Göz dolaşımındaki etiketli kan hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi, diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyonda inflamasyon ve iskemi hakkında bilgi sağlayabilir. Kan hücrelerini etiketlemek ve retinal dolaşımda etiketli hücreleri imal etmek için bir protokol tarif edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Retinal ve koroidal kan akımı dinamikleri, glokom, diyabetik retinopati, yaşla ilişkili maküla dejenerasyonu (AMD) ve diğer oküler inflamatuvar durumlar gibi çeşitli göz hastalıklarının patofizyolojisi ve sekeli hakkında fikir sağlayabilir. Ayrıca, gözdeki terapötik tepkilerin izlenmesine yardımcı olabilir. Etiketlenmiş hücrelerin canlı hücre görüntülemesi ile birleştirilmiş kan hücrelerinin doğru şekilde etiketlenmesi, retina ve koroid sirkülasyonundaki akış dinamiğinin incelenmesine olanak tanır. Burada, sırasıyla, farelerde eritrositler ve lökositler için% 1.5 indosiyanin yeşili (ICG) ve% 1 sodyum fluorescein'in standart protokollerini açıklıyoruz. Taramalı lazer oftalmoskopi (SLO), C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retina dolaşımındaki etiketli hücreleri görselleştirmek için uygulandı. Her iki yöntem fare retinal dolaşımında farklı floresanla etiketlenmiş hücreler gösterdi. Bu etiketleme yöntemleri çeşitli oküler hastalıklarda daha geniş uygulamalara sahip olabilirmodelleri.
Giriş
Retina ve koroid sirkülasyonunda kan hücrelerinin akış dinamiklerini incelemek, görme engelli göz hastalıkları ve diğer oküler inflamatuvar durumların patogenezini anlamak için şarttır. Bununla birlikte, floresan boyaların plazma proteinlerine bağlanmasını içeren geleneksel anjiyografi teknikleri, eritrositlerin veya lökositlerin dinamikleri ile ilgili herhangi bir bilgi sağlamaz 1 . Eritrosit retina akışı dinamikleri, çeşitli inflamatuar koşullarda hücre göçü, tanıma, adezyon ve yıkımı anlamak için retinadaki metabolik olarak etkili dolaşımı ve lökosit akış dinamiğini incelemek için önemlidir 2 . Çeşitli hücre tiplerin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada kullanılan hayvan protokolleri, SingHealth, Singapur'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Oftalmikte ve Vizyonda Hayvanların Kullanımı İçin Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Kurumu (ARVO) Beyannamesi uyarınca uyulmuştur Araştırma.
1. Eritrositlerin ve Lökositlerin Floresan Boyalarla Etiketlenmesi
- Reaktiflerin hazırlanması
- 3 mg ICG'yi 1800 μL sterilize edilmiş damıtılmış suda eriterek ICG'yi (1.5 mg / mL) hazırlayın. 200 uL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- 6 mL steril damıtılmış suya 4 mL 1x PBS ekleyerek% 40 1x PBS hazırlayın. 10 ml 1x PBS 100 mg....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
% 1.5 ICG ile etiketlenmiş eritrositler, C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retinal dolaşımında görselleştirildi. Retinal dolaşımda,% 1.5 ICG etiketli eritrositlerden% 1 ve% 5 hematokrit ayırdedilebilirdi. Bununla birlikte, bireysel etiketli hücreler,% 1.5 ICG ile etiketlenmiş eritrositlerin% 1'lik hematoktriti ile daha net görselleştirildi ( Şekil 1 ). % 5 hematokritte, retina damarlarındaki çok sayıda etiketlenmiş hücre yüzünden, tek tek hücreleri işar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Birçok oküler hastalığın patofizyolojisini anlamak için retinal ve koroid sirkülasyonundaki hemodinamiğin araştırılması hayati önem taşımaktadır. Retinal dolaşımdaki kan akımı dinamikleri Fourier domain optik koherens tomografi (FD-OCT), lazer speckle flowgraphy (LSFG) ve retinal oksimetre ile incelenebilir. Bu yöntemler, retinal dolaşımdaki toplam kan akışını incelemek için farklı yaklaşımlar kullansalar da, 40 , 41 , 42 .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok. Mali veya çıkar çatışması yok.
Teşekkürler
Araştırma projesi Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC), Singapur'dan Yeni Araştırmacı tarafından finanse edildi. Ekip, Kasım 2012'den Ekim 2014'e kadar Prof. Dr. Rahibe Gül'ün danışmanlığı altında Ulusal Tıbbi Araştırmalar Konseyi (NMRC) Yurtdışı Araştırma Eğitim Bursu kapsamında Gözlemevi Enstitüsü (Io), Londra Üniversitesi Koleji (UCL) üzerinde Dr Agrawal'a verilen araştırma eğitimini onaylamak istiyor. David Shima. Agrawal, Dr. Shima'nın laboratuvarında hücrelerin etiketlenmesi ve canlı görüntüleme konsepti ve becerileri edinmiştir. Ekip, dolayısıyla Prof. David Shima, Kenit Meissner, Dr. Peter Lundh ve Dr. Daiju Iwata'nın eğitim arkad....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cardiogreen polimetin boyası (İndosiyanin yeşili) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Floresein 100 mg / mL | Novartis | U1705A / H-1330292 | |
| 10x Fosfat tamponlu salin (PBS) Ultra Saf Sınıf | 1. BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Sığır serum albümini | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| K2E (K2EDTA) içeren mikrotainer tüpler - EDTA konsantrasyonu - 1.8 mg / mL kan | BD, ABD | REF | |
| Histopaque 1077 çözeltisi | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Santrifüj 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL | Axygen | MCT-200-CS | |
| Vorteks karıştırıcı | Insta BioAnalytik pte. ltd | İNCE GİRDAP | |
| Çalkalayıcı inkübatör | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamin enjeksiyonu (Ketamin hidroklorür 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Ksilazin hidroklorür 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Sınırlı | LI0605 | |
| %1 Midriasil 15 mL (Tropikamid: %1) | Alcon Laboratuvarlar, Inc. ABD | NDC 0998-0355-15 | |
| %2,5 Mydfrin 5 mL (Fenilefrin hidroklorür %2,5) | Alcon Laboratuvarlar, Inc. ABD | NDC 0998-0342-05 | |
| İğneli Terumo şırınga 1 cc/mL Tüberkülin | Terumo (Filipinler) Corporation, Filipinler | SS-01T2613 | |
| Vidik Jel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Almanya | ||
| Alkollü bezler | Tıbbi tek kullanımlık malzemeleri garanti eder | 7M-004-L-01 | |
| Konfokal lazer taramalı anjiyografi sistemi (Heidelberg Retina Anjiyografi 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Almanya | ||
| Hiedelberg Spectralis Görüntüleme Modülü yazılımı, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Almanya | ||
| Floresan mikroskop | ZEISS | Model: axio görüntüleyici z1 |
Kaynaklar
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
