Yöntem makalesi

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

DOI:

10.3791/55514

⸱

9 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University, 2Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, memeli hücrelerinde G-protein kenetli reseptör (GPCR) içselleştirmenin konfokal mikroskopi bağlanmasını anlatır. Temel hücre kültürü, transfeksiyon, ve konfokal mikroskopi prosedürü içeren füzyon ifade GPCR hücre içi lokalizasyonu ve içselleşmesini tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), yüksek kontrastlı görüntüleme için optik bir görüntüleme tekniğidir. Yeşil floresan proteini (GFP) gibi floresan füzyon proteinlerini ekspresyonlarını, lokalizasyonlarını ve işlevlerini belirlemek için görselleştirmek güçlü bir yaklaşımdır. Hedef proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, tanımlama, karakterizasyon ve fonksiyonel analizler için önemlidir. İçselleştirme, uyaranlara uygun hücresel yanıtları sağlamak için G proteinine bağlı reseptör (GPCR) sinyalini kontrol eden baskın mekanizmalardan biridir. Burada, HEK293 hücrelerinde GPCR'nin hücre altı lokalizasyonunu ve içselleştirilmesini konfokal mikroskopi ile tespit etmek için deneysel bir yöntem tanımlanmıştır. Ek olarak, bu deney hücre kültürü ve transfeksiyon hakkında bazı ayrıntılar sağlar. Bu protokol, yaygın olarak bulunan çeşitli floresan markörlerle uyumludur ve proteinlerin çoğunun hücre altı lokalizasyonunun yanı sıra GPCR'nin içselleştirilmesinin görselleştirilmesi için de geçerlidir. Bu teknik, araştırmacıların memeli hücre dizilerinde GPCR gen ekspresyonunu verimli bir şekilde manipüle etmelerini sağlamalı ve GPCR hücre altı lokalizasyonu ve içselleştirilmesi üzerine çalışmaları kolaylaştırmalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler taşımak için yük trafik mekanizmalara sahip hücre dışı malzemeler-tür ligandlar, mikroorganizmalar, besin ve zar-ötesi proteinden-bir bilgi, enerji ve diğer amaçlar 1, 2 hücre olarak. Hücresel homeostazı, doku işlevinin ve genel hücrenin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Floresan füzyon proteinlerinin hücre bazlı ekspresyon yolları 3 sinyal lokalizasyonu ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR), transmembran reseptörleri, internalizasyonunu incelemek için etkili bir yoldur.

Doğrudan floresans saptama teknikleri ile bir arada Aequorea vic....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Hazırlanması

  1. Hücre kurtarma
    1. 37 ° C su banyosu için bir sıvı azot tankından dondurularak korunmuş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreler aktarın ve 1 sürekli çalkalama - 2 dakika.
    2. 10 cm'lik bir hücre kültür tabağına dengelenmiş büyüme ortamı 10 mL (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu) eklenir. Yavaşça dengelenmiş bir büyüme ortamına çözülmüş hücrelere ilave edin.
    3. 4 saat - 2% 95 hava ve% 5 CO2 içeren bir nemlendirilmiş atmosfer ile 37 ° C bir su ceketli CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, bir eş odaklı mikroskop sisteminin bir örneğini göstermektedir. Şekil 2, HEK293 hücrelerinde pEGFP-N1 ekspresyonunu göstermektedir. GFP sinyali sitoplazma ile çekirdek saptandı. Şekil 3, daha önce yayınlanmış sonuçlar 15 ile uyumlu HEK293 hücrelerinde S. japonica gelen GnRHR hücre içi lokalizasyonu göstermektedir. Zaman CLSM altında Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) C-termininde EGFP eti.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol HEK293 hücrelerinde hücre içi lokalizasyonu ve eksprese GPCR füzyon proteininin internalizasyonunu tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Teknik kolayca HEK293 ve BMN hücreleri 16 Bombyx mori kaynaklı corazonin reseptörünün hücresel yerini ve internalizasyon için birçok farklı gen ve hücre tipleri için uyarlanabilir.

Bu güçlü testin başarılı uygulama birkaç anahtar faktöre dayanır. Önemlisi verimli transfeks.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin yazarları, teknik yardım ve ekipman kullanımı için Prof. Jiayan Xie'ye teşekkür eder. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41406137) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HEK293 hücre hattı 
DMEM / Yüksek glikozHiklonSH30022.01Yüksek glikoz 4.0 mM L-glutamin
Fetal Sığır Serumu (FBS)PuFei1101-100
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)GenomuGNM10010
Penisilin-StreptomisinGenomuGNM15140
%0.25 Tripsin ve %0.02 EDTAGenomu
Opti-MEM (1x)GIBCO, Life Technologies tarafından31985-062azaltılmış serum ortamı
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiInvitrogen11668027Reaktif 1
X-tremeGENE HP DNA Transfeksiyon ReaktifiRoche6366236001Reaktif 2
DAPI Boyama ÇözeltisiBeyotimeC1006
DiIBeyotimeC1036
Antifade Montaj OrtamıBeyotimeP0126
ParaformaldehitSinopharm Kimyasal Reaktif Co.(SCRC)80096618
100 mm hücre kültürüCORNING430167
6 oyuklu plaka ExCell BioCS016-0092
12 oyuklu plaka ExCell BioCS016-0093
Kapak CamıNEST801007
Mikroskop SlaytlarıCitoglas10127105P-G
Termo Bilimsel Forma CO2 İnkübatörThermo3111
TCS SP5II lazer taramalı konfokal mikroskopLeica 
GNM252005100001311

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
  2. Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
  3. Kallal, L., Benovic, J. L.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GPCR selle mesiHEK293 H creleriH cre TransfeksiyonuFloresan F zyon ProteinleriH cresel Alt LokalizasyonLigand UygulamasMikroskopi G r nt lemeProtein EkspresyonuH cre K lt r

İlgili makaleler