Method Article

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

DOI:

10.3791/55505

⸱

June 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sıçan peritoneal membranda mikroRNA ekspresyonunun saptanması için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çeşitli patolojik koşullardaki sıçan peritoneal membrandaki mikroRNA ekspresyon profilini incelemek için uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro RNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyonel olarak haberci RNA ekspresyonunu düzenleyen küçük kod çözücü olmayan RNA'lardır. Sıçanlardaki çeşitli organ ve dokulardaki miRNA ekspresyon profili araştırılmıştır. Bununla birlikte, miRNA'ların saflaştırılması ve fare peritoneal membrandaki ekspresyonlarının saptanması için standart yöntemler iyi belirlenmemiştir. Rat peritoneal membranda kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak miRNA'ları arındırmak ve ölçmek için etkili ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokol dört aşamadan oluşur: 1) peritoneal membran numunesinin saflaştırılması; 2) peritoneal membran örneğinden miRNA da dahil olmak üzere toplam RNA'nın saflaştırılması; 3) cDNA üretmek için miRNA'nın ters transkripsiyonu; Ve 4) miRNA ekspresyonunu saptamak için qRT-PCR. Bu protokolü kullanarak altı miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 ve miRNA-34a-5p) ekspresyonunun arttığını başarıyla tespit ettikSıçan peritoneal fibroz modelinin peritoneal zarında kontrol gruplarına kıyasla belirgin olarak anlamlı bir farklılık göstermedi. Bu protokol, birçok patolojik koşulda sıçanların peritoneal zarındaki miRNA ekspresyon profilini incelemek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro RNA'lar (miRNA'lar), haberci RNA (mRNA) ekspresyonunu transkripsiyonel olarak düzenleyen kısa, kodlamayan RNA'lardır. MiRNA'ların ekspresyonundaki değişiklikler, kanser, inflamasyon, metabolik bozukluklar ve fibroz 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarda önemli rol oynayan birçok mRNA'nın ekspresyonunu düzenler. Bu nedenle, miRNA'lar yeni biyolojik belirteçler ve terapötik he....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etiği komitesi tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuar Hayvanları Kılavuzu'ndan Deneysel Hayvanlar Kullanımının ve Bakımının yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Periton Numune Toplama

  1. Aşağıdaki maddeleri toplayın: İzofluran, mantar levha, fosfat tamponlu salin (PBS) ile petri kabı, cerrahi makas ve forseps ile ıslatılmış pamuklu 50 mL santrifüj tüpü.
  2. Bir isofluoran doz aşımı ile bir sıçanı euthanize, daha sonra% 70 etanol ile sıçanın karın cildi püskürtülür ve sığır onun sırtında mantar levha üzerine monte edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan sonuçlar daha önce bildirilen çalışmamıza 8 dayanır. Peritoneal fibrozda miRNA ekspresyon profilini araştırdık. Peritoneal fibroz peritoneal diyalizde önemli bir komplikasyondur. Mezotel hücre tek tabaka kaybı ve aşırı hücre birimi matris bileşenleri birikimi ile karakterizedir ve peritoneal membran başarısızlığı 14 , 15 ile ilişkilidir. Peritoneal bir fibrozis sıçan modeli, 5 dakika için 10.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazmasında sunulan protokol kullanılarak sıçan peritoneal zardaki miRNA'lar başarılı bir şekilde saflaştırıldı ve qRT-PCR kullanılarak tespit edildi. QRT-PCR veri analizinin güvenilirliği, saflaştırılmış miRNA'ların kalitesine bağlıdır. Dolayısıyla, miRNA'ların saflığı, bir spektrofotometre kullanılarak ölçülebilen 260 nm'de absorbansa 280 nm'de absorbansa oranla qRT-PCR'den önce kontrol edilebilir. MiRNA'nın anlamlı amplifikasyonu qRT-PCR kullanılarak elde edilemediğinde, şablon cDNA k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışmalarının olmadığını açıkladılar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mükemmel teknik desteği için Miyako Shigeta'ya teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI tarafından desteklenmiştir (hibe numarası 25461252).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
QIA parçalayıcıQiagen79654mikro santrifüj spin-kolon
miRNeasy Mini kitQiagen217004silika membran bazlı spin kolon
QIAzol Lizis ReaktifiQiagen79306fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi
Tampon RLTQiagen79216yıkama tamponu 1
Tampon RWTQiagen1067933yıkama tamponu 2
miScript II RT kiti Qiagen21816110 kez içerir; Deoksinükleotidler, ribonükleotid trifosfatlar ve oligo-dT primerleri içeren Nükleik Karışımı; poli(A) polimeraz ve ters transkriptaz içeren miScript Ters Transkriptaz Karışımı ve; miScript HiSpec arabelleği
miScript SYBR Green PCR kitiQiagen218073QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix ve miScript Universal Primer
RNU6-2 astar içerir.  QiagenMS00033740açıklanmadı
miRNA-142-3p primerQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'   
miRNA-21-5p astarQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
primerQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
astarQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
astarQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
astarQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'MicroAmp
qRT-PCRThermo Fisher Scientific4316813plakası 96 kuyulu reaksiyon plakası
MicroAmp Optik Yapışkan Film Thermo Fisher Scientific431197196 oyuklu reaksiyon plakası için yapışkan film
QuantStudio 12K Flex Flex Gerçek Zamanlı PCR sistemiThermo Fisher Scientific4472380gerçek zamanlı PCR cihazı
QuantStudio 12K Flex Yazılım sürümü 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380gerçek zamanlı PCR cihaz yazılımı
metilglioksalSigma-AldrichM0252
MidpericTerumoatanmaz Periton diyaliz sıvısı
Sprague– Dawley sıçanlarıSLCatanmadı 
, için optik 96 kuyulu reaksiyon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Back....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MicroRNA ExpressionQuantitative Real time PCRPeritoneal MembraneRNA PurificationReverse TranscriptionmiRNA DetectionPeritoneal FibrosisRat ModelTotal RNA IsolationqRT PCR Protocol

Related Articles