3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Summary

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

Abstract

Tek tabakalı hücre kültürü yeterli kompleks hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini içeren dokuların in vivo davranış, modelde mevcut değildir. Üç boyutlu (3D) hücre kültür teknikleri yapışık hücre kültürü eksikliklerin giderilmesi için geliştirilen yeni bir yeniliktir. In vitro doku analogları üretmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir birlikte, bu yöntemler, kurma pahalı sıklıkla karmaşık özel teçhizat gerektirebilir ve genellikle sadece belirli hücre tipleri ile uyumluluğu ile sınırlıdır. Burada, tümör ve normal hücre çizgileri, çeşitli büyüme ile uyumlu uygun boyutta çok-3D parçacıklarının içine hücreleri toplanmasını sağlayan bir hızlı ve esnek bir protokol açıklar. Bu ankrajdan bağımsız sferoid nesil teşvik etmek ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde, hücre mono tabakaları oluşumunu önlemek için, serum ve metil selüloz (MC) arasında değişen konsantrasyonlarda kullanmaktadır. Bireysel için en uygun koşullarınidual hücre çizgileri küremsi oluşturulması ortamda MC veya serum konsantrasyonlarını ayarlanması ile elde edilebilir. üretilen 3 boyutlu sferoidler hücre sinyal veya gen ekspresyon çalışmaları, bir aday ilaç tarama, veya tümör hücre istilası ve göç gibi hücresel süreçleri çalışma da dahil olmak üzere geniş bir uygulama aralığında, kullanım için toplanabilir. Protokol de kolayca tek hücre klonal sferoidler üretmek üzere uyarlanmış olan ve ankrajdan bağımsız büyüme ve anoikis direncini değerlendirmek için adapte edilebilir. Genel olarak, iletişim kuralı üreten normal ve tümör hücrelerinin in vivo büyüme dokuların 3D mikro-özetlemek ve model-leştirilmesi için 3D hücresi parçacıklarının kullanılması için kolaylıkla değiştirilebilir bir yöntem sağlar.

Introduction

Tümör hücre davranışı biyolojik ilgili değerlendirme bu yeterli in vivo bulundu hücre mikro yansıtmaz, çünkü kısmen, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültür yöntemleri kullanılarak meydan okuyor. Kültür (ör Boyden Chamber tahlilleri) halinde hücre dışı matris bileşenleri içeren alternatif yaklaşımlar, in vivo doku ortamının daha fazla fizyolojik olarak temsilidir. Bununla birlikte, tek tek hücre davranışının değerlendirilmesi ile sınırlı olabilir ve doku ya da tümör büyümesi ^{1, 2, 3} katkıda hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri in vivo kombinasyonlarında karmaşık özetlemek yoktur.

Çok hücreli sferoidler ^kullanımı, daha doğru in vivo hücre büyümesi ¹ kompakt mimarisini yeniden üreten bir son yaklaşımdır^4. Sferoidler normal hücrelerin hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir, aynı zamanda bu tür metastatik büyüme ya da ilaç direnci ⁴ tümör progresyonu özelliklerini modeli tümör analogları olarak hareket edebilir.

Sferoidler bir matris ⁵ veya daha hızlı bir şekilde yerleştirilmiş tek hücre çoğalması ile oluşturulabilir, birden fazla hücre toplanmasını teşvik ederek, tek bir hücre kümesi (örneğin, asılı damla, santrifüj yöntemleri) ^{6, 7} oluşturulur. Mevcut hücre toplama teknikleri pahalı malzeme veya özel ekipman gerekebilir. Buna ek olarak, bu sferoidler boyutları ve morfolojileri geniş bir yelpazede ve büyüme koşulları ya da zor tedaviler arasındaki karşılaştırmalar, büyük miktarlarda üretilmesi için zor olabilir. Son olarak, bu yöntem tarafından üretilen sferoidler proteinli ekstrasellüler izole etmek zor olabilirlular matrisi içinde diğer uygulamalarda kullanılmak üzere yerleştirilmiştir.

Burada, ticari olarak temin edilebilen U tabanlı hücre itici plakalar ve bir atıl yapışkanlık arttırıcı matrisi, metil selüloz ile tutarlı bir şekilde boyutlandırılmış, hücre parçacıklarının hızlı oluşumu için sağlam ve kolayca değiştirilebilir hücresi agregasyonu yöntemler tarifedilmiştir. Oluştuktan sonra, bu çok hücreli küreler kolaylıkla geniş bir uygulama aralığında kullanım için izole edilir. Protokol de kolayca diğer hücre süreçleri değerlendirmek için kullanılabilir hücre çoğalması ile parçacıklarının üretilmesi için uyarlanmıştır. Burada, bu iki farklı küremsi oluşumu protokoller, örneğin uygulamaları immünofloresan boyama ile miktarı, hücre istilası deneyleri, bir anoikis deneyi göstermektedir.

Protocol

NOT: Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri Listesi'nde yer almaktadır.

Hücre Toplama tarafından 1. Sfero Üretim

1. Metil selüloz çözeltisi: 100 mg / ml metil selüloz 100 mL hazırlayın.
   1. Isı 50 ml ultra saf _H2O ila 80 ° C. 10 g metil selüloz tozu eklenir ve parçacıkları eşit şekilde dağılana kadar çalkalayın.
   2. Soğuk ultra _{saf, H2O} ile nihai hacme getirmek ve çözelti berrak hale gelinceye kadar 4 ° C 'de karışmaya, saman renkli ve hiç bir görünür katı ihtiva etmektedir.
   3. çözünmemiş katıların ayrılması için bir 0.45 um filtre içinden geçirin. Hazırlanan çözelti, alikotlandı ve 12 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
      Not: Metil selüloz hücre-hücre yapışmasını geliştirmek ve yapışık hücre tek katmanının oluşumunu engellemek amacıyla sitotoksik olmayan, atıl, süspansiyon maddesi olarak kullanılır. Metil selüloz suda çözünürdür ve spher uymalı, yıkanabiliroid nesil.
2. Küre formasyonu ortamı
   NOT: Kullanmadan önce hemen sfero oluşum ortamı hazırlayın. tutmayın.
   1. Uygun bir kültür ortamı içinde 1-5 mg / ml metil selüloz çözeltisi ile seyreltilir.
   2. sterilize ve çözünmemiş katıların ayrılması için bir 0.22 um filtre içinden geçirin.
3. Dulbecco fosfat tamponlu tuz (PBS)
   1. 1x ve kullanmadan önce, 0.45 um'lik bir filtreden geçirmek için seyreltilir. Hazırlanan çözelti, oda sıcaklığında süresiz depolanabilir.
4. Hücre sfero üretimi (Şekil 1)
   NOT: Önceden tüm reaktifler hazırlayın. Toz, lif veya diğer çözünmeyen parçacıklar tarafından çözümlerin kirlenmesini önlemek için önemlidir. Bu kirleticilerin varlığı olumsuz steoid oluşumunu etkiler. Kültür ortamı ve diğer çözümler zaman POS bu parçacıkların çıkarılması için 0.45 um filtreden geçirildi olmalıdırsible. Bu ek lifleri tanıtmak gibi çözümler aktarırken pamuk süzülmüş pipetler kullanmaktan kaçının.
   1. uygun bir kültür içinde% 70 ortak akışa kadar kültür hücre mono tabakaları, orta,% 10 serum ile takviye edilmiştir. Aspire kültür ortamı ve enkaz kaldırmak için 1x PBS ile durulayın. Tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin), 10 cm hücre kültür tabağına disosiasyon tamponu 3 mL ekleyin ve _CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
   2. dekolmanı onaylamak için 10X büyütmede mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Serum-takviyeli kültür ortamında 7 mL ayrılma tamponu nötralize.
   3. 10 dakika hafifçe pelet hücreler için 500 xg'de Santrifüj hücre süspansiyonu.
   4. süpernatantı. bir filtre ucu ile bir P1000 pipet kullanarak 1 ml sfero oluşumu ortamında tekrar süspansiyon hücre pelet.
      NOT: hücre süspansiyonu kümeleri serbest olmalıdır.
      1. Hücre topağı çiğnemek için, küçük bir açıyla ise tüpün dibine pipet basınpipet hücre pelletini kesme. Bu hücrelere zarar verebileceği 5 kez - en fazla 3 triturating kaçının. Pipet yavaş ve hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için pipet tüm içeriğini sınırdışı yok.
   5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 1 x 10 ⁴ hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin.
      NOT: Hücre sayısı farklı boyutlarda parçacıklarının üretilmesi için optimize edilebilir. hasarlı hücrelerin tripan mavi boyası, yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler canlılığı teyit etmek için kullanılabilir.
   6. Aktarım hücresi steril, tozsuz çok kanallı pipet rezervuara süspansiyonu ve 96 oyuklu U tabanlı hücre itici plakanın her oyuğuna 100 uL dağıtılması için filtre ipuçlarını kullanın.
      1. Süzülmüş ultra saf H ₂ O ile durulayın rezervuar toz ve tüyleri temizleyin.
      2. haznenin dibine çökelme hücreleri önlemek için tohumlama periyodik ise hücre süspansiyonu karıştırın. karıştırma ve dağıtıyor sırasında hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için, ters pipetleme tekniği kullanmakörn.
   7. Doku kültürü kuluçka makinesine transfer plakaları (37 ° C ve% 5 _CO2) ve sferoid oluşumu için günlük olarak kontrol edin. Hücreler de 6 saat içinde her dibe ve 24-48 saat (Şekil 2) içinde bir sfero içine araya genellikle gerekir.
   8. Başarılı sfero oluşumu teyidi için, bir p10 ucu kullanın ve yavaşça 10X büyütmede mikroskop altında gözlemlerken sfero üzerinde orta pipetle. Düzgün oluşturulmuş sferoidler kendi 3D yapısını teyit plaka ve rulo gevşetin.
      NOT: Her hücre çizgisi, oyuk başına tek bir sfero oluşumunu elde etmek için metil selüloz ve serum konsantrasyonlarının titrasyon ile tespit edilmelidir. Seçilen hücre hattı, bu şekilde optimize koşullar Tablo 1 'de gösterilmektedir, ve parçacıklarının örnekleri Şekil 2B'de kurdu. belirtilenden daha sferoidler uzun süre yetiştirilen olabilir ancak büyük olmak gibi onlar giderek daha zor büyümekparçalanma olmadan işlemek için. Hücreler tek tabaka, uydu küreler oluşturma ya da kuyunun dibine çöker başarısız olursa, metil selüloz ve serum konsantrasyonu, daha uygun küre formasyonu (Şekil 3B) için ayarlanması gerekebilir. Bu tür elyaflar veya toz (Şekil 3A) gibi kirletici maddeleri içeren küremsiler kullanmayın. Önceden oluşturulmuş sferoidler bu analiz için büyüme faktörleri, canlı hücre lekeleri veya inhibitörleri olarak ilgi çekici bir bileşik ile muamele edilebilir.

2. Sferoid Yayılması deneyindeki (Şekil 4)

1. nötralize kollajen
   1. 4 ° C'ye kadar tüm sıvıları soğutmak ve istenmeyen polimerizasyonu önlemek için kolajen ile çalışırken buz üzerinde tutun.
   2. 0.22 mikron filtreler aracılığıyla ultra saf H ₂ O geçirin bütün çözümleri NaOH ve taze 0.1 M HCl taze 0.1 M ve 0.01 M çözüm hazırlayın.
   3. 1: Sığır tip 1 kolajen (3.1 mg / ml stok), 0.01 M NaOH ve 10 x PBS (8 karıştırın: 1 hacim olarak oran) ve soğuk 0.1 M NaOH ve HCI kullanılarak pH 7.4'e ayarlanır. kollajen nihai konsantrasyon / ml 2.5 mg'dır.
   4. 2-3 mm'lik bir derinliğe kadar görüntüleme kabı doldurmak için yeterli nötralize kolajen hazırlayın. 100 uL az Malzeme Listesi listelenen 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün her bir kuyu için gereklidir.
2. Kolajen parçacıklarının gömülmesi (Şekil 4)
   1. Kat kolajen nötralize 50 uL minimum 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün her çukuruna alt.
      1. kolajen kabarcıkları oluşturarak önlemek için ters pipetleme tekniği kullanın. kuyu yüzeyi üzerinde eşit kolajen yaymak için pipet kullanın.
         NOT: Bu kolajen taban katmanı süspansiyonda parçacıklarının tutun ve genellikle 1-2 mm kalınlığında olacak. taban tabakası üst kollajen tabakası üzerinde bir menisküs oluşmasını önler. Taban tabakası çok ince ise, küremsi odasının slayt alt temas yapabilir veHücre tek tabaka oluşturur.
   2. 10 cm doku kültürü çanak odasına slayt ve ultra saf H ₂ O ile dolu bir 35 mm doku kültürü çanak yerleştirin. Kollajen, tipik haliyle 1 saat polimerize kadar 37 ° C'de inkübe edin. Mağaza buz üzerinde kolajen nötralize kalan.
      NOT: su dolu 35 mm çanak nem sağlar ve kurumasını önleyecektir. slaytı tahlilinde boyunca bu nem odasında kalmalıdır. kolajen taban tabakası, gece boyunca polimerleşmeye bırakılır olabilir. Uzun inkubasyon genellikle daha sert bir jel ile sonuçlanır.
   3. Bir p1,000 filtre ucu kullanarak üst tüpler ek 1.5 mL, 96 oyuklu U tabanlı hücre itici plaka önceden oluşturulmuş sferoidler (aşama 1.4.7) toplar. Pipet yavaşça tekrarlanan önlemek ve ya kuvvetli pipetleme sferoidler sıvı-kesme aza indirmek için. Çoklu sferoidler 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün bir oyuğuna transfer için tek bir tüp içerisinde toplanmış olabilir.
   4. Bir tabl toplanan küremsilerin santrifüj2-5 saniye için 2000 xg ve en ETOP mikrosantrifüj P200 pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. Bu sferoidler parçalayın ya da bir araya gelme neden olabilir, gerekli olandan daha uzun süre santrifüj kaçının.
      NOT: süpernatant çoğu kapalı pipetle sonra tüp dikkatli aşırı sıvı uzak fitil temiz bir kağıt havlu üzerine ters çevrilmiş olabilir. sferoidler kurumasına izin vermeyin.
   5. Geniş delik P200 ucu kullanarak, yavaşça kolajen nötralize 50 mcL parçacıklarının tekrar süspansiyon. Herhangi bir Sferoidler odası slayt aktarılır önce toplanan sferoidlerin her tüp için bunu yapın. oda slaytlar transfer için hazır olana kadar buz üzerinde nötralize kollajen içinde yeniden süspanse edilmiştir parçacıklarının tutun.
   6. inkübatör odasına slayt çıkarın ve dikkatlice kolajen taban tabakasının üstüne sfero-kollajen karışımı pipetle. Kollajen polimerize kadar _CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5.
      1. hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için pipet tüm içeriğini dağıtmak yok. Dropwimkb pipet kollajen taban tabakası rahatsız şansını azaltır.
   7. Yavaş yavaş uL slaytı, her sıra için, istenen kimyasal çekici inhibitörleri ya da diğer tedaviler ihtiva eden kültür ortamı ısıtıldı en az 100 ekleyin. Sıvı çok şiddetle bunun üzerine pipetle ise kollajen tabakası içeren sferoidler yırtılabilir. Kültür ortamı yavaş yavaş kolajen rahatsız etmemek için bir kuyu tarafı aşağı reçete edilebilir.
   8. Hücre istilasını izin vermek için 37 ° C'de ve% 5 _CO2 seviyesinde odasına slayt inkübe edin. Çevre kollajen içine hücre istilasını aydınlık veya floresan görüntüleme tarafından gözlemlenen ve Epifloresans konfokal veya hafif tabaka mikroskobu kullanarak çeşitli yöntemler ile ölçülebilir.

Invasion 3. Niceleme: aydınlık Mikroskopi

1. ayarlanan zaman aralıklarında, görüntü aydınlık mikroskop (adım 2.2.8) kullanılarak 10X büyütmede parçacıklarının kollajen gömülü.
   NOT: Satılıkdaha uzun süreli canlı hücre deneyleri, ısıtılmış bir mikroskop aşamasında ve _CO2 düzenlenir odası 37 ° C'de parçacıklarının ve% 5 _CO2, görüntüleme sağlamak için kullanılabilir.
2. Çevredeki kolajen ve her zaman noktasında işgal ortalama mesafe içine işgalci hücrelerin sayısını ölçmek için böyle ImageJ gibi yazılımları kullanarak invazivliğini ölçmek.

Invasion 4. Niceleme: Canlı Hücre Leke ile Floresan Mikroskopi

1. Adım 2.2.8 Aşağıdaki gibi DAPI, Calcein AM, ya da üreticinin talimatlarına göre hücre hattına uygun diğer hücre izleme bileşik olarak bir floresan boya ile oda slaytlar orta tamamlar.
   Not: invaziflik ölçümü için, sfero boyunca homojen boyama gerekli değildir. leke derin nüfuz, uzun inkubasyon gerektiren uygulamalar için (> 3 saat) gerekli olabilir.
2. leke çıkarın ve 500 uL sıcak 1x PBS ile değiştirin. İçinde10 dakika için 37 ° C 'de cubate Boya fazlasını uzaklaştırmak için. İki kez en az tekrarlayın.
3. bir floresan mikroskop kullanılarak, işgalci sferoidler aracılığıyla optik bölümleri kazanır.
   Not: lazer ışığına uzun süre maruz fototoksisite ve photobleaching sınırlamak için tekrar eden görüntüleme sırasında en aza indirilmelidir.
4. sfero toplam alanı ölçmek için kullanılabilecek bir Z çıkıntı oluşturmak için, ImageJ olarak yazılımını kullanarak, akın eden hücre, ve mesafe sayısı kollajen matris işgal.
5. Bir örnek olarak, istila ölçmek için, yalnızca sfero ve hücreleri istila vurgulama, arka plan dahil ve bunların alanı ölçmek için görüntü eşik ayarlayın. Orijinal sfero alan invazivliğini ölçmek için bu toplam çıkartılabilir.

Invasion 5. Niceleme: İmmünofloresan

Not: kullanımı remo önce, tüm çözeltiler ve tamponlar, 0.45 um'lik bir filtreden geçirilmesi gerektiğiniolumsuz boyama etkileyebilir enkaz, ettik.

1. PBS ⁺ yıkama tamponu hazırlayın. 1x PBS hazırlamak ve 0.1 mM nihai bir konsantrasyona kadar _CaCl2 ve _MgCI2 ilave edin. _CaCl2 ve _MgCl2 eklendikten sonra tampon otoklavlamayın. Çözelti filtre ile sterilize edilmiş ve oda sıcaklığında depolanabilir.
2. nötr tamponlu formalin (NBF) tespit tampon hazırlayın. 0.6 gr paraformaldehid ile 1 M NaOH 5 damla ekleyin. PBS ⁺ 20 mL'ye getirilmektedir ve paraformaldehit (yaklaşık 1 saat) eriyene kadar 60 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığına soğutulur ve 1 M HCI ile pH 7.4 ayarlanır.
   NOT: NBF tespit tampon kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
3. büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile bloke tamponu hazırlayın. Ağ / hac% 3 PBS ⁺ BSA içinde çözündürülür. Çözelti filtre sterilize edilir ve birkaç gün boyunca 4 ° C'de saklanır, ancak en taze hazırlanmış olabilir. ısı etmeyin.
4. Permeabilization tampon hazırlayın. Triton X-100 ile seyreltilirPBS ^+% 0.2 h / v.
   Not: permeabilizasyon tamponu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
5. İsteğe bağlı olarak, Mowiol montaj orta hazırlayın. 2,4 g Mowiol, 6 gr gliserol ve 6 ml ultra saf H, oda sıcaklığında, bir döndürücü 3 saat boyunca ₂ O Karışım birleştirin. 12 mL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) eklenir. 10 dakika boyunca 50 ° C'de karıştırılarak inkübe edilir.
   1. 15 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüje çözünmeyen malzeme peletlendi. Anti-ağartma maddesi, örneğin,% 2.5 DABCO ekleyin. -20 ° C'de 500 uL alikot saklayın.
6. Sferoidlerin İmmünfloresan boyama (Şekil 5)
   NOT: Yavaş yavaş odacık slayt sıvıları eklemek veya kaldırmak için bir pipet kullanın. Bu kollajen tabakasını bozabilir gibi bir aspiratör kullanmaktan kaçının.
   1. parçacıklarının hazırlanması ve 2 'ye kadar 1 de tarif edildiği gibi, kollajen dolu oda slaytlar yerleştirin.
      NOT: Kollajen otofloresansı ince tabakalar veya c küçük hacimli kullanılarak minimize edilebilirollagen.
   2. Her bölme slayt mümkün olduğunca kültür ortamı çıkarın.
   3. Kısaca artık orta kaldırmak için 500 uL PBS ⁺ yıkama tamponu ile kollajen tabakası durulayın.
   4. Her bir oyuğa 500 ul taze bir PBS ⁺ yıkama tamponu ilave edin ve sferoidler yıkamak için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. İki kez tekrarlayın.
   5. 500 uL NBF tespit tamponu ile PBS ⁺ yıkama tamponu değiştirin. 25 dakika - 20, oda sıcaklığında inkübe edilir.
   6. NBF tespit tamponu çıkarın ve 500 uL PBS ⁺ yıkama tamponu ile durulayın. Taze PBS ⁺ 5 dakika boyunca 3 kez yıka en az yıkama tamponu.
      Not: Sabit sferoidler için birkaç gün taze PBS ⁺ yıkama tamponu içinde 4 ° C de muhafaza edilebilir. % 0.01 sodyum azid depolama esnasında mikrobiyel gelişmeyi engelleyecek kadar yıkama tamponu ilave edilebilir.
   7. PBS ⁺ 500 uL permeabilizasyon tamponu yıkama tamponu değiştirin. 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   8. bloklama tamponu 500 uL BSA ile permeabilizasyon tamponu yerine ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
      1. İsteğe bağlı olarak, BSA engelleme tampon kaldırmak. neşter veya makas, tüketim parçacıklarının ve kollajen tabakası çevreleyen 3 mm x 3 mm alanını kullanarak. Geniş delik P1000 ucu kullanarak, taze BSA engelleme tamponu ile hafifçe durulama kollajenin eksize bloğu yerinden. 1.5 ml tüp kollajen blok aktarın.
      2. 2 dakika süreyle 2000 xg'de Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. Tüp dikkatle aşırı sıvı uzak fitil temiz kağıt havlu üzerine ters olabilir.
   9. sferoidler birincil antikor ekleyin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Tüm kollajen tabakası eşit şekilde daldırılmış, öyle ki birincil antikor yeterli hacim. Yukarıdaki isteğe bağlı adımlar (5.6.8.1-5.6.8.2), tipik olarak antikorun küçük hacimlerde kullanımına izin verir.
   10. En az 10 ml PBS ⁺ yıkama buf ile bir kapta odası slayt Batmak10 dakika için fer yıkamak. İki kez en az tekrarlayın.
       1. Sferoidler önce kollajen tabakası (Aşama 5.6.8.1) kesilip eğer isteğe bağlı, 1.5 ml tüp tampon hafifçe ajite yıkama 1 mL PBS ⁺ en az ekleyin. 10 dakika en az bekletin.
       2. Mümkün olduğu kadar PBS ⁺ yıkama tamponunu çıkarın ve iki kez az yıkama tamponu PBS ⁺ ile yıkama tekrarlayın. Birkaç dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin kolajen blok pelet.
          NOT: yıkama tamponu dalarken önce% 70 etanol ile silerek odasının slayt temizleyin dış yüzeyleri.
   11. Adımları tekrarlayın 5.6.9-5.6.10 uygun ikincil antikor kullanılarak.
       NOT: Sferoidler görüntüleme kabında doğrudan lekeli ise, 5.6.13 adıma geçin.
   12. İsteğe bağlı, sferoidler (5.6.8.1 Aşama) daha önce kolajen tabakadan kesilmiş eğer, temiz bir cam slaytlar ve% 70 etanol ile konfokal mikroskopi ile uyumlu lamelleri.
       1. O. monte etmeden önce bu adımı hemen gerçekleştirin ultra saf H ₂ kollajen blok ve tekrar süspansiyon mümkün olduğunca çok yıkama tamponu çıkarın. Su iliklerine lekeli bloklar bırakmayın.
       2. ince uçlu forseps kullanarak, kollajen blok ve cam slayt transfer kenarını kavramak.
       3. forseps kullanarak emin doğrudan kolajen dokunmamaya dikkat ederek, kollajen bloktan fazla sıvıyı fitil için temiz bir pamuklu bir bez kullanın, yerinde kollajen tutun.
          NOT: kolajen pamuklu çubukla hafifçe ya forseps kullanılarak kaldırılabilir yapışmış hale gelirse, ya da suda daldırarak.
   13. Ters pipetleme tekniği kullanarak, numune üzerinde kollajen blok ve yer lamel üzerine 100 uL Mowiol montaj orta dağıtmak.
       1. lamel altında aşırı Mowiol montaj orta ve suyu fitil bir pamuklu bir bez veya kağıt havlu kullanın.
       2. Mowiol montaj orta 4 ° gecede sertleşmesini bekleyinizoje ile lamel C. Seal kenarları.
   14. Konfokal veya floresan mikroskobu kullanarak görüntü lekeli sferoidler ilgi, invaziv yapıların oluşumu, vb (Şekil 5B, 5C) proteinlerin yerelleştirme gözlemlemek.
       Not: Boyanan sferoidler photobleaching önlemek için ışıktan korunmalıdır.

6. Anoikis Deneyi

Not: sfero oluşumu protokolü kolay hücre tiplerinin çeşitli ankrajdan bağımsız büyüme ve anoikis direnci ölçmek için adapte edilir.

1. Anoikis deneyi için tohum hücreleri (Şekil 6)
   1. Bölüm 1.4 küremsi üretimi için talimatları izleyin, ama sferoid formasyonu orta hazırlamak için, 30 mg / ml metil selüloz, en az kullanın.
      NOT: ısıtıldı zaman, 30 mg / ml metil selüloz süspansiyonu hücreleri tutan kalın bir jel oluşturmak.
   2. haftaya ve birkaç gün boyunca inkübe hücreleriBir mikroskop kullanılarak 10x büyütme düzenli bir tek-. anoikis karşı Hücreler çoğalmaya ve koloniler oluşturmalıdır.
   3. her bir oluşan kolonilerin sayısı ve büyüklüğü ölçülerek anoikis ölçmek.
      Not: koloniler oluşturulmuştur sonra, metil selüloz çıkarmak için yıkanabilir ve tarif edildiği gibi küremsi bazlı deneyler için de kullanılır.

Results

Bu hücre itici plakaları ve MC ile takviye sferoid formasyonu ortamını kullanarak ayn sferoidler oluşturmak için esnek ve etkili bir yöntem tarif eder. MC ve serum uygun koşullar altında, tek tek hücreler yerleşmek ve de alt az vermeden parçacıklarının oluşturulması için iyi merkezine bir araya yapışır. Bu protokol kullanılarak, küremsi hücre çizgileri, çeşitli (Şekil 2B) elde edilmiştir. MC ve serum titrasyonu tek bir küremsi parçalamadan manipülasyon sağlamak için yete...

Discussion

Biz ucuz ve yaygın olarak kullanılan reaktifler kullanılarak in vivo dokuların mimarisi model 3D hücre parçacıklarının üretilmesi için hızlı ve esnek bir yöntem mevcut. Bizim protokol MC ^{8, 9} sitotoksik olmayan yapışkanlık arttırıcı özellikleri hücre toplama aracılık etmek ve hücre tekli-tabakası oluşumunu en aza indirmek için patlatır. hayvansal kaynaklardan izole edilmiş protein bazlı matrisler farklı olarak, MC, inert olan herhangi bir büyüme faktörl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamponlar< / güçlü >
10x Fosfat tamponlu tuzlu su	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Kalsiyum Klorür Çözeltisi	Sigma-Aldrich	21114	PBS+ yıkama tamponu için kullanılır; Kalsiyum klorür ilavesi üzerine PBS+ yıkama tamponunu otoklavlamayın
Magnezyum Klorür Çözeltisi	Sigma-Aldrich	M1028	; Magnezyum klorür ilavesi üzerine PBS+ yıkama tamponunu otoklavlamayın
Name	Company	Katalog numarası	Yorumlar
Küresel Oluşum İçin
96 kuyulu U-dipli Hücre İtici Plaka	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 hücre hatlarını kültürlemek için
F12K Orta	Thermo Fisher Scientific	2112722	TT hücre hattını kültürlemek için
Fetal Sığır Serumu	Sigma-Aldrich	F1051	Partikül kirleticileri gidermek için kullanmadan önce
filtre Metil selüloz	Sigma-Aldrich	M7027	100 mg / mL'ye kadar suda hazırlayın
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	HCT-116, BxPC-3 hücre hatlarını kültürlemek için
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Ayrışma
tamponuName	>Company	Katalog numarası	Yorumlar< / güçlü > <
güçlü > İstilacı Testi için< / güçlü >
Sığır Tip I Kollajen	Corning Incorporated	354231	Stok 3.1 mg / mL; Kullanım sırasında buz üzerinde bakım yapın
DMEM Fenol Kırmızı İçermeyen Düşük Glikoz	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Fenol Kırmızısı takviyeli ortama kıyasla daha az arka plan floresansı
Glial Hücre Hattı Türetilmiş Nörotrofik Faktör	Peprotech	450-10	Kemoatraktan
Name<	strong>Company	Katalog numarası	Yorumlar
İmmünofloresan Mikroskobu için
#1.5 Coverglass Elektron	Mikroskobu Bilimleri	72225-01	Eksize edilmiş sferoidleri monte etmek için
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	1:200'de aktini boyamak için kullanılır
Sığır Serumu Albümini Bioshop	Canada Incorporated	ALB001	BSA bloke edici tamponda kullanılır
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Gliserol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	MOWIOL montaj ortamında kullanılır
ImageJ Yazılımı	Ücretsiz, NIH-Görüntü		analizi için kullanılır
Microslides	VWR International	48312-024	Eksize edilmiş sferoidlerin montajı için
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	MOWIOL montaj ortamında kullanılır
Paraformaldehit	EMD-Millipore	PX0055-3	Sabitleme tamponunda kullanılan
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Geçirgenlik tamponunda kullanılır