Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

Nohemi Salinas-Jazmín; Edith González-González; Luz X. Vásquez-Bochm; Sonia M. Pérez-Tapia; Marco A. Velasco-Velázquez

doi:10.3791/55542

Method Article

Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

DOI:

10.3791/55542

⸱

May 4th, 2017

Nohemi Salinas-Jazmín¹^,² , Edith González-González¹ , Luz X. Vásquez-Bochm³ , Sonia M. Pérez-Tapia⁴^,⁵ , Marco A. Velasco-Velázquez⁶

¹Unit for Development and Research in Bioprocesses Unit (UDIBI), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), University of Mexico (UNAM), ²School of Chemistry, National Autonomous University of Mexico (UNAM), ³Graduate Program in Chemical Sciences, National Autonomous University of Mexico (UNAM), ⁴Unit for Development Research and Medical Innovation in Biotechnology (UDIMEB), National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), ⁵Department of Immunology, National Scool of Biological Sciences, National Polytechnic Institute (IPN), ⁶Department of Pharmacology and Unit of Translational Biomedicine (CMN 20 de noviembre), School of Medicine, National Autonomous University of Mexico (UNAM)

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, rituksimab iki önemli fonksiyonel özellikleri in vitro karşılaştırmasını tarif: hedef bağlanma ve tamamlayıcıya bağlı sitotoksisite (CDC) indüksiyonu. yöntem, referans rituksimab ve rituksimab biyobenzerin arasında bir yan-yana karşılaştırma için kullanılmıştır. Bu tahliller, biyobenzer geliştirme sırasında veya üretimlerinde bir kalite kontrol olarak kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapötik monoklonal antikorlar (mAb), kanserler de dahil olmak üzere farklı patolojilerin tedavisi için önemlidir. İlaç şirketleri tarafından biyobenzer mAb'lerin gelişimi bir pazar fırsatıdır, ancak aynı zamanda uyuşturucunun erişilebilirliğini artırmak ve terapi ile ilişkili maliyetleri azaltmak için bir stratejidir. Burada detaylandırılan protokoller, Daudi hücrelerinde rituksimab ile hedef bağlanma ve CDC indüksiyonunun değerlendirilmesini tanımlamaktadır. Bu iki işlev antikorun farklı yapısal bölgelerini gerektirir ve rituximab'ın indüklediği klinik etkiyle ilişkilidir. Protokoller, bir referans rituksimabın ve piyasaya sürülen rituksimab biyosimerlerinin yan yana karşılaştırılmasını sağlar. Değerlendirilen ürünler hem hedef bağlama hem de CDC indüksiyonunda farklılıklar gösterdi; bu, alttaki fizikokimyasal farklılıkların bulunduğunu ve klinik ortamdaki bu farklılıkların etkisini analiz etme ihtiyacının altını çizdi. Burada bildirilen yöntemler basit ve ucuz in vitro </ Em> rituximab biyosimilar aktivitesinin değerlendirilmesi için modeller. Bu nedenle, biyo-benzeri gelişim sırasında biyoeşdeğer üretimin kalite kontrolünde yararlı olabilirler. Dahası, sunulan yöntemler diğer terapötik mAb'lara ekstrapole edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapötik antikorlar kanser, oto bağışıklık ve kronik hastalıklar, nörolojik hastalıklar ve diğerleri ¹ de dahil olmak üzere, farklı patolojilerin tedavisi için geliştirilmiş rekombinant monoklonal antikorlar (mAb'ler) bulunmaktadır. Şu anda FDA 40'dan fazla terapötik mAb'lere onayını veren ve daha sonraki yıllarda pazara ulaşması bekleniyor.

Rituksimab CD20 ⁺ B hücreli non-Hodgkin lenfoma (NHL), CD20 ⁺ foliküler NHL, kronik lenfositik lösemi, ve romatoid ^{artrit, ^2,} ³ tedavisi için onaylanmıştır yüksek afiniteli bir kimerik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hedef Bağlamanın Akış Sitometresi ile Değerlendirilmesi

Biyolojik materyal ve reaktiflerin hazırlanması
1. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (H-IFBS) ile takviye edilmiş 500 mL RPMI kültür ortamı yapın.
2. Kültür Daudi Burkitt'in Lenfoma (Daudi) hücreleri ve Daudi GFP ⁺ hücreleri RPMI ve 75 cm2 kültür şişeleri kullanıyor. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO ₂ nemlendirilmiş atmosferde 6 - 9 x 10 ⁵ hücre / mL'ye ulaşıncaya kadar muhafaza edin.
3. PBS içinde 1/100 H-IFBS seyrelterek 50 mL boyama tamponu yapın; Bu tampon, 2-8 ° C'de en az bir ay boyunca kararlıdır. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, bağlanma hedef ve referans rituksimab CDC indüksiyon Asya'da üretilen biyobenzer rituksimab o ve ticari olarak temin edilebilen paralel olarak karşılaştırıldı.

Daudi hücreleri, her iki mAb de, konsantrasyona bağlı bir şekilde (Şekil 1D) CD20 bağlandı. Bağlanma verilerinin doğrusal olmayan regresyon referans ve biyobenzer rituksimab, sırasıyla (Şekil 1 E)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapötik mAb'nin patent sona ermesi, biyosimilarların gelişimini desteklemektedir. Dolayısıyla, bu ürünlerin klinik olarak ilgili faaliyetlerindeki farklılıkları belirleyebilen basit yöntemlere ihtiyaç vardır. CD20 ⁺ kültürlü hücreler rituximabın iki önemli fonksiyonel özelliğinin değerlendirilmesi için kullanılmıştır: hedef bağlama ve CDC indüksiyonu. Önceki aktivite, CD20'nin mAb'nin Fab bölgesi tarafından tanınmasını gerektirirken, sonuncusu esasen Fc bölgesinin komplemanının etkileşimine bağl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N. Salinas-Jazmín, E. González-González ve SM Pérez-Tapia, çeşitli ilaç firmaları için biyolojik benzerlik çalışmaları yapan UDIBI çalışanlarıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların onayları yok.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 orta	ATCC	30-2001	Hücre hattına bağlı olarak kültürü değiştirin
Tripan Mavisi çözeltisi	Sigma	T8154	%0.4, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun
Daudi Burkitt'in Lenfoma Hücreleri	ATCC	CCL-213	İlgilenilen antikora bağlı olarak hücre hattını değiştirebilirsiniz
Fetal sığır serumu (FBS)	GIBCO	16000-044	Hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak serum kaynağını değiştirebilirsiniz
Normal İnsan Serumu Komplemanı	Quidel	A113	Bu nedenle, ilaç geliştirme, biyomalzeme testi ve diğer uygulamalar dahil olmak üzere biyouyumluluk deneylerinde kullanım için uygundur
7AA-D	BDPharmigen	559925	Canlılığı analiz etmek için çoğu cihaz konfigürasyonuyla uyumlu çok çeşitli renk seçeneklerini kullanabilirsiniz.
PECy5 Fare Anti-insan IgG	BDPharmigen	551497	Akış sitometrenizin filtresine ve lazerine bağlı olarak florokromlu değiştirin
İnsan IgG İzotip	Kontrolü ThermoFisher Scientific	07-7102	mAb'ye bağlı olarak değiştirin
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Akış Sitometrisi Fiksasyon Tamponu (%1 - 4 formaldehit veya paraformaldehit)
PBS pH 7.4 10x (Fosfat tamponu tuzlu su)	GIBCO	70011-044	Ca ^{2 + < / sup> / Mg^{2 + < / sup> [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na_{2< / sub>HPO_{4< / sub>, 1.46 mM KH_{2< / sub>PO_{4< / sub>] ve endotoksin içermez.}}}}}}
Hücre kültürü plakaları 96 kuyulu, V-tabanlı	Corning	29442-068	12 x 75 mm yuvarlak tabanlı test tüpleri veya 96 oyuklu V- veya U-tabanlı mikrotitre plakaları
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Referans ürün
Rituximab	Hintli	—	Biyobenzer ürün
15 veya 50 mL konik santrifüj tüpleri	Corning	430290 veya 430052	—
Pipet Uçları	Eppendorf	—	Birden fazla hacim yapılandırması gereklidir
Pipetler	Eppendorf	—	Ayarlanabilir hacimli pipetler gereklidir
Santrifüj 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Soğutmalı değişken hızlı santrifüj (4 ila 25 > C) 10 ila 30.130 & saat arasında değişen hızlarla; g
Akış sitometresi	BD Dickinson	—	BD FACSAria III veya başka bir akış sitometresi
Olympus optik ve ışık mikroskobu	Olympus	—	Hücre büyümesini ölçmek ve değerlendirmek için
Kuluçka makinesi	SANYO	ve mdash;	Kültür hücrelerine sıcaklık ve CO₂ kontrolü için inkübatör
Biyolojik Güvenlik Kabini	CHC BIOLUS	—	Araştırmacıyı, ürünü ve çevreyi korumak için kullanılan biyolojik güvenlik kabini.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a P....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles