Burada pulmoner tüberküloz lezyonlarından ve boşluklardan alınan kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçmek için hızlı bir denge diyaliz (RED) yöntemi anlatılmaktadır. Protokol, aynı zamanda, kaseum için etkili bir vekil olan köpüklü makrofaj kaynaklı bir matriste de kullanılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Tüberküloz hastalığının ortadan kaldırılması, kompleks pulmoner lezyonların çok katmanına nüfuz edebilen ilaç rejimleri gerektirir. Çukurların ve lezyonların kazeöz damarlarındaki ilaç dağılımı, özellikle persistan olarak da adlandırılan uyuşturucuya dirençli bakterilerin alt popülasyonlarını barındırdığı için çok önemlidir. Tüberküloz lezyonlarında ilaç penetrasyonunun ölçülmesine ilişkin mevcut metotlar, biyoanalitik veya görüntüleme teknikleriyle birleştirilen yüksek maliyetli ve zaman alan in vivo farmakokinetik çalışmaları içerir. Kozmetik makromoleküllere bağlanan ilacın in vitro ölçümü, bu tür teknikler için bir alternatif olarak önerildi çünkü bu bağlanma, ilaç moleküllerinin kaseum yoluyla pasif difüzyonunu engelledi. Hızlı denge diyalizi plazma proteini ve doku bağlama çalışmalarında hızlı ve güvenilir bir sistemdir. Bu protokolde, kazanın homojenatlarına ilaç bağlanmasını ölçmek için hızlı denge diyaliz (RED) cihazı kullandık.Tüberküloz ile enfekte tavşanların lezyonlarından ve boşluklarından türetilmiştir. Protokol ayrıca, kaseum yerine kullanılacak lipid yüklü THP-1 makrofajlarından bir vekil matrisi nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu kaseum / vekil bağlanma testi, tüberküloz ilaç keşfi için önemli bir araçtır ve lezyonlarda veya apselerde diğer hastalıkların yol açtığı ilaç dağılımının araştırılmasına yardımcı olmak için uyarlanabilir.
Giriş
akciğer tüberkülozu hastalığının tedavisi lezyonlar farklı içine ilaç etkin dağıtım gerektirir. Nekrotik lezyonlar ve boşluklar ilaç toleranslı veya 'kalıcı' bakteri alt-popülasyonunu liman peynir merkez içerir. 1, 2 kaviter hastalık alt kür oranları ve kötü prognoz ile ilişkilidir. 3, 4 önceki çalışmalar caseum nüfuz kabiliyeti önemli ölçüde bir ilaç sınıfı diğerine değişir, nicel ve görüntüleme teknikleri kullanılarak, göstermiştir. 5, 6 Ancak bu yöntemler, yavaş ve zahmetlidir hayva....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan çalışmaları NIAID Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (NIH), Bethesda, MD onayı ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. M. tuberculosis içeren tüm çalışmalarda biyo-güvenlik tutucu seviye 3 (BSL-3) ile birlikte bir laboratuarda gerçekleştirilmiştir.
1. Tavşan Enfeksiyon Modeli ve Caseum Koleksiyonu
- Daha önce tarif edildiği gibi bir sadece burundan bir aerosol uygulama sistemi kullanılarak Yeni Zelanda M. tuberculosis ile beyaz tavşan Infect. 12, 13 enfeksiyon 12....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolü kullanarak, yüzlerce tüberküloz ilaç geliştirme bileşiğini penetran kaseumda tahmin edilen etkinlikleri için test ettik. Şekil 1 , RED testinin temel kavramlarını görüntüler. RED eklentilerinin diyaliz zarları bağlanmamış kük moleküllerin donör kuyudan alıcı kuyusuna dağılmasına ve son olarak da her iki bölme arasında denge elde edilmesine olanak tanır. Proteinler veya lipidler gibi makromoleküllere bağlı olan küçük moleküller donör kuyusuna sıkışır. Her iki.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tüberkülozla enfekte hastalarda pulmoner nekrotik lezyonlar ve boşluklar, ilaç tedavisine dirençli bakteri alt popülasyonlarını içerir. Bu yapıların kazeöz çekirdeği, özellikle, bu persisörleri ekstraselüler bir ortamda barındırmaktan sorumludur. Anti-bakteriyel maddelerin bu uzak yerlere olumlu dağılımının tüberküloz ilaç etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olduğuna inanılmaktadır. Bu protokolün onaylanmasından önce, konstitüsyonel lezyonlarda ilaç keşfi bileşiklerinin dağılımını öngören mevcut in vitro tekn.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Rakip finansal çıkarlar yoktur.
Teşekkürler
Biz sırasıyla, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ve tedizolid Bedaquiline sağlamak için Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Kaburga-X ve Trius Therapeutics teşekkür etmek istiyorum. Brendan Prideaux Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin Emma Rey-Jurado Nancy Ruel, Leyan Li ve Danielle Weiner MALDI analizi, biyoanalitik yöntemler, caseum vekil hazırlanması, kimyasal sentez ve tavşan caseum izolasyonu ile destek sağlamıştır. Bu çalışma V. Dartois NIH Paylaşılan Enstrümantasyon Grant S10OD018072 yanı sıra Mükemmellik Bir Merkezi için Bill ve Melinda Gates Vakfı ve Wellcome Trust ortak finansmanı için Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından finanse ödül # OPP1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Yeni Zelanda Beyaz Tavşanları | |||
| Mycobacterium tuberculosis | BEI Kaynakları | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamin) 100 mg / mL C3N | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 56344 | |
| Anased (Ksilazin) 100 mg / mL | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 33198 | |
| Ötesol (pentobarbital sodyum ve fenitoin sodyum) Çözeltisi | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monositik hücre hattı | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm & sup2; TC ile İşlem Görmüş Şişe (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 glutamin içermeyen ortam | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hiplon Fetal Sığır Serumu, Gama ışınlanmış | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamin, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC kabı, 145 mm x 20 mm, havalandırmalı | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Etilendiamintetraasetik asit | Sigma | E6758 | |
| Oleik asit | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Cihazı Yeniden Kullanılabilir Taban Plakası | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Cihaz Ekleri, 50/kutu | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED kesici uç çıkarma aleti | Fisher Scientific | 89812 | |
| Yapışkan plaka contası | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Yaşam Teknolojileri | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Asetonitril | Sigma | 34998 | |
| Metanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hidroklorür | Sigma | V4629 | |
| Diklofenak sodyum tuzu | Sigma | 93484 | |
| Tripan Mavisi Çözelti, %0.4 | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Etanol, 200 geçirmez | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Öğütücü | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Boncuk Değirmeni Homojenizatör Aksesuarı, Metal Dökme Boncuklar | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Kobalt 60 Işınlayıcı | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Tek Kullanımlık Hemasitometreler | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Dik Işık Mikroskobu | Leica | DM1000 | |
| İkili Sıvı Kromatografisi sistemi | Agilent | 1260 | Çok bileşenli |
| Kütle spektrometresi | AB Sciex | 4000 |
Kaynaklar
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
