Method Article

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55519

⸱

April 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli organizmalarda, hücre küçük bir grup, büyüme ve üreme sistemik tepkisine sebep olarak, bunların biyojenik aktiviteye özel bir fonksiyon ile donatılmıştır. böceklerde, larva prothoracic bezi (PG) ve ekdisteoidlerden adlandırılan ana steroid hormonları-üreten mutantı ya yetişkin kadın yumurtalık oyun temel roller. Bu ecdysteroidogenic organlar biyosentezi zamanlaması çevresel işaret tarafından etkilendiğini sinir sistemi, gelen innerve. Burada steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmak için uygun bir model sistemi sağlar Drosophila melanogaster, sinek ecdysteroidogenic organları ve larva kendi interaktif organları ve meyve yetişkinleri görselleştirilmesi için bir protokol açıklar. Usta diseksiyon bize beynin ventral sinir kordonu ve diğer dokularda da dahil ecdysteroidogenic organların konumlarını ve interaktif organlarını korumak sağlar. Bir ile immün boyamaecdysteroidogenic enzimlerine karşı ntibodies, dokuya özel promoterler tarafından tahrik edilen transgenik floresan proteinleri ile birlikte, ecdysteroidogenic hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Üstelik ecdysteroidogenic organların inervasyonları da spesifik antikorların veya nöronların çeşitli GAL4 sürücülerin bir koleksiyon ile etiketli olabilir. Bu nedenle, ecdysteroidogenic organları ve nöronal bağlantıları immün ve transgenik teknikler ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Son olarak, kimin çoğalması ve bakım ekdisteoidlerden tarafından kontrol edilir germ hattı kök hücreleri, görselleştirmek için nasıl açıklar. Bu yöntem steroid hormon biyosentezi ve nöronal düzenleyici mekanizmanın kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

çok hücreli organizmalarda, bir grup hücre tüm vücut için gerekli olan kendi biyojenik aktivitesinde özel fonksiyonu ile donatılmıştır. görevlerini yerine getirmek için, her bir doku ya da organ işlevleri ile ilişkili genlerin bir dizi ifade eden ve gelişme bağlamında kendi faaliyetlerinin düzenlemek için başka doku ile iletişim kurar. Böyle özel hücresel fonksiyonları ve arası Organ etkileşimlerini karakterize etmek için, hücrelerin diğer türleri çok hücreli mimarisinde bozulmadan tutuluyor ile birlikte bir hücre grubu belirtmek gerekir.

Gibi özel organların bir örneği birçok biyosentetik enzimleri aktif steroid hormonları 1 kolesterolden dönüşüm basamaklarını aracılık bir steroidojenik organdır. Bu enzim genlerinin çoğu özel olarak steroidojenik organlarda eksprese edilir ve biyosentez yolu sıkıca hümoral giriş ve nöronal girişleri yoluyla çok sayıda dış uyaranlarla düzenlenir. bir Zamanlarsentez, steroid hormonlar hemolimf içine salgılanır ve gen 2, çeşitli ekspresyonunun düzenlenmesi için bir çok doku ve organların hedeflenir. Bu nedenle, bir steroid hormonunun hareketini homeostazı, büyüme ve üreme korumak için sistemik bir yanıtı indükler.

Steroid hormon biyosentezindeki fonksiyonlarını ve steroid hormon pleiotropik etkilerin araştırılması için, Drosophila melanogaster, uygun bir model sistem olarak da kullanılabilir. Larva aşamalarında, böcek steroid hormonu, ekdisteroid, özel bir endokrin organa biyosentezlenir prothoracic bezi (PG) 3 çağırdı. PG, çeşitli ecdysteroidogenic enzimler, özel olarak uygun bir gelişim aşamalarında 4 de deri değiştirme ve başkalaşım kontrol eden, ekdison kolesterol birden fazla dönüşüm basamaklarını katalize ederler. Bu nedenle, ekdisteroid titre içindeki dinamik değişim düzenlenirçevresel uyaranlara yanıt olarak birçok sinyal yollarının tarafından. Öte yandan, yetişkin safhasında, ekdisteroid üreme, uyku, hafıza ve ömrü 5, 6, 7, 8 dahil olmak üzere fizyolojisinde önemli rol oynar. Ekdisteroid aktif oogenez 6, 7, 8, 9, 10, 11 ilerlemesini düzenleyen, yumurtalık biyosentezlenmiş olduğu bilinmektedir. Yakın zamanda tohum çizgisi kök hücreleri (GSC'ler) sayısı çiftleşme yanıt olarak ekdisteroid ve cinsiyete peptid sinyal etkilenir bildirmiştir 12 uyarıcıya sahip.

D. güçlü araçlar iyi açıklamalı genom bilgileri de dahil olmak genetik ve hücre biyolojisi, melanogaster, ikili gensentezleme sistemleri ve transgenik RNAi teknikleri, PG ve yumurtalık 13, 14, 15'te biyosentezini ekdisteroid için gerekli genleri tanımlamak için sağlamıştır. Ecdysteroidogenic genler tespit edildikten sonra, bu genlerin ve gen ürünlerinin dinamik lokalizasyonunun transkripsiyonel düzenleme biyosentez yolunun 16 incelenebilir. Bu amaç için, nicel-ters transkripsiyon-PCR, in situ hibridizasyon ve immünohistolojik analizi RNA yürütülmektedir. Bu tekniklerin uygulanması zor bir görev içerir; PG veya yumurtalık ayrıntılı diseksiyon. Özellikle meyve sineği PG diğer böcekler bu göreceli olarak daha küçük olan (örneğin ipek böceği ve darbe sineği), bu nedenle bir meyve hayati bir beceri örnekleme için diseksiyon sinek uygulama gerekir. Ayrıca, her iki ecdysteroidogenic organlar innervasyon almakMerkezi sinir sisteminde (MSS) 17, 18, 19, 20 s. Bu nedenle, doğru anatomik analizler için, ecdysteroidogenic organlar CNS ve diğer organlarda, bunların nöronal bağlantıları bozmak için birlikte sağlam tutulmalıdır.

Burada diseksiyon ve D Sterpidojenik organların görüntülenmesi için protokoller sağlamaktadır. melanogaster. diseksiyon tekniğini öğrenmek bu deneyler için anahtar bir başlangıç ​​noktasıdır. Buna ek olarak, bir başarıyla birkaç antikorlar ve GAL4 sürücü hatları ile steroidogenik organları yanı sıra interaktif organları etiketleyebilirsiniz. bu teknikler, malzeme ve genetik yararlanarak, bir steroid hormon biyosentezindeki kapsamlı mekanizmaları incelemek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: protokolleri genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Larvaların halkası Gland Diseksiyon (RG)

NOT: D'de. cyclorrhaphous Diptera ait melanogaster, PG, bileşik endokrin organ halka bezi (RG, Şekil 2D) adı içindedir. Bu PG cerrahi (daha sonra ele alınmıştır) diğer hücre tiplerinden ayrılır, imkansız olduğu için, pratik bir hedef diseksiyon ile de dokunulmamış, hasarsız RG izole etmektir.

  1. Uygun gelişim aşamalarında larvalarının hazırlanması
    NOT: D. melanogaster larvalarının gelişim aşamalarını senkronize etmek için, dar bir zaman aralığında yumurta toplamak için ve uygun zamanlarda larvaları toplamak için gereklidir.
    1. 25 ° C'de bir üzüm suyu agar plakası üzerinde 2 saat boyunca yumurta toplayın.
    2. Toplayın 1 yumurtadan yeni çıkmış st evre forseps ile bir mikroskop altında larva ve püresi standart maya / mısır unu sinek gıda içeren küçük şişeye aktarın.
      Not: larva yaş ile temsil edilir, "saat yumurtlama (Hael) sonra" "saat kapağın sonra (Hah)" ya da "L3 ecdysis (hAL3E) saat sonra".
    3. Uygun bir zaman noktasında, istenmeyen yaralanmaları önlemek için tek bir plastik döngü ile aşamalı larvaları toplamak. 3. instar larvaları gelişimsel ilerlemesinde bir fark en aza indirmek için, 70 Hael (48 Hah) fazla 2. evre larvaları toplamak ve onları 2 saat aralıklarla dökülmüyor sağlar. Daha sonra, L3 ecdysis sonra 2 saat içinde 3. instar larvaları toplamak; Bu prosedür 0-2 hAL3E larvaları verir.
    4. fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurulmuş bir tabak için aşamalı larva aktarın.
    5. Vücuttan kalan yiyecek çıkarmak için PBS ile larva durulayın.
  2. Bir altında larva Kaba diseksiyondiseksiyon mikroskobu
    1. forseps ile larva ağzı kancasını tutun. Mikro makas kullanılarak gövde uzunluğunun ön üçte biri larva vücut Sever.
    2. Forseps bir çift ile ön larva vücudunun kesik ucunu tutun. Forseps diğer bir çift kullanarak, yavaşça gövdenin içine doğru baş ucu itme; Bu prosedür tersyüz larva vücut döner.
      NOT: Bu adım 1. evre larvalar diseksiyon için atlanabilir.
    3. adımları tekrarlayın 1.2.1-1.2.2 ek larvaları ile 5-10 dakika boyunca.
      NOT: larva sayısı diseksiyon için zaman kazanmak için eşit veya 20'den küçük olmalıdır.
  3. Larvalarının Fillet diseksiyon
    NOT: Bu yöntem, dokuların konuma tutma bozulmadan kalmasını sağlar.
    1. Sadece 1 saat boyunca suda larvaları bırakın. Larvalar boğulma nedeniyle hareketsiz kılınmıştır.
    2. bir silikon kaplı PBS bir damla bir larva dorsal tarafına koyunyemek, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde.
      NOT: sırt tarafında boylamasına uzanan 2 trakeal tüpleri yer alır.
    3. bir mikroskop altında, forseps kullanılarak larva ön ucu içine bir böcek pimi takın. arka tarafına larva vücut Stretch ve larva posterior ucu içine ikinci bir pimi koydu.
      Not: böcek iğneli ek olarak, tungsten telden yapılmış bir iğne 21 yararlı olabilir. Bir iğne, bir kesme iğne olarak kullanım için ısıtılarak bir pipet ucu gömülü olabilir.
    4. bir mikroskop altında, mikro makas ile kuyruk yakın küçük bir kesi yapmak. kesi itibaren kafasına doğru dorsal orta hat boyunca uzunlamasına sırt manikür kesti. manikür altında dokuları zarar vermemeye özen gösterin.
    5. her iki tarafta bodywall manikür gerin ve disseke bodywall her köşesindeki 4 işaretçilerine yerleştirin.
    6. , Forseps ile ön yağ gövdesinin bir kısmını çıkarmak beyin-RG c açığayüzeyinde açığa omplex. Gerekirse, tükürük bezlerinin bir çift çıkarın.
  4. Sabitleme ve immünohistokimya ile doku boyama
    1. 500 uL (PBS içinde% 4 paraformaldehid) düzeltme çözeltisi ile doldurulmuş bir 1,5 mL'lik bir mikro tüpe larva organları (aşama 1.2.2) ön üçte biri koyun. sabitleyici uygun olmayan bir seyreltme neden olabilir, aksi takdirde, PBS sabit örnekleri bağlanmış bir seferde en az 20 numune, sabitleyin. fileto diseksiyon için, PBS bir damla kaldırmak ve daha sonra düzeltme çözümün bir damla ekleyin.
      Not: düzeltme çözümü için,% 3.7 formaldehid veya% 4 paraformaldehit ya kullanılabilmektedir.
    2. 4 ° C 'de, alternatif olarak 2 saat süre ile oda sıcaklığında (RT) ya da 30 dakika için düzeltme çözeltisinde kesildi dokuları inkübe edin.
    3. 500 uL PBS ile düzeltme çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 3 kez yıkayın. Ar bir rocker 15 dakika boyunca 500 uL% 0.3 PBT (PBS +% 0.3 oktilfenol etoksilat) ile örnekleri yıkayınT. köşe diseksiyon, böceğe iğneleri kaldırmak ve 1.5 mL'lik bir mikro tüpe örnekleri aktarın.
      Not: dokulara antikorların geçirgenliğini artırmak için numuneler oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1-2 saat için 500 uL% 2.0 PBT tedavi edilir.
    4. çözeltisi (PBT içinde% 2 sığır serum albümini) ile bloke 500 uL PBT değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1.5 saat boyunca inkübe edin.
    5. 50 uL primer antikor çözeltisi bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş örneğin antikorlar ile bloke çözeltisi değiştirin.
    6. gece boyunca 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde inkübe edin.
    7. 500 uL% 0.3 PBT ile primer antikor çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 5 kez çalkalayın. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için 500 uL% 0.3 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın.
    8. 50 uL ikinci antikor çözeltisi (blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş boya ile konjüge edilmiş antikorlar) ile% 0.3 PBT değiştirin. nükleer boyama, 0.5 uL 4' , 6-diamidino- için2-fenilindol (DAPI, 0.1 mg / mL stok solüsyonu) 50 uL çözelti ilave edilir. Oda sıcaklığında ya da seçenek olarak bir gece boyunca 4 ° C 'de 2 saat süre ile bir rocker inkübe edin.
      NOT: Karanlıkta örnekleri tutun.
    9. 500 uL% 0.3 PBT ile antikor çözeltisi yerine ve 5 kez çalkalayın. Oda sıcaklığında 15 dakika her biri için 500 uL% 0.3 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın.
  5. Beyin-RG kompleksinin İnce kesme PG'yi içeren ve içine monte
    1. % 0.3 PBT ile doldurulmuş bir tabak için immüno örnekleri aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın.
      NOT: diseksiyon ve montaj esnasında rahatsız edici kabarcıklarını önlemek için,% 0.3 PBT PBS ile değiştirilebilir.
    2. bir mikroskop altında, forseps bir çift üst deri veya ağız kanca tutun. Bir "bıçak" olarak 1 ml şırıngaya bağlanmış bir 27 G iğne kullanılarak, vücut kütikül beyin-RG-göz diski kompleksi kaldırmak için yemek borusu ve göz diskleri ön ucu kesilmiş.
    3. Sepaforseps ile beyin-RG göz disk kompleksinden yemek borusu ve bağırsağı oranı. Yemek borusu ventral sinir kablosu (VNC), yukarıdaki beyin üzerinden geçtiğinden, arka tarafına gut çekin.
      NOT: örneklerinden ekstra hayali diskleri kaldırmak bir iğne bıçakla beyinde, göz diskler ve bacak diskler arasındaki bağlantıları kesmek için.
    4. Diğer örnekler için adımlar 1.5.1-1.5.4 tekrarlayın.
      NOT: örnekler yapışmasını doku kalıntıları önlemek% 0.3 PBT veya PBS ile doldurulmuş farklı temiz bir tabak için tamamlanan her örnek aktarmak için.
    5. mikropipet ile temiz bir cam slayt ortasına örnekleri aktarın.
      NOT: 2 nci veya 3 instar larvaları için, bir mikro pipet ucu bir jiletle kesilmiş olmalıdır.
    6. bir mikroskop altında, forseps kullanılarak dorsal tarafına kadar olan bireysel numunelerin hizalayın.
      Not: RG Şekil 2A (beyin sırt tarafında yer almaktadır). Bu hizalama görüntüleme sırasında tek tek numunelerin özelliklerini kolaylaştırır.
    7. Bir cam slayt yatırın ve mümkün olduğu kadar fazla PBT silin. slayt bir tarafında montaj reaktif bir damla koyun. damla diğer taraftan bir kapak slip kenarını ve forseps ile yavaş yavaş örnekleri kapak kayma koydu.
      NOT: Bu prosedür kapak kayma dışında hareket etmesini örnekleri engeller.
    8. 4 ° C'de örnekleri saklayın. Karanlıkta örnekleri tutun.

2. Yumurtalık diseksiyonunda Yetişkin Dişiler

  1. Yetişkin kadın hazırlanması
    1. 3-4 gün yumurtalık kadar şişmanlatıyor Yem dişi standart maya / mısır unu sinek gıda ile uçar. 25 ° C 'de muhafaza edin.
  2. Yetişkin kadın yumurtalığı diseksiyonu
    1. Kadın CO2 gazı ile uçan anestezisi ve kafalarını kesti.
    2. 3 cm'lik çanak sinek organları aktarınPBS ile doldurulur.
    3. bir mikroskop altında, forseps kullanılarak sırt tarafında göğüs kafesi tutun. Diğer forseps ile karın kademeli A5 ya da A6 tutun ve arka tarafına doğru karın kütikül soyarak. forseps ucu yapışkan kütikül silin.
    4. Bir yumurta kanalının sıkıştırın ve vücuttan yumurtalık çıkar.
    5. Tarak ve forseps ile yumurtalık ipuçlarını yayıldı.
      NOT: Bu işlem immünboyanmadan verimliliğini artırır.
  3. Yetişkin kadın beyninde, VNC ve üreme organlarının Diseksiyon.
    NOT: Bu yöntem yumurtalık inervasyonu bozulmadan muhafaza edilmesini sağlar.
    1. Kadın CO2 gazı ile uçan anestezisi ve PBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı tabak aktarın.
    2. Diseksiyon mikroskobu altında, burnumun tutun ve forseps ile beyin maruz kafa manikür soyarak. beyne bağlı trakea çıkarın.
      NOT: brain, beyaz ve yuvarlak bir yapıdır. Beyin toraks VNC bağlanır.
    3. sırt tarafında toraks tutun ve forseps bir çift bacak ve kanatları kesti. Forseps diğer bir çift kullanılarak, bacakların bazlardan göğüs ventral kütikül soyarak. VNC ortaya çıktığında, VNC forseps kullanılarak bağlanmış kalan sırt kütikül ve kasların çıkarın. beyin ve VNC arasındaki bağlantıyı zarar vermemeye özen gösterin.
    4. Karın manikür soymaya yumurtalık ve nöronlar, kırpma, gut, yumurta kanalı, rahim ve suç ortağı bezi de dahil olmak üzere interaktif organları açığa forseps kullanın.
    5. trakea ve forseps kullanarak yağ vücutta dahil kalıntı dokuları çıkarın.
  4. Sabitleme ve immünohistokimya ile doku boyama
    1. 250 uL ile dolu bir 1,5 mL'lik bir mikro için düzeltme çözeltisi yumurtalıkların yaklaşık 8-10 çift transfer (% 4 paraformaPBS içinde kulanılan) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca numune inkübe edin.
    2. 500 uL PBS ile düzeltme çözeltisi yerine ve hızlı bir şekilde numuneler 3 kez yıkayın.
    3. Oda sıcaklığında her biri 5 dakika için numuneler 500 uL% 0.1 PBT ile 2 kez yıkanır.
    4. çözümü engelleme 50 uL PBT değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 1 saat inkübe edin.
    5. 50 uL primer antikor çözeltisi ile bloke çözeltisi değiştirin.
    6. gece boyunca 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde inkübe edin.
    7. 500 uL% 0.1 PBT ile primer antikor çözeltisi değiştirin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için 500 uL% 0.1 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın.
    8. 50 uL ikinci antikor çözeltisi ile% 0.1 PBT değiştirin. nükleer boyama için, 50 uL çözelti 0.5 uL DAPI ekleyin. Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 2 saat inkübe edin.
    9. 500 uL% 0.1 PBT ile ikincil antikor çözeltisinin değiştirin. 500 uL% 0.1 PBT ile numuneler 3 kez yıkayın Oda sıcaklığında bir sallama düzeneği üzerinde 15 dakika her biri için.
      Not: yıkama prosedürü bir gece boyunca 4 ° C'de yapılabilir. Karanlıkta örnekleri tutun.
  5. Cam slaytlar üzerine örnekleri Montaj
    1. % 0.1 PBT bir mikropipet kullanılarak bir cam slayt örnekleri aktarın.
      NOT: diseksiyon ve montaj esnasında rahatsız edici kabarcıklarını önlemek için,% 0.1 PBT PBS ile değiştirilebilir.
    2. yumurtalık, bir mikroskop altında forseps ile birbirinden ovarioles dizilerini ayırır. germaria içeren ovarioles uçlarını zarar vermeyin. beyin VNC-üreme organı kompleksi için, artık kütikül kaldırmak ve bir cam slayt pozisyonu sağlayabilir.
    3. mümkün olduğu kadar fazla PBT silin ve numunelerin merkezi montaj reaktif bir damla koymak. yavaşça forseps kullanarak bir kapak kayma yerleştirin.
    4. 4 ° C'de örnekleri saklayın. Karanlıkta örnekleri tutun.
Bir odaklı lazer tarama mikroskopu ile "> 3. Görüntüleme

  1. mikroskop altında örnekleri gözlemleyin ve görüş alanında steroidojenik organları getir. görünüm düzeltildikten sonra, görüntü elde etme moduna görüntüleme sistemini açmak.
    NOT: 10-20X objektif lensler beyin-RG kompleksi veya tüm yumurtalığı görüntülerini elde etmek için kullanılır. Seçenek olarak ise, 40-63X objektifler (su ya da yağ daldırma) GSC 'lerin veya PG ve yumurtalık nöronal innervasyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için kullanılır.
  2. ekli yazılıma görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın. Floresan kombinasyonu (örneğin GFP ve RFP) seçin. hızlı tarama prosedürü ile, lazer gücü, detektörlerin duyarlılığı (kazanç / ofset) ve iğne deliği boyutunu ayarlamak.
    NOT: Yüksek kalitede görüntü elde etmek için, tarama lazer gücü ve dedektör (Kazanç) duyarlılığı her numune için optimize edilmelidir. şeklinin ana hattını içindokuların, iletilen ışık görüntü bir floresan görüntü ek olarak alınabilir.
  3. Görüntülerin Z yığınlarını atın. Sürekli hızlı tarama sırasında mikroskop odağı sürücüsüyle odak düzlemi taşımak ve başlangıç ​​konumunu ve son konumu ayarlayabilirsiniz. dilim sayısı ve dilimler arasındaki aralık mesafe buna göre ayarlanır.
  4. Tarama hızı, tarama yöntemi ve çift yönlü tarama modunu seçin.
  5. görüntü elde etmek için "gerçek taramalar başlat".
  6. ekli yazılımın formatı ile görüntü kaydetme.
    NOT: Orijinal resim dosyaları görüntü elde etme parametreleri ve ölçeklerin bilgiler içerir. Dışa görüntüler bilgisayara 22 bir görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz steroidogenik organları ve D. melanogaster larvaları ve yetişkin kadınlarda onların interaktif organ incelemeleri için yukarıdaki protokoller kullanılır. Protokolleri genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir.

PG (Şekil 2D), beyin göre daha küçük ve daha şeffaf olduğu ve beyin (Şekil 2A-C ve 3A-E) ön-sırt tarafında yer de dahil olmak üzere, RG,. PG hücreleri etiketlemek için, çeşitli gruplar ecdysteroidogenic enzimlerine karşı antikorların çeşitli yarattı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ekdisteroid biyosentezi ve D. melanogaster düzenleyici mekanizma inceledi ve diseksiyon ve immün için bir protokol geliştirmiştir. Ekdisteroid biyosentezi zamanlaması nöronal girişler 33 boyunca çevresel olaylara etkilenir, nedenle diseksiyon sırasında beyin, VNC ve diğer dokuları ile birlikte ecdysteroidogenic organların innervasyon korumak için esastır.

Yukarıda tarif edildiği gibi, D. melanogaster PG korpus allata (CA) ve korpus cardi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iş için kendi teknik destek için Reiko Kise ve Tomotsune Ameku teşekkür ederim. Ayrıca Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stok Merkezi, KYOTO Stok Merkezi (DGRC) ve hisse senedi ve reaktifler için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası minnettarız. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Numarası 16K20945, Naito Vakfı ve Inoue Bilim Araştırma Ödülü dan ysn bağışları ile desteklenmiştir; ve mext KAKENHI Hibe Numarası 16H04792 dan RN bir hibe ile.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
yumurta toplama
doku kültürü kabı (55 mm)AS ONE1-8549-02  üzüm suyu agar plakaları
için toplama kabıHIKARI KAGAKU
maya ezmesiOryantal kuru maya, Tokyo
%100 üzüm suyuWelch Food Inc.
yetiştirme larvaları< / güçlü>
küçük şişeler (12ml, 40 kez; 23,5 mm, PS)SARSTEDT58.487
tek kullanımlık döngüAS ONE6-488-01
standart sinek yemi  Blooington stok merkezinin web sitesinde bize ulaşın.
diseksiyon
diseksiyon mikroskobuCarl ZeissStemi 2000-C
diseksiyon mikroskobuLeicaS8 AP0
doku kültürü kabı (35 x 10 mm, işlenmemiş)IWAKI1000-035
SylgardTORAYbulaşıkların içinde silikon kaplama
Terumo iğnesi (27G, 0,40 x 19 mm) TERUMONN-2719SDoku forsepslerini kesmek için bir "bıçak"
, Inox, #5Dumont, İsviçre
böcek pimi (0,18 mm çapında)Fileto diseksiyonu mikroShiga Markası
NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
fiksasyon< / güçlü >
ultra saf suMerck Millipore
fosfat tamponlu salin (PBS)
FormaldehitNacalai tesque16222-65
ParaformaldehitNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
mikrotüpler (1.5 ml)INA OPTIKACF-0150
İnkübasyon
Bir swist karıştırıcı TM-300 (rocker) olarakTM-300rockerolarak
Sığır Serumu AlbüminiSIGMA9048-46-8
primer antikor
anti-Sro (kobay), 1:1000
anti-GFP (tavşan), 1:1000Moleküler ProblarA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (fare mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (tavşan), 1:500SIGMAS5545
anti-HTS 1B1 (fare)Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)1B1
anti-DE-cadherin (sıçan), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (fare), 1:50DSHBnc82<
güçlü>ikincil antikor
keçi anti-Tavşan IgG (H+L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugeYaşam TeknolojileriA-11008
Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugeYaşam TeknolojileriA-11001
Keçi anti-Sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 546 eşlenikYaşam TeknolojileriA-11081
Keçi anti-Kobay IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 eşlenikYaşam TeknolojileriA-21435
Alexa Fluor 546 boya konjuge phalloidinLife TeknolojilerA-22283
< güçlü > montaj reaktifleri< / güçlü >
mikro sürgülü camMatsunami Glass Ind., Ltd.SS7213
Kare mikroskop kapak camıMatsunami Cam Sanayi San
FluorSave reaktifi (Montaj reaktifi)Calbiochem345789
Transfer pipeti 1 ml (Tek kullanımlık damlalık)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 lazer tarama mikroskobu sistemiCarl Zeissters çevrilmiş Axio Observer. Z1 SP sol
görüntü işleme
LSM700 ZENCarl Zeiss64 bit Microsoft Windows7 işletim sistemini temel alan özel bir kullanıcı arayüzüdür
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#46260)
UAS– GFP; UAS– mCD8::TokyoÜniversitesi'nden K. Ito'dan
w[1118]
w; fantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#51941)
makası için Bir .C218181 GFP hediyeleri.,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32(2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123(2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778(2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806(2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila MelanogasterSteroidogenic OrgansImmunostaining ProtocolLarval DissectionOvary VisualizationBrain Ring GlandEcdysteroid BiosynthesisGermline Stem CellsNeuronal InnervationFluorescent Labeling

Related Articles