7. Safra kesesine yaklaşık 0.1 mL mavi neopren lateks (mavi mürekkeple 10 mL inceltilmiş beyaz neopren lateks ekleyin) enjekte ederek safra sistemi etiketleyin.
8. Tam monte immün boyama için 4 ° C'de% 4'lük PFA ile gece boyunca düzeltme yapın.
   Dikkat: PFA toksiktir. PFA'yı doğrudan kullanmaktan kaçının. PFA, duman kabininde kullanılmalıdır.

3. Bütün montaj immünohistokimyası

Not: Yıkama, antikor inkübasyonu ve renklendirme de dahil olmak üzere protokol boyuncaE numune besleyici üzerinde kalmalı, nazikçe oda sıcaklığında veya 4 ° C'de salınmalıdır ^.

1. Gün 1: Enzimatik tedavi ve potansiyel endojen peroksidazın inaktivasyonu
   1. Hazırlanan örneği DW 4x ile uygun bir boyutta cam flakon içerisinde 1 saat süreyle oda sıcaklığında yıkayın. PFA'yı çıkarmak için numuneyi nazikçe sallayın. Çözüm alışverişi yaparken numuneye zarar vermemek.
   2. % 1 (w / v) ortoperiodik asit hazırlamak için 1 g ortoperiodik asit 100 mL DW'de eritilir.
   3. Entrensek peroksidaz reaksiyonunu önlemek için numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 1 ortoperyodik asit ile inkübe edin.
   4. 0.004 g papainin, 100 mL 0.025 mol / L Tris-HC1 tamponunda (pH 7.6) çözülmesi ile% 0.004 (w / v) papain hazırlayın.
   5. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika oda sıcaklığında yıkayın.
   6. Örnek, yeni hazırlanmış% 0.004 papain içinde 37 ° C'de 2 saat süreyle hafifçe sallanan bir sabit sıcaklık banyosunda inkübe edin.
   7. Numuneyi D ile yıkayınOda sıcaklığında 50-60 dk.
   8. Numuneyi 4 ° C / N'de% 4 PFA içinde saklayın.
2. 2. Gün: Enzimatik tedavi
   1. Elde edilen numuneyi 1 saat boyunca oda sıcaklığında DW ile 4 kez yıkayın.
   2. Örnek, yeni hazırlanmış% 0.004 papain içinde 37 ° C'de 2 saat süreyle hafifçe sallanan bir sabit sıcaklık banyosunda inkübe edin.
   3. Numuneyi oda sıcaklığında 50-60 dakika oda sıcaklığında yıkayın. Numuneyi 4 ° C / N'de% 4 PFA içinde saklayın.
3. 3. Gün: Dondurma tedavisi
   1. Depolanmış numuneyi, yukarıdaki gibi RT'de 1 saat boyunca DW 4x ile yıkayın.
   2. 2.5 g, 5 g ve 10 g sakrozun sırasıyla 100 mL 0.01 M PBS'de çözülmesi ile% 2.5 (w / v),% 5 (w / v) ve% 10 (w / v) sukroz hazırlayın PH 7.4).
   3. Numuneyi, her biri 30 dakika boyunca% 2.5 (w / v),% 5 (w / v) ve% 10 (w / v) sakroz içine daldırın.
   4. Numuneyi -20 ° C'de 30-60 dakika boyunca dondurun ve sonra oda sıcaklığında tam olarak çözündürün; Döngüyü 3x tekrarlayın.
   5. Üst% 2 Triton X-100 (v / v), 100 mL 0.01 M PBS'ye (pH 7.4) 2 mL Triton X-100 ekleyin.
   6. Numuneyi% 2 Triton X-100'de 4 ° CO / N'de saklayın.
4. 4. Gün: Birincil antikor inkübasyonu
   1. Primer antikorun seyreltme solüsyonunu 0.2 mL Bovine Serum Albumin (BSA), 0.3 mL Triton X-100 ve 0.1 g sodyum azid'in 100 mL 0.01 M PBS (pH 7.4) içerisinde çözündürülmesi ile hazırlayın.
      Dikkat: Sodyum azid akut toksiktir. Solunması ve dokunulması engellenmelidir. Uygun PPE kullanın.
   2. Yukarıdaki seyreltme tamponunda primer antikoru (NFP) 1: 600 sulandırın (adım 3.4.1). Örnek hafifçe besleyici üzerinde sallanan tutarak, 3 ° C 3-6 gün boyunca NFP antikoru ile örneği inkübe edin. Daha büyük numuneler inkübasyon sürelerinin artmasını gerektirecektir.
5. İkincil antikor inkubasyonu
   1. Bağlanmamış birincil antikoru çıkarmak için numuneyi oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de 4x yıkayın.
   2. 0.2 g BSA ve 0,3 mL Triton X-100'ün 100 mL 0.01 M PBS (pH 7.4) içinde eritilmesi ile sekonder antikor için seyreltme solüsyonunu hazırlayın.
   3. Seyreltme tamponu (adım 3.5.2) ikincil antikor (peroksidaz konjuge, afinite saflaştırılmış koyun anti-fare IgG-HRP) 1: 600 seyreltin. Numuneyi, ikincil antikor ile 4 ° C'de 3 gün inkübe edin ve numuneyi yavaşça nutrator üzerinde salıncak tutun.
6. renklendirme
   1. Çözeltiyi karanlıkta tutarak, duman dolabının altında 0.002 g 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB), 0,05 mL mol / L Tris-HCI tamponuna (pH 7.6) ilave ederek DAB renklendirme çözeltisini hazırlayın.
   2. Numuneleri oda sıcaklığında PBS 4x'de 1 saat boyunca yıkayın.
   3. Yeni hazırlanmış DAB renklendirme çözeltisine 10 uL% 30 H202 ekleyin ve 4 ° CO / N'de solüsyon ile inkübe edin veya hafifçe nutrator'da sallanırken 3 d süreyle inkübe edin.
   4. Reaksiyonu pla tarafından durdurunOptimum boyama yoğunluğuna ulaşıldığında PBS içinde% 0.04 sodyum azid ile numuneyi cingleyin.
      NOT: Bu adıma kadar sodyum azid kullanmaktan kaçının, çünkü bu yaban mersini peroksidazını inhibe eder.
7. Boyalı dokuyu görüntüleme
   1. PBS içeren bir petri cam tabakasına (5 cm yüksekliğinde, 10 cm çapında) dikkatli bir şekilde örnek aktarın. Bir stereomikroskopta monte edilmiş bir kamera kullanarak tümüyle monte edilmiş görüntüleri yakalayın.
      NOT: Şeffaf bir cam tabağa PBS içinde tamamen batırılmışken, tümüyle monte lekelenmiş dokular görüntülenecektir.

Results

Şekil 1 - 4 , S. murinus'un ekstrahepatik safra yolunda NFP-pozitif sinir lifleri için tipik sonuçları göstermektedir. NFP'ye karşı antikor, yüksek özgünlük ve asgari seviyede ekstrahepatik safra yolunun ( Şekil 1 ), safrakesesi ( Şekil 2 ), üst safra kanalının ( Şekil 3 ) ve duodenal papilla alanının ( Şekil 4 ) tüm görüntüsün...

Discussion

Bu çalışma, nörofilament proteine ​​karşı bir antikor kullanarak ekstrahepatik safra yolunun innervasyonunun görselleştirilmesi için deneysel prosedürü açıklamaktadır. Bu protokol, Kuratani ve Tanaka ^{1 , 2 , 3} tarafından tanımlanan protokolden uyarlanmıştır.

Bu deney için, tüm montaj boyama yaklaşımı 2-3 hafta sürdüğü için, deneylerin her biri için zaman çizelgesini planlayın. Dondurma / çözülme işl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ortoperiyodik asit	Wako	162-00732
papain	Wako	164-00172
sığır serum albümini (BSA)	Wako	010-15131
sodyum azid	Nacalai Tesque	312-33
nörofilament protein (NFP) antikoru	Dako	M0762, lot 089, klon: 2F11
peroksidaz konjuge afinite saflaştırılmış koyun anti-fare IgG-HRP	MBL	Kodu 330
3,3 '-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)	Wako	349-00903
imidazol	Sigma	I-0125