Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

8.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55503

⸱

13 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Centre for Prions and Protein Folding Diseases & Department of Biochemistry, University of Alberta

Bu makalede

Özet

(+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg periton ya da dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon ailesel A53T mutasyon ve ateş böceği lusiferaz ile insan alfa-sinükleinin eksprese eden farelerden, nöro de dahil olmak üzere, nevropatlojinin uyarabilir bunların merkezi sinir sistemindeki.

Özet

yanlış katlı alfa-sinüklein prion benzeri bir davranış çalışma yapmak için, fare modelleri, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde nevropatlojinin neden olan alfa-sinüklein prionoids, hızlı ve basit bir iletimine izin verir ihtiyaç vardır. Farelerde, prion proteini promoterinden A53T mutasyonu ile insan alfa-sinükleinin aşırı ifade eden ve ateş böceği lusiferaz: Burada bigenic Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) içine alfa-sinüklein fibrillerinin bu intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyon tarif glial fibriller asidik protein promotörü (GFAP), nöropatolojik hastalık oluşturmak için yeterlidir. Hayvanların bir ulaşana kadar spontan hastalığı serbest kalır: 8 ay, heterozigot Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) bir yaşta başlayan şiddetli nörolojik semptomlar gelişebilir homozigot Tg (M83 + / +) fareler karşılaştırıldığında 22 ay yaşı. İlginç bir şekilde, intraperitone ile alfa-sinüklein fibrillerinin enjeksiyonu229 ± 17 günlük bir ortalama kuluçka süresi ile farelerde: el yol beş Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) dördünde felçli nörolojik hastalık kaynaklı. Hastalıklı hayvanların beyinleri ve omurilik fosforile alfa-sinüklein ciddi birikme gösterdi. alfa-sinüklein birikimleri sarkosil çözünmeyen ve ubikuitin ve P62 ile birlikte lokalize olduğunu ve astrositik gliyoz ve mikrogliyozu sonuçlanan bir enflamatuar tepki eşlik etti. Şaşırtıcı bir şekilde, dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin aşılama 285 gün sonra, alfa-sinüklein patolojiyi gösteren beş enjekte edilen hayvanların sadece bir tanesi ile hastalığa neden olan daha az etkili olmuştur. Bulgularımız (+/- M83: GFAP -Luc +/-) intraperitoneal yolla intraglossal rota ve daha çok yolu ile aşılama Tg sinükleinopatilerin ilgili işaretlerinden ile nörolojik hastalık ortaya çıkarmak için uygun olduğunu göstermektedir fareler. Bu neden prion-benzeri patojenezinin araştırılması için yeni bir model sağlardaha ayrıntılı olarak, alfa-sinüklein prionoids tarafından d.

Giriş

alfa-sinüklein özellikle kendinden tohuma sıfatıyla prion proteininin benzeyen ve hücreler arasındaki ve nöronal yollar boyunca yanlış katlanması yaymak özelliklere sahip olduğunu kanıtlar gittikçe artmaktadır. Alfa-sinüklein Bu özellik aynı zamanda 'prion-benzeri' ya da 'prionoid' olarak adlandırılır, ve yeni sağlıklı nöronlar 1, 2 nakledilen hastalıklı nöronlardan yanlış katlanmış alfa-sinüklein bulaşıcılığını göstermektedir nakli deneylerinde, gözlem ile desteklenmektedir , 3, 4. Ayrıca beyin veya çevresine, örneğin arka bacak, kas veya bağırsak duvarı, distal kısımlarına alfa-sinüklein patoloji yayılması ile sonuçlanır içine yanlış katlanmış alfa-sinüklein doğrudan enjeksiyon MSS 5, 6, 7, 8, 9, 10. Daha ayrıntılı olarak, periferik yollar ile alfa-sinüklein prionoids iletimini analiz edilmiş ve yanlış katlı alfa-sinüklein, tek intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyondan sonra daha önce prionlar için değil, yanlış katlanmış alfa- için gösterilmiş olan bir özellik merkezi sinir neuroinvade olup olmadığı sorusunu ele synuclein. Dillerine prionların enjeksiyonundan sonra, CNS neuroinvasion beyin sapı 11 bulunur hipoglosal sinir, çekirdeğine neden dilin hipoglosal sinir boyunca yayılımı ile elde edilir. Tarafından astrositik aktivasyon izleme prion promotöründen insan alfa-sinüklein A53T mutantını aşırı ifade eden, ve ateş böceği bir GFAP promotörünün kontrolü altında lusiferaz fareler: bir fare modelinde olarak, Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) seçtik biyoışıldama, daha önce beyinde de gösterildiği gibifareler 12 prion ile enfekte. Bizim ellerde bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) başkaları 13 tarafından gösterildiği gibi fareler yaşı 23 aya kadar hastalık olmadı. Beyinlerinde patolojisi ve Tg omurilik ile intraglossal ya da intraperitoneal yol kaynaklı nörolojik hastalık ile insan alfa-sinüklein fibrillerinin bir tek bir enjeksiyonu: hipotezi destekleyen farelerde (+/- M83 +/- GFAP -Luc) alfa-sinüklein prionoids prionların 14 ile önemli özellikleri paylaşır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

hayvanlar dahil tüm işlemler Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet Çevre Ajansı (LANUV) hayvan koruma komitesi onayı ile gerçekleştirildi. Hayvanlar konuldu ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde ve yiyecek ve suya serbest erişim ile standart koşullara göre bakım.

1. Hayvan Modeli

  1. Çaprazlamak hemizigot Tg (GFAP -Luc +/-) hemizigot bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) oluşturmak için hemizigot Tg (M83 +/-) fareler ile farelerinde 15, 16.
  2. Ateşböceği lusiferaz 12, 17 için transgen kodlayan insan alfa-sinüklein ve standart PCR ile varlığı için, gerçek zamanlı PCR ile soy bir genotip.
  3. Altı-sekiz haftalık bir yaşta hayvanları aşılamak.

2. Aşı hazırlanması

  1. mo hazırlayınolduğu gibi 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) içinde 150 mM NaCl içeren Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) tampon içinde A53T mutasyonu ile nomeric rekombinant insan alfa-sinüklein, daha önce 14 tarif.
  2. 800 rpm ve 5 gün boyunca 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı içinde monomerik rekombinant insan alfa-sinüklein 3 ug / uL çalkalanması suretiyle aşıları için fibril alfa-sinükleinin hazırlayın.
  3. intraglossal aşılar için intraperitoneal ya da 2 ug / uL için 1 ug / uL nihai konsantrasyona ulaşmak için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde fibril montajları seyreltin.
  4. Buz üzerinde (her bir darbe ve% 50 olarak belirlenmiş bir genliği arasındaki bir saniyelik bir ara ile 0.5 s süresi 40 darbeleri) 1 dakika boyunca çubuk sonikatör ile alfa-sinüklein fibriller parçası. Çapraz tohumlama ile kirlenmesini önlemek için. Farklı inokülumu hazırlamak için temiz sonication sondalar kullanın.

3. Intraglossal Enjeksiyonlar

  1. Bir intrape hayvanlara anestezi100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin ritoneal enjeksiyonu. hayvanın ayak sıkıştırın ve uygun anestezi sağlamak için elinden hindlimb çekilme olmadığını teyit etmektedir. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri veteriner merhem kullanın.
  2. dikkatle araştırmacı doğru bakan başlarını dorsal yatar konumda bir ısıtıcı plaka üzerine yapıştırıcı bant ile narkotize hayvanlar sabitleyin.
  3. ultrasonik titreşim alfa-sinüklein liflerin veya PBS 5 uL 27 G tek kullanımlık deri altı şırınga doldurun.
  4. hayvanın ağzı açık tutmak için tırtıklı ipuçları ile bir küt burunlu başparmak forseps kullanın ve forseps daha küçük olan ikinci çifti dikkatle enjeksiyon için dilin alt tarafı erişilebilir hale getirmek dilini dışarı çekmek için.
  5. Hipoglossal sinire yakın dilin sağ veya sol alt tarafına şırınganın iğnesini enjekte edin. Yavaşça 5 sn sonra inokulum enjekte edin. Yavaşça inokulum sağlamak için 5 sn sonra iğneyi geri çekindoku nüfuz etmiş ve geri çekilmeden iğne olurken kayıp değildir.
  6. onun tespitlerinin gelen hayvan bırakın ve tam iyileşme kadar sürekli izleme altında ısıtma plakası üzerinde bırakın.

4. intraperitoneal enjeksiyonları

  1. periton içine enjeksiyonlar için, 2 L / dakikalık bir akış oranı ve% 2 olarak ayarlanır buharlaştırıcı kullanılarak izofluran / oksijen ile soluma yoluyla bir anestezi bölmesi içerisinde kısa bir süre hayvanlar uyuşturuyorsun. hayvanın ayak sıkıştırın ve uygun anestezi sağlamak için elinden hindlimb çekilme olmadığını teyit etmektedir.
  2. ultrasonik titreşim alfa-sinüklein, fibrillerin ya da PBS, 50 uL, 27 G tek kullanımlık deri altı şırınga doldurun.
  3. Doğrudan fare periton içine enjekte ve araştırmacı uzağa bakan kafası olan bir sırt pozisyonda hayvan tutma ve aşağı doğru yaklaşık 45 ° ile karın duvarının arkasına yerleştirilmiş, ince bağırsağa veya çekum nüfuz kaçının. , tamamen iyileşene kadar hayvan izleyinanesteziden.

5. Biyoparlaklık Görüntüleme

  1. Resim Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) farelerde bir biyoışıldama görüntüleme sistemi kullanılarak her 2-4 haftada bir.
  2. kısa bir süre görüntüleme 2 L / dk'lık bir akış oranı ve% 2 olarak ayarlanmış buharlaştırıcı ile izofluran / oksijen bölmesi içinde fareler anestezi önce. hayvanın ayak sıkıştırın ve uygun anestezi sağlamak için elinden hindlimb çekilme olmadığını teyit etmektedir.
  3. Tıraş ve tüy dökücü bir kremle farelerin başları atmaktadır. spesifik olmayan biyoluminesansının engellemek için bir tahriş işaretleyici ile siyah kulaklarını renklendirin.
  4. 30 mg / mL stok solüsyonu PBS içinde D-lusiferin potasyum tuzu, lusiferaz alt-tabakanın, seyreltin. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler bu saklayın. ışığa maruz çözülmüş D-lusiferin koruyun.
  5. enjeksiyondan önce hayvanlar tartılır. 150 mg / kg vücut ağırlığı, enjeksiyon için, D-luciferase tam hacmi hesaplayın. İntraperitoneal D enjekte-luciferin ve anestezi bölmesi hayvan dönün.
  6. görüntüleme yazılımını başlatın. görüntüleme sistemi ulaşmıştır sonra onun çalışma sıcaklığı kontrol panelinde 'Initialize' düğmesine tıklayarak sistemini başlatın.
  7. düğmeleri 'Luminescent' ve 'fotoğrafı seçin. 60 sn, 'Orta', F / Stop '1' e binning ve 'Kapalı' EM kazanç pozlama süresini ayarlayın.
  8. uyarma filtresi 'Aç' için 'Blok' ve emisyon filtresine ayarlandığını doğrulayın ve 1.50 cm tabi yüksekliğini ayarlayın.
  9. On dakika D-lusiferin ile enjeksiyondan sonra, görüntüleme odasında ısıtma plakası üzerine, hayvanları ve Ağızlıklar doğru anestezi çıkışına yerleştirilmiş olduğundan emin olun. inhalasyon odasından izofluran / oksijen akışı kapatın ve 0.25 L / dk'lık bir akış oranı ve% 2'lik bir buharlaştırma ile görüntüleme bölmesi için akış açın. görüntüleme odasının pr kapağını kapatınoperly.
  10. 60 s sürer ışıldaması, ölçmek için 'Acquire' butonuna tıklayın. izofluran akışını durdurun ve onlar tamamen kendi kafeslerine geri döndükten sonra iyileşene kadar hayvanları izlemek.
  11. biyoluminesansının ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanın. 'Araç Paleti' içinde 'ROI Araçlar' ı seçin. YG Araçları 'içinde 'Türü' altında 'Ölçüm YG'yi' seçin.
  12. YG Araçları 'kapsamında "daire" aracını tıklayın ve açılan menüden çizmek ROI sayısını seçmek - ideal olarak '3' üç fareler için.
  13. resimde, her bir ilgi ve altındaki 'Özellikleri' 1.25 cm genişliği ve yüksekliği ayarlamak sağ tıklayın. ölçülür beyin alanı üzerinde her bir YG yerleştirin.
  14. Resmin sol üst olarak, '(fotonlar)' için birim paneli ayarlayın.
  15. 'Araç Paleti' içinde, seçin 'Görüntü ayarla' ve minimum ayarlamak ve0.20e6 den 1.00e6 için örneğin 'Renk Ölçeği', maksimum.
  16. 'Dosya' altında 'Kaydet' ile verileri kaydetmek.

6. Biyokimyasal Analizi

  1. Standart prosedürlere 18, 19 uygun olarak beyin ve omurilik izole edin.
  2. bir doku homojenleştirici 6000 rpm'de iki 30 döngüleri (PBS 1x seyreltilmiş) proteaz ve fosfataz inhibitörleri varlığında ayrı PBS içinde bütün beyin ve bütün omurilik örnekleri homojenize. beyin ve omurilik numuneleri% 20 (ağırlık / hacim) bir son konsantrasyona kadar homojenize emin olun.
  3. 10 s sabit bir nabız ve% 50 olarak ayarlanır, bir genlik ile buz üzerinde tutarken, iki kez numune sonikasyon.
  4. PBS içinde 1.5 M NaCl ile 1: olanağına 1 seyreltilerek PBS ve 750 mM NaCl içinde% 10 homojenatları ayarlayın.
  5. hücre tortularım ayırmak için, 5 dk için 1000 x g'de santrifüj homojenatları4 ° C. Bir sonraki adımlar için süpernatantlar tutun ve granül atın.
  6. üreticinin talimatlarına uygun olarak bisinkoninik asit (BCA) deneyi kullanılarak homojenatlarda protein konsantrasyonu ölçülür. Buz üzerinde 15 dakika süre ile,% 10 (ağırlık / hacim) içindeki bir nihai konsantrasyonda, N-laurylsarcosyl omurilik homojenatlarında homojenleştirilmiş beyinlerinden toplam proteinin 1.0 mg ya da 0.8 mg inkübe edin.
  7. damıtılmış su içinde% 10 (ağırlık / hacim) içindeki bir 3 ml sakroz yastığı üzerine homojenatları Yerleşimi ve 4 ° C 'de 1 saat boyunca 465,000 x g'de bunları ultrasantrifüj.
  8. % 4 sodyum dodesil sülfat (SDS),% 2 β-merkaptoetanol, 192 mM glisin, 25 mM Tris ve% 5 (ağırlık / hacim) sukroz içeren bir tampon içinde yeniden süspanse peletler.
  9. 5 dakika boyunca 100 ° C'de örnekleri kaynatın ve morpholineethanesulfonic asit (MES), tampon sisteminde elektroforez için SDS-poliakrilamit jeller üzerine yerleştirin.
  10. Bir sem ayrılan poliviniliden diflorit proteinler (PVDF) zarlara aktarmablot sistemi idry.
  11. Çapraz bağlantı 35 rpm'lik bir rotor üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS (hacim / hacim) formalin çözeltisi membran proteinleri% 0.4 membranları inkübe edin.
  12. % 0.05 (hacim / hacim) içeren TBS tamponu Tween 20 ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 (ağırlık / hacim) süt membranları bloke eder.
  13. 4 ° C'de gece boyunca bloke edici tampon içinde primer antikor ile blot inkübe edin.
  14. TBS tampon membranlar üç kez yıkanır ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS içinde peroksidaz ya da florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
  15. Kurulu protokollere 20'ye göre kimyasal ışıldama veya floresan ile bağlı sekonder antikor görselleştirmek.

7. immünofloresan analizi

  1. bir doku işleme istasyonunda disseke beyinleri ve omurilik Kurut ve bir parafin istasyonunu kullanarak parafin içine gömmek.
  2. parafine gömülü tis Kesme8 mikron kalınlığında koronal bölümlerde bir mikrotom ile dava açar ve lamlar üzerine bölümler monte edin.
  3. 5 ila 10 dakika için iki ayrı ksilol banyolarında enkübe edilerek doku bölümleri deparafınize ve dereceli etanol banyoları (100,% 90,% 70,% 50,%) bir dizi ve son olarak da H2O ile rehidrate
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.01 M sitrat tampon maddesi (pH 6.0) bölümleri inkübe ve buna ek olarak bir mikrodalga fırın içinde 10 dakika boyunca kaynatın.
  5. kesitleri oda sıcaklığına kadar soğuması ve endojen peroksidazlar inhibe 30 dakika süreyle% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile inkübe edin.
  6. % 20 (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 1 (hacim / hacim) sığır serum albümini (BSA) ve% 0.5 Triton X-100, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde ile kuluçkalama ile doku bölümleri bloke eder.
  7. % 1 (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 1 (hacim / hacim) BSA ve% 0.25 Triton, PBS içinde X-100, gece boyunca 4 ° C'de seyreltilmiş primer antikor ile bölümleri inkübe edin.
  8. % 0.25 (hacim / hacim) Triton X-100, PBS içinde bir kez PBS ile iki kez bölümleri yıkayın.
  9. karşılık gelen fluorofor-konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 seyreltilmiş nükleer boya DAPI (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 1 (hacim / hacim) BSA ve PBS bölümleri leke.
  10. % 0.25 (hacim / hacim) Triton X-100, PBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkandıktan sonra, gömme ortamı ile slaytlar lamel ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile boyama görselleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fareler (Tablo 1 ve Şekil 1): dil ya da bigenic Tg CNS (GFAP -Luc +/- M83 +/-) içerisinde periton neden nöropatoloji ile alfa-sinüklein prionoids periferik enjeksiyonu. alfa-sinüklein fibrillerinin ile tek bir entraperitoneal enjeksiyon sonrasında beş fareden oluşan dört 229 ± 17 günlük bir ortalama kuluçka süresi ile nörolojik hastalık geliştirdi. Şaşırtıcı bir şekilde, sadece, bir ila beş arasında fareler, 285 gün sonra, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) periton içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon farenin sinükleinopatilerin önemli özelliklerini özetlemek için nöro eşlik nörolojik hastalık oluşturmak için, basit bir yöntemi temsil eder. Benzer bir şekilde, dil enjeksiyon transgenik farelerde alfa-sinüklein prionoids ile neuroinvasion için başka bir yol tasvir eder fakat daha az etkilidir. Biz enjeksiyon sonrası 420 gün bizim deneyler sonlandırmak için seçti ve biz daha fazla veya kökcük enjekt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar Olga Sharma, Theresa Hundt ve teknik destek için DZNE mikroskopi ve hayvan tesislerinin çalışanlarına teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti-aktin antikoruMerck MilliporeMAB1501
anti-alfa-sinüklein, fosfo S129 antikoru [pSyn#64]Wako015-25191
anti-alfa-sinüklein, fosfo S129 antikoru [EP1536Y]Abcamab51253
anti-GFAP antikoruDakoZ0334 01
anti-IBA-1 antikoruWako019-19741
anti-Sequestosome-1 (p62) antikoruProteintech18420-1-AP
anti-ubikitin antikoru [Ubi-1]Merck MilliporeMAB1510
Fosfat tamponlu salin (PBS)İnvitrojen14190169
Ketamin Ratiopharm100 mg / kg
KsilazinRatiopharm10 mg / kg
27 G şırıngaVWR613-4900
İzofluran ve nbsp;Piramal HealthcarePZN  4831850
Tüy dökücü kremVeet
Secureline laboratuvar kalemi Neolab25040
D-lusiferin potasyum tuzuAcrisLK1000030 mg/mL stok çözeltisi
ThermomixerEppendorf5776671
Sonopuls Mini20 sonikatörBandelin3648
IVIS Lumina II görüntüleme sistemiPerkinElmer
Living Image 3.0 YazılımıPerkinElmer
Tg(M83+/- ) fareler veya B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J farelerJackson Laboratuvarı004479
Standart model forsepsGüzel Bilim Araçları11000-16
Dar model forsepsGüzel Bilim Araçları11002-12
N-laurylasarkosilSigmaL5125-100G
Optima Max-XP ultrasantrifüj ve nbsp;Beckman CoulterTLA-110 rotor 
Kalın duvarlı polikarbonat tüplerBeckman Coulter362305
NuPAG Novex %4-12 Bis-Tris Midi Protein JelleriThermo Fisher ScientificWG1401BOX
HRP konjuge antikorCaymanCay10004301-1
IR Boya 680 konjuge antikor LI-COR Biosciences926-68070
SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli SubstratThermo Fisher Scientific34075
Stella 3200 görüntüleme sistemiRaytest
Odyssey kızılötesi görüntüleme sistemi ve nbsp;LI-COR Biosciences
Tween 20 MP BiyomedikalTWEEN201
Triton X-100SigmaSA / T8787
Immobilon-FL PVDF membranMerck MilliporeIPFL00010
XylolSigmaRoth
Hidrojen peroksitSigmaSA / 00216763/000500çalışma çözeltisi
% 3 Sığır serum albümini (BSA)  Thermo Fisher ScientificA3294-100G
Keçi serumuThermo Fisher ScientificPCN5000
4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306çalışma seyreltmesi 1:50.000
Floromount ortamı OmnilabSA/F4680/000025
LSM700 konfokal lazer tarama mikroskobuCarl Zeiss
HALT proteaz ve fosfataz inhibitörleriThermo Fisher Scientific 
Precellys 24-Çift Homojenizatör Peqlab91-PCS24D
Alexa Fluor 488 konjuge antikorThermo Fisher ScientificA31619
Alexa Fluor 594 konjuge antikorThermo Fisher ScientificA11005
Pierce  BCA  Protein  Tahlil  KitThermo Fisher Scientific10741395
Mikrotom RM2255Leica
LSM700 konfokal lazer tarama mikroskobuCarl Zeiss
10516495

Kaynaklar

  1. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  2. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
  3. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  4. Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
  5. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
  6. Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  8. Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
  10. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  11. Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
  12. Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
  13. Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
  14. Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
  15. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  16. Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
  17. Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).
  18. Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
  19. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
  20. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  21. Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891(2016).
  22. Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
  23. Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  24. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
  25. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
  26. Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).
  27. Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N roinflamasyon zlemeTransgenik Fare ModeliPeriferik EnjeksiyonMSS N roinflamasyonuGFAP Lusiferaz Raporerintraperitoneal Enjeksiyonntraglossal EnjeksiyonParkinson Hastal Modeli
Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.