Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Özet

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Özet

Embriyonik kök hücreler (ESC'ler), kendi kendini yenileyebilir veya pluripotency olarak bilinen bir fenomen olan tüm hücre tiplerine farklılaşabilir. Belirgin pluripotent durumlar "naif" ve "astarlanmış" pluripotency olarak adlandırılmıştır. Saf önlemli geçişi kontrol altına alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, kinetik fonksiyonu araştırmak için yüksek kaliteli alet bileşiklerinin mevcudiyetinin artmasına rağmen, naif ve başlangıçlı pluripotent durumları belirten protein kinazlar hakkında kötü bilgi sahibiyiz. Burada, fare ESC'lerindeki naif başlatılmış pluripotent geçişin kinaz düzenleyicileri için hedeflenmiş küçük moleküler ekranlar gerçekleştirmek için ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, basit hücre kültürü koşullarını ve standart reaktifleri, materyalleri ve ekipmanı kullanarak, pluripotens üzerine şimdiye dek değinilmemiş etkileri olan kinaz inhibitörlerini açığa çıkarır ve onaylar. Bu teknolojinin potansiyel uygulamalarını tartışıyoruz, diğer küçük moleküllerin taranması da dahilGiderek sofistike kinaz inhibitörleri ve ortaya çıkan epigenetik araç bileşiklerinin kütüphaneleri gibi koleksiyonlar.

Giriş

Embriyonik kök hücreler (ESC'ler), pluripotens ¹ olarak bilinen bir fenomen olan yetişkin vücuttaki herhangi bir hücre türüne kendi kendine yenilenme veya ayırma kapasitesine sahiptir. Yeni kanıtlar, "naif" ve "astarlanmış" pluripotency olarak adlandırılan, gelişimsel olarak farklı pluripotent durumların var olduğunu ortaya koymaktadır. Naif ESCler, preimplantasyon embriyo 3'dekine benzer bir gelişim halini temsil eder. Buna karşın, başlatılmış pluripotent ESC'ler pluripotency'den çıkmak ve özelleştirilmiş embriyonik soylara ayırmak için hazırlanırlar ^{4 , 5} .

Naive ve primer pluripotent devletler ayrı gen düzenleyici ağlarla işaretlenir. Naif pluripotik, Nanog, Krueppel benzeri transkripsiyon faktörleri (Klfs), Rex1 ² ve Esrrb gibi anahtar pluripotens transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonuyla karakterizedir 6. Fare ESC'lerde (mESC'ler), başlangıçtaki pluripotens, naif belirteçlerin azaltılmış ifadesi ve de novo DNA metil transferaz Dnmt3b'yi içeren spesifik bir gen ekspresyon imza ile karakterize edilir ⁷ . In vivo , primer pluripotent implant sonrası epiblast kök hücreleri (EpiSCs) ^{4 , 5} ek olarak Epiblast markörü Fgf5'i ve Brachyury ⁸ gibi soy primingin belirteçlerini ifade eder.

MESC'ler , in vitro saf ön provizyonlu pluripotent geçişleri kontrol eden prob mekanizmalarına uygulanabilir bir model sağlar. Lösemi inhibitör faktör (LIF) ve fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlendiğinde, mESC'ler saf ve başlangıçlı pluripotent durumlar arasında dinamik geçiş yapar ^{9 , 10} . Naif bir gen düzenleyici ağı teşvik etmek için LIF-Jak-Stat3 sinyalizasyon işlevleri ¹¹ 12'ye geçişi sağlar. Bununla birlikte, protein kinazların farklı pluripotent durumların belirlenmesindeki rolünü sistematik olarak değerlendirmek de bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük moleküler elekleri gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Basit parazit mukavemeti stabilize etme yeteneği ile kinaz inhibitörlerini ortaya çıkarmak ve doğrulamak için basit mESC kültür koşullarını ve standart reaktifleri, malzemeleri ve ekipmanları kullanırız. Ayrıca, epigenetik düzenleyicileri hedef alan gelişmekte olan inhibitör kütüphaneleri gibi diğer küçük molekül koleksiyonlarının taranması da dahil olmak üzere, bu teknoloji için potansiyel genişletilmiş uygulamaları tartışıyoruz.

Protokol

1. Küçük Molekül Kinaz İnhibitör Kütüphanelerinin Harmanlanması

1. Herkes tarafından erişilebilen kinaz inhibitör koleksiyonlarından elde edilen harmanlama inhibitörü kütüphaneleri, örneğin 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörlerinden (http://lincs.hms.harvard.edu) oluşan bir koleksiyon olan Harvard Medical School'tan Entegre Ağa Dayalı Hücresel İmzalar Kütüphanesi (LINCS) Ve endüstriyel araştırmacılar tarafından bir araya getirilen 376 bileşik koleksiyonu olan Protein Kinaz İnhibitör Seti (PKIS) (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ bulunmaktadır. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen bileşiklerden bir ısmarlama kinaz önleyici koleksiyonu monte edin.
   NOT: Laboratuarımızda, hepsi ticari kaynaklardan temin edilebilen 51 primer hedef kinazı kapsayan 72 güçlü ve seçici takım kinaz inhibitörü topluluğunu bir araya getirdik.
2. Birden fazla konsantrasyonda optimum yüksek verimli işleme için kinaz inhibitörlerini 96 oyuklu plakalar halinde bir araya getirin (kullanım 1, 0.1 aNd 0.01 mM). Her bir plakaya sırasıyla saf DMSO içeren referans plakaları ve sırasıyla naif ve primer pluripotent durumu teşvik ettiği bilinen referans kontrol inhibitörleri PD173074 (FGFRi) ve Ruxolitinib'i (JAKi) ekleyin. Elektronik tablo veya benzeri bir yazılımda açıklama yapın.

2. MESC Kültür Hazırlama Şartları ve Prosedürleri

1. 10 cm tabaklara% 0.1 (w / v) jelatin 5 ml ekleyerek% 0.1 jelatin kaplı 10 cm yemekleri hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Jelatı alın ve 2 dakika boyunca tabağı kurumaya bırakın.
2. 100 ng / mL GST-LIF,% 10 Fetal Buzağı Serum ve% 5 Nakavt Serumu içeren standart mESC ortamında (bkz. Malzeme Tablosu )% 0.1 jelatin kaplı 10 cm bulaşıkların 37 ° C'lik% 5 CO _2'de herhangi bir standart mESC hattını kültürleyin Değiştirme. Her geçen gün medyayı değiştirin ve her iki günde bir% 80 konfluenasyondaki MESC'leri 1: 5-1: 10'luk bir seyreltme ile geçirin.
3. MESC'leri geçmek için, ortamı aspire edin ve 5 mL o ile yıkayın.F fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır.
4. MESC plakası başına 1 mL tripsin-EDTA (% 0.05 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA) ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
5. 4 mL'lik mESC medyumunda tripsinize edilmiş hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 5 dakika süreyle 1,200 rpm'de santrifüjleyin.
6. Tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yukarı ve aşağı pipetleme, 5 mL'lik mESC ortamı içinde hücre topağını iyice süspanse edin.
7. 10 mcL hücre süspansiyonu ve 10 mcL Trypan Mavisi (% 0.4) birleştirerek hücreleri sayın. Bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskopu kullanın.
8. Çok kanallı bir pipet kullanarak% 0.1 jelatin kaplı 96 gözlü plakalara, son hacimde 100 uL medyaya 3 x 10 ³ mESC tohumlayın.
9. Bir çok kanallı pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini 1: 100 seyreltmede (1 uL inhibitör 100 uL medyaya ilave edilir) uygulayın. İnhibitör ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için hafifçe pipetle sıkıştırın, daha sonra eşit dağılımı sağlamak için 1 saat boyunca hücrelerin bir doku kültürü kapağına yerleşmesine izin verin.Kaplama yüzeyi. Medyayı değiştirmeden 48 saat boyunca kültür hücreleri.
   NOT: 1 / 0.1 / 0.01 mM stok plakaları, sırasıyla 10/1 / 0.1 μM son bir inhibitör konsantrasyonu verecektir. Hedef dışı etkileri en aza indirirken birincil hedef kinazların etkin bir şekilde inhibe edilmesini sağlamak için, ekranı 1 μM son konsantrasyonda başlatmanızı öneririz.

3. Kinaz İnhibitör Tarama Analizi

1. Çok kanallı aspiratör ve pipetleri kullanarak 200 mcL PBS'de 96 oyuklu mESC plakalarını yıkayın.
2. 150 μL liziz tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40 (v / v),% 0.5 sodyum deoksikolat (w / v), 10 mM β-gliserofosfat , 10 mM sodyum pirofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3V04, Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri).
3. Özleri, V-tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika 1,500 xg'de santrifüjle açıklayın.
4. Bir nitrol üzerine 100 μL süpernatantları hareketsiz hale getirinLüloz membran kullanılarak 96 oyuklu vakum nokta leke manifoldu kullanıldı.
5. Membranı kurutun ve tutarlı transferi sağlamak için 40 mL Ponceau S ile leke uygulayın.
6. Membranı TBST ile yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte bloke edin.
7. Nanog ve Dnmt3b antikorlarında TBST /% 3 (ağırlık / hacim) süt tozu içinde gece boyunca 1: 1000 (v / v) seyreltme ile inkübe edin.
8. Membranları TBST içinde 3 x 10 dakika yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte 1: 10,000 (v / v) seyreltilmiş 30 mL ikincil antikor içerisinde inkübe edin.
9. Dijital immünobotlama görüntüleme sistemi kullanarak geliştirin.
   NOT: Mümkünse, Nanog ve Dnmt3b'yi tespit etmek için kantitatif floresans immünoblotlama kullanın. Bununla birlikte, floresans immünoblotlama ile Dnmt3b için arka plan sinyali çok yüksektir. Bu nedenle, 800 nm floresans anti-tavşan (Nanog) ve anti-fare-HRP (Dnmt3b) sekonder antikorlar kullanılır.

4. Ekran Verilerinin Analizi ve Bona Fide Pluripens Regülatörleri Olarak İnhibitörlerin Validasyonu

NOT: Bu sadece iyi niyetli pluripotens modülatörlerinin tanımlanmasını sağlamak için kritik bir adımdır. Hem Nanog: Dnmt3b oranına, hem de genel sinyal temelli inhibitörlerin, mESC sağkalımını olumsuz yönde etkileyen kinaz inhibitörlerinin daha ileri analiz için seçilmemesini sağlamak için ayrılması zorunludur.

1. İmmünoblot analizi yazılımı kullanarak Nanog ve Dnmt3b sinyalini nicelleştirin ve değerleri bir elektronik tabloya veya benzer bir yazılıma aktarın. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında tüm numuneler için Nanog: Dnmt3b oranını hesaplayın. Ayrıca, kinaz inhibitörlerinin, mESC canlılığını değiştirerek Nanog: Dnmt3b oranını etkilemediğinden emin olmak için toplam Nanog ve Dnmt3b sinyalini belirleyin.
2. Saf bulleşikliği (Nanog: Kontrolten daha yüksek olan Dnmt3b oranı) ve başlatılmış pluripotansı (Nanog: Dnmt3b oranı kontrolden düşük) teşvik eden inhibitörleri tanımlamak için sıralı Nanog: Dnmt3b oranlarını kullanın. Kontrol değerlerinden 2x sapma değerinde kesme değerini ayarlayın ve toplam Nanog + Dnmt3b sinyali üreten kinaz inhibitörlerini filtreleyinNaif (yüksek Nanog: Dnmt3b oranı) ve astarlanmış (düşük Nanog: Dnmt3b oranı) pluripotent durumları stabilize eden kinaz inhibitörlerinin yüksek bir güven listesinin üretilmesi için DMSO kontrol değerinin% 50'si.
3. 2 mL'lik ortamda 6 kuyucukta 2 x 105 hücreye mESC'leri ekleyerek kinaz inhibitörlerini doğrulayın ve ortam değiştirmeden 48 saat boyunca 1 uM'de kinaz inhibitörleri ekleyin.
4. MESC'leri liziz tamponunda Lyse edin ve geleneksel SDS-PAGE imünoblotlama ile Nanog ve Dnmt3b ekspresyonunu analiz edin.
5. Çabukluğun, 48 saatlik inhibitör tedavisinin ardından muhafaza edildiğinden emin olmak için, Naif pluripotik belirteçler Klf2 ve Klf4 ve Oct4'ün SDS-PAGE immünoblotlaması ile isabetlerini doğrulayın.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedürü kullanarak ( Şekil 1 ), 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörünün LINCS kütüphanesini tarayarak mESC pluripotensini modüle edenleri belirledik. Kütüphane, 1: 100 seyreltme için 0.1 mM konsantrasyonda ve mESC'lerde 1 uM son tarama konsantrasyonunda hazırlanır. 48 saat sonra, mESC'ler parçalandı ve Nanog ve Dnmt3b ifadesinin kantitatif nokta leke analizi için ekstraktlar hazırlandı ( Şekil 2 , üstte). Diğer tarama konsantrasyonlarından elde edilen sonuçlar burada kısalık olarak gösterilmez. Nanog: Dnmt3b oranı her kinaz inhibitörü ve bileşenler için sıralanır ve 2x kesme uygulanır ( Şekil 2 , alt). Kontrolle ilgili toplam Nanog ve Dnmt3b sinyali, inhibitör sıralamasına bindirilir ve önemli mESC toksisitesini gösteren inhibitörlerin triazasyonuna izin vermek için 0.5x kesime tabi tutulur. Safevatı stabilize eden kinaz inhibitörlerini seçinGeleneksel Nanog / Dnmt3b immünoblotlama ( Şekil 3 ) kullanılarak doğrulanır. Bu inhibitörlerin primer kinaz hedefleri Tablo 1'de sunulmuştur. Bu ekranın, astarlanmış hali stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için uygulanabilirliğini de göstermekteyiz ¹⁴ .

Şekil 1: Saf başlangıçlı geçiş modüle eden kinaz inhibitörlerinin taranması için iş akışı. MESC, 1 uM'lik nihai konsantrasyonda bir 228 bileşik kinaz inhibitör kütüphanesi ile muamele edildi. Lizatlar hazırlandı ve immüno nokta-leke analizi için nitroselüloz membranlara aktarıldı ve Nanog ve Dnmt3b seviyeleri belirlendi (Şekil ¹⁴ , Williams ve diğerleri 14'den adapte edildi). Görmek için lütfen buraya tıklayınız. Bu rakamın daha yükseği yok.

Şekil 2: Naive ile hazırlanmış pluripotens ekran analizi ve inhibitör tanımlama. (Üstteki) Temsilci Nanog ve Dnmt3b immüno nokta-lekeli görüntüler. (Alt) Her kinaz inhibitörü için Nanog ve Dnm3b değerleri DMSO kontrolüne göre belirlendi ve Nanog: Dnmt3b oranları ve toplam nispi Nanog + Dnmt3b sinyali belirlendi ve inhibitörler DMSO kontrolüne kıyasla sıralandı. Nanog: Dnmt3b oranını, DMSO kontrolünün üstünde veya altındaki 2 misli eşiğin ötesinde değiştirenlerin, naif veya başlatılmış pluripotensin sürücüleri olduğu tespit edildi. DMSO kontrolünün 2x altında bir eşik değeri, mESC sağkalımını tehdit eden inhibitörlerin triaj edilmesi için ayarlandı. Daha ileri doğrulama için seçilen inhibitörler vurgulanır. (Şekil, Williams ve diğerleri ^{14'den uyarlanmıştır} ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Belirlenen seçilmiş isabet bileşiklerinin doğrulanması. MESC'ler ya 1 uM AZD4547 (seçici bir FGFR önleyicisi) ya da Şekil 2'deki ekrandan belirlenen belirtilen inhibitörler ile muamele edildi. Nanog: Dnmt3b seviyeleri standart SDS-PAGE ve immünoblot analizi ile belirlendi. Göreceli Nanog: Dnmt3b ve Nanog + Dnmt3b'nin sayısal değerleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir ve naif pluripotent durumu stabilize eden inhibitörler yeşil renkte vurgulanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

bileşik	Birincil Hedefler		Diğer Hedefler
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR ve TAO1
GW786034	VEGFR1'inin		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2'dir

Tablo 1: Seçilen isabet bileşikleri ve bunların primer kinaz hedefleri.

Tartışma

Burada, naif başlangıçlı pluripotent geçişin düzenlenmesinde kinaz sinyal yollarının rolünü araştırmak için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojiyi göstermektedir. Bu ESC alanında önemli bir soruyu ele alıyor. Yüksek verimli genomik ve transkriptomik yaklaşımlar, naif ve başlangıçlı pluripotent durumların anahtar transkripsiyonel regülatörlerini tanımlamak için rutin olarak kullanılır, ancak pluripotens sinyal şebekelerini aydınlatmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Şimdi, mESC'lerde naif başlangıçlı pluripotent geçişini kontrol eden kinazları tanımlamak için kimyasal inhibitörleri kullanan esnek bir strateji sunuyoruz. Bu, hücrenin sinyal verme ve ESC biyolojisi üzerine çalışan çoğu laboratuarda bulunan basit ekipman, reaktifler ve malzemeler üzerine kuruludur. Bu platformun başarısı için kritik olan, naif ve başlatılmış pluripotent durumlar arasındaki geçişin nicelleştirilmesi için sağlam bir analiz geliştirmemizdir. Bu tahlilin oluşturulması, hücre platinde önemli iteratif değişiklikler gerektirdiYoğunluk, inhibitör inkubasyon zamanı ve immunoblotlama koşulları.

Küçük molekül yaklaşımları, terapötik ESC uygulamalarında rasyonel kullanım için çekiş kazanmaktadır ^{15 , 16} . Küçük molekül taramalarının önemli bir gücü, araç bileşimlerinin etkin hücre alımı için tasarlanmış ve / veya modifiye edilmiş olmasıdır. Transfeksiyon etkinliği sınırlayıcı değildir ve lentivirüs gibi tehlikeli iletim sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, inhibitörler sıklıkla bir kinaz ailesi ( örn. , Fgfr1-4, Jak1-3) içindeki birden fazla izoformu inhibe eder ve RNAi ve CRISPR / Cas9 gibi genetik / genetik girişim tekniklerini engelleyen fonksiyonel fazlalığın üstesinden gelir. Hem akademik hem de farmasötik ilaç keşfi programlarından daha güçlü ve seçici araç bileşikleri elde edildiğinde, az öğrenilen ve iyi anlaşılmayan kinazlar ESC araştırmasının ön planına itilecektir. Bu nedenle, bu yüksekKaba yeme tarama yaklaşımı, temel ESC düzenleyici ağlarına yeni araştırma yolları açacaktır.

Bu teknolojinin küçük bir kısıtlaması, en güçlü ve seçici küçük molekül inhibitörleri bile in vivo çoklu ilgisiz kinazlarla etkileşime girip engellemektir. Bununla birlikte, gittikçe genişleyen kinaz inhibitörü profil verisi, kinaz inhibitörlerinin işlevsel hedeflerinin kolayca tanımlanmasına izin verir (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Son olarak, prensip olarak, platformumuz, yüksek kaliteli immünoblot antikorlarının bulunduğu herhangi bir küçük molekül toplama ve / veya hücresel tahlilin sorgulanması için uygulanabilir. Bu, pluripotens regülasyonunda çoklu düzenleyici sistemlerin incelenmesine ve çeşitli hücresel prosesleri değiştiren küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. Özellikle, epijen gibi ortaya çıkan küçük molekül koleksiyonlarınınYapısal Genomik Konsorsiyumu (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tarafından geliştirilen tik problar, pluripotent geçişlerin daha yeni regülatörlerini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
mESC media
CCE mESC'ler	ATCC	ATCC  SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-Glutamin	Gibco	25030081	Final: 2 mM
Penisilin / Streptomisin	Gibco	15140122	Final: 50 U / ml
2-merkaptoetanol	Sigma	M6250	Final: 0.1 mM
Lösemi İnhibitör Faktörü (GST füzyonu)	MRC-PPU reaktifleri ve hizmetleri		Final: 100 ng/mL
Lösemi İnhibitör Faktör	Termo	PMC9484	Final: 100 ng/mL
Esansiyel Olmayan Amino Asitler	Gibco	11140050	Final: 0.1 mM
Sodyum Piruvat	Gibco	11360070	Final: 1 mM
Nakavt Serum Replasmanı	Invitrogen	10828-028	Final: %5
Tanımlanmış Fetal Sığır Serumu	Fisher	10703464	Final:% 10
Adı< / güçlü >	< güçlü > Şirket< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü >TC malzemeler< / güçlü >
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol	kırmızısı Termo	25300054
Domuz derisinden elde edilen jelatin	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar	Termo	156545
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco	14190136
V-tabanlı 96 kuyulu plakalar	Greiner Bio-one	651261
Name	Company	< strong>Katalog Numarası	Comments
>Lysis Buffer
Tris tamponu	VWR	103157P
Sodyum Klorür	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
%1 NP-40	Sigma	9016-45-9
Sodyum Deoksikolat	Sigma	D6750-100g
ve beta; -gliserofosfat	Sigma	G9422
Sodyum Pirofosfat	Sigma	13472-36-1
Sodyum Florür	Sigma	450022
Sodyum Ortovanadat	Sigma	450243
Roche Tam Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri	Sigma	CO-RO
strong>Name< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Chemicals< / strong>
Tween	Sigma	P1379-1L
Süt Tozu	Marvel
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Western Blotting
Protran BA 85 Nitroselüloz 0.45 ve benzeri; M  Gözenek boyutu (20 cm x 20 cm Levhalar) (25 Sayfa)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Name<	strong>Company	Katalog Numarası	Yorumlar
Laboratuvar Ekipmanları
Minifold I Sistem	GE	10447850
ChemiDoc görüntüleyici	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Görüntüleyici	LiCor
Name	Company	Katalog Numarası<	strong>Comments
Antikorlar
Anti-fare Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Eşek Anti-Tavşan	Licor	926-32213
Anti-fare-HRP	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R& D Sistemleri	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279