Burada Drosophila larvalarının soğuk nosisepsiyon incelemek için yeni bir test göstermektedir. Bu deney, bir fokal zararlı soğuk uyan uygulamak edebilen özel bir dahili Peltier prob kullanır ve ölçülebilir soğuk belirli bir davranış ile sonuçlanır. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon başka hücresel ve moleküler diseksiyon sağlayacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili
Bu makalede
Özet
Özet
Nasıl organizmalar algılayıp hala tam olarak anlaşılamamıştır zararlı sıcaklıklara yanıt verirler. Bundan başka, örneğin periferik nöropati veya hasar kaynaklı hassasiyete geçiren hastalarda duyu makine hassasiyete, altında yatan mekanizmalar iyi karakterize değildir. Genetik olarak uysal Drosophila modeli, zararlı ısı tespiti için gerekli hücreleri ve genlerin çalışma için kullanılmıştır hangi ilgi birden fazla korunmuş genleri vermiştir. Küçük hücreler ve zararlı soğuk algılama için önemli reseptörler hakkında ancak bilinmektedir. Drosophila soğuk sıcaklıklarda (≤10 ºC) uzun süre maruz hayatta etmez ve zararlı soğuk uyarıcıları onlar anlamda nasıl davranış tercihi deneylerde, daha sıcak sıcaklıklar tercih serin önlemek ve muhtemelen önleyecektir rağmen ancak son zamanlarda incelendi.
Burada tarif ve ilk zararlı soğuk (≤10 ºC) davranışsal tahlil karakterizeDrosophila. Bu aracı ve analizi kullanarak, kalitatif ve kantitatif olarak soğuk nosiseptif davranışlar değerlendirmek için nasıl bir müfettiş göstermektedir. Bu hastalık, yaralanma ya da duyarlılık bağlamında muhtemelen normal / sağlıklı kültür koşulları altında yapılabilir ya da edilebilir. Bundan başka, bu deney thermosensation, ağrı veya nosiseptif duyarlılığın etkileyebilir istenen genotipler, seçilen larvalarına uygulanabilir. ağrı ayrıca muhtemelen omurgalılar dahil diğer türlere, ağrı süreçlerinin önemli bir anlayış toplamaktadır olacak ısı nosisepsiyon incelemek için bu tahlil kullanılarak, yüksek düzeyde korunmuş bir süreç olduğu göz önüne alındığında.
Giriş
Drosophila yeni korunmuş genler ve karmaşık davranışlar temelinde yatan nöronal devrelerin tanımlanması için yüksek ölçüde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sinekler gelişmiş bir genetik araç ve nosisepsiyon 5, 6, 7 hücresel ve moleküler bazları incelemek için genetik ve nöronal manipülasyon, 1, 2, 3, 4 izin basitleştirilmiş sinir sistemi sağlar. Larvalar, yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10, zararlı ısı 11, 12, 13 ve zararlı uyarıcıya 4 mekanik hissi için davranışsal deneyleri göz önüne alındığında, bu analizler için özellikle yararlıdır 11 zaten kurulmuş ve şeffaf larva kütikül epidermis ve altta yatan duyusal nöronların canlı veya sabit görüntüleme için izin verir edilmiştir. Son zamanlarda, zararlı soğuk için bir tahlil de burada daha detaylı olarak tarif 7, geliştirilmiştir.
Ince, konik uçlu soğuk probu kullanarak, göstermektedir, ya da sert bir mekanik ya da yüksek sıcaklık uyaranlara 7, 8 sonra, 11 Drosophila larvaları sergilerler yumuşak bir dokunuş sonrasında normal hareket sırasında gözlenen davranışlar farklıdır soğuk spesifik reaktif davranışlar, bir dizi olduğu . Soğuk özgü davranış sağlam bir tam vücut kasılması (BT), bir U-şekli (ABD) içine arka segment (PR) ve ön eş zamanlı bir zam ve posterior segment 45-90º zam bulunmaktadır. Bu davranışların sıklığı düşen sıcaklıklar ama s, her tepe ile artarHafif farklı soğuk sıcaklıklarda. Son çalışmalar, BT tepkileri zararlı ısı veya sert mekanik uyarıcılara 7 cevap verdiği, bu daha farklı, periferal sensor nöronların aracılık olduğunu göstermektedir.
Çok omurgalı nosiseptörlerin gibi, Drosophila birden fazla dendritik (md), periferal duyu nöronları epidermis üzerinde 1 arborize kompleks dentritik yapılara sahiptir. MD nöronlar ventral sinir kablosu 14 aksonları çıkıntı, her larva gövde bölümünün içinde mevcut bulunmaktadır. MD duyu nöronları dendritik morfolojiye göre dört farklı sınıflarına (I-IV) ayrılır ve duyusal fonksiyonları 4, 9, 10, 15, 16, 17 değişken adres. sınıf IV nöronlar larva lateral vücut rulo tepkileri için gerekli ikenyüksek sıcaklıklarda veya sert mekanik uyarıcılara 4, sınıf III nöronlar yumuşak bir dokunuş yanıtları 9, 10 için gereklidir ve sadece soğuk ile aktif hale getirilmediği, fakat aynı zamanda soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri 7 için gereklidir. Her iki sınıf III ve sınıf IV nöronlar uyaranlara 9, 10, 17, 19 7, 11, 18, zararlı ve zararlı olmayan davranışsal tepkileri kolaylaştırmak ayrı geçici reseptör potansiyel (TRP) kanal kullanmaktadır. Bundan başka, larva nosisepsiyon 20, hücresel ve davranış seviyelerinde 12, 21, aşağıdaki yaralanması hassaslaştırılır.
Burada tarif edilen deney, quantificatio sağlarNormal ya da potansiyel iki n ortam sıcaklıklarında (18-22 ° C) için, zararlı soğuktan (10 ° C '≤) kadar düşük sıcaklıklarda, zararsız serin (11-17 ° C) için davranışsal tepkileri değiştirmiştir. Bu tahlilde kullanılan soğuk sıcaklıklarda, doğrudan, sınıf III duyu nöronlarını aktive edici nitelik olabilir ve niceliksel olarak 7 analiz edilebilir sağlam ve tekrarlanabilir kalsiyum artar ve soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu deney, soğuk nosisepsiyon, nosiseptif duyarlılığın veya nosiseptif plastisite etki, genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi çeşitli çevre koşullarına maruz larvası (değiştirilmiş beslenme, yaralanma, farmakolojik maddelere) yanı sıra hemen hemen herhangi bir genotip larvalarına uygulanabilir. thermosensation çok canlı üzerindeki her yerde olduğu göz önüne alındığında, bu deney, nosisepsiyon çalışma için değerli bir araç sağlar ve yeni gen hedefleri veya artıracak nöronal etkileşimleri ortaya çıkarabiliromurgalı nosisepsiyon anlayışımız.
Özel oluşturulmuş soğuk prob (soğuk prob, Malzemelerin Tablo) termal iletim yoluyla alüminyum şaft ve konik ucunu soğutur, Peltier cihazı, kontrol edilen bir kapalı döngü sıcaklığı kullanmaktadır. Termistör alüminyum konik ucu içine gömülü olduğu kontrol birimi gerçek zamanlı sıcaklığını gösterir. Bir soğutucu ve fan (Termal Kontrol Ünitesi, Malzemelerin Tablo) elde edilebilir Peltier tesir ısı yükü (Qc) böylece (22-0 ° C) istenen sıcaklık aralığı ayarlamak için termoelektrik modül eklenir. Soğuk prob ucunun zararlı soğuk uyaran, ön ve arka uçlarından eşit uzaklıktaki segmenti (lar), sırt orta çizgisi için elle uygulanır larva (kabaca kademeli A4, Şekil 1A bakınız). Soğuk uyaranlara yanıt olarak, larva genellikle 10 s kesim içinde üç soğuk hatırlattığı hareketler birini üretmek: tam gövdekasılması (BT), bir U-şekli (ABD) ya da (Sonuçlar tarif edilmiştir) arka segment (PR) bir zam içine anterior ve posterior segment bir 45-90º kaldırmak. Bu davranışların hiçbiri, normal peristaltik hareketin veya yem arama davranışı sırasında gerçekleştirilir. Bu davranışlar da yumuşak bir dokunuş tepkiler ve yüksek sıcaklık veya zararlı mekanik uyarıcılara verdikleri caydırıcı haddeleme yanıt farklıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Larva 1. Hazırlık
- 25 ° C kuluçka makinesi içinde stokları ya da genetik haç kaldırın.
- ortasını kültür durumunda, 20-25 bakire dişi ve düzenli mısır unu uçucu ortamı ihtiva eden şişe başına 15-20 erkek kullanın. dişiler yiyecek yeni şişeye transfer etmeden önce yaklaşık 48 saat yumurtalarını bırakmak için izin verin.
- 4-5 gün yumurta yumurtlama sonra yavaşça aşırı duygusal yiyecek ve larvaları içine su akışı püskürtme istenen genotip 3. instar larvaları toplamak ve orta büyüklükte temiz Petri çanağı içine içindekileri boşaltmak (60 mm x 15 mm).
- Sonra, yavaşça test edilmesini büyük "dolaşıp 3. instar" ya da küçük hastalıklı larva engel olmak boyut kullanarak forseps veya bir fırça ile larva sıralamak. istenmeyen herhangi bir genetik marker ya da dengeleyici içeren sil larva.
- deneyci ex "kör" olabilir, böylece sıralanmış larvalar koyulacak bir adam laboratuvar elemanı etiket yemekleri veya kapları varperimental koşul veya varsa larva genotipi. deneyci bir laboratuvar üyesi tarafından oluşturulan bir anahtar kullanarak deneme sonrasında toplanan verilere kodu çözülmüş etiket uygulayabilirsiniz.
- Bir scoopula kullanılarak, (35 mm x 10 mm veya 60 mm x 15 mm), oda sıcaklığında su ile temiz, etiketlenmiş bir Petri çanağı dolu yarı yolda taze gıda bozuk para büyüklüğünde aktarın.
- forseps veya fırça kullanarak hafifçe gıda üzerine sıralanmış larvaları hareket (test fazla 20 dk almak bekleniyorsa, açlık veya kuruma önlemek için).
2. Soğuk Sonda Denemesi
- burada arzu edilen sıcaklığa kadar soğumaya için birkaç dakika izin soğuk prob birimi açın. daha düşük sıcaklıklar için ayarlama, yoğunlaşma muhtemelen sonda boyunca oluşturacaktır.
- Bir laboratuvar ile fazla nemi silin larva uygulanmadan önce silin. acil kullanımda, yer izole edin sonda üzerinde tecrit başlığı ve temiz ucu tutmak ve zarar görmesini önlemek için değil zaman.
- Koyu hareket edebilen vinil ince bir parça üzerine bir orta 3. instar larva yerleştirin parlak alan mikroskobu altında (tipik olarak, bir dizüstü bilgisayar bağlayıcı kesilen küçük bir parça kullanın). Kontrast görüntüleme ve bu sonda ile doğru hizalamak için dokunmadan larva hareket siyah vinil yardımcı olur.
- Kontrast sağlayan ve çok hızlı bir şekilde kurumasını larva önlemek için mikroskop (Malzemelerin Tablo) ve orta parlaklık (% 50-75 maksimum parlaklık) ışık birimi (Malzemelerin Tablo) ayarlayın.
- onlar sonuçları katkı yapabilen olarak önce normal peristaltik lokomosyonunu göstermezler herhangi larvaları atın. su Petri kabı, aksi larva, normal lokomosyon inhibe vinil sopa gelen larva nemli olmalıdır. Su larva etrafında oluşan su birikintileri olmamalıdır.
- cor içine larva taşımak için vinil kullanılarak, ön-arka gövde eksenine 90 ° bir açı ile larva doğru elle sonda Advancerect pozisyon (Şekil 1A bakınız).
- Orient probunun ucu hafifçe prob mikroskop aşamasına, yaklaşık olarak 45 ° açı ile larva orta sırt yüzeyi boyunca sunmaktır.
- Sonda temas ettiği zaman, bir laboratuvar zamanlayıcı başlatmak. yine öne veya arkaya doğru hareketi verirken hafif larva üst derinin yüzeyini girinti kadar aşağıya doğru basınç uygulanır.
- En fazla 10 s için ya da bir soğuk-uyarılmış davranış cevabı görülmektedir kadar yerinde probu tutun - hangisi önce meydana gelirse. Daha sonra sonda çıkarın.
- gözlenen davranışsal tepkisi ve tepki gecikmesini kaydedin. 10 saniye içinde yanıt yok Larva "yanıt vermeyenler" olarak kabul edilir. Gecikme ayrıca yanıt için kaydedilir ve yanıt sağlamlığı / genlik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.
- larva atın ve bir sonraki hazırlar.
- Test larva istenilen sayıda (n üç grup ulaşılıncaya kadar tekrarlayın 2,3-2,11 adımları = 20-40 larva u idi) Buraya sed.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ara sıra duraklamaları, baş döner, ve yön 22'de değişiklikleri içeren bir peristaltik hareketi ile Drosophila larvaları hareket. fokal ancak zararlı soğuk uyarıcının uygulanması, larva sergi zararlı ısı ve mekanik uyarıcılara karşı caydırıcı yatay rulo farklı kendine has davranışlar, bir dizi yanıt olarak. Bu davranışlar yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10 ya da oda...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tarif edilen deney, nitel ve nicel olarak, çeşitli genetik geçmişlerde, çevresel etkiler, ve / veya hasar kaynaklı durumların larvaları nosisepsiyon veya nosiseptif hassasiyete değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu deney, bu araç ile soğuk bir uyarıcı odak uygulama için izin verdiği bir özellikle düşük ısılara yanıt, periferal sensor nöronların bir alt fonksiyonunu değerlendirmek. İlginç bir şekilde, bu soğuk uyarılmış davranışlar ısı 7, 11 tarafından...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
A Amerika Birleşik Devletleri patent başvurusunda, (CL) soğuk prob tasarımına devam etmektedir. Soğuk prob parça numaraları ve inşaat ayrıntılarına bilgiye yanı sıra aracı tasarımına ek danışmanlık talep üzerine temin edilecektir.
Teşekkürler
Biz eleştirel el yazması okumak için soğuk prob deneyine, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyelerinin erken aşamasını geliştirmek için Sarah Wu ve Camille Graham teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NRSA HNT için (NIH F31NS083306) tarafından ve NIH R01NS069828, R21NS087360 ve MJG Temel Araştırma Texas MD Anderson Clark Fellowship bir üniversite tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Soğuk Prob | Pro-Dev Mühendisliği | Talep üzerine özel yapım | Parça numaraları ve yapım detayları istek üzerine sağlanabilir |
| Termal Kontrol Ünitesi | TE Teknolojisi | Özel Yapım muhafaza | Parça numaraları ve yapım detayları istek üzerine sağlanabilir |
| Zeiss Stemi 2000 mikroskop | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 Yüksek Yoğunluklu Aydınlatıcı | Dolan-Jenner Endüstrileri. | A20500 | |
| Schott Çift Deveboynu 23 inç Fiber Optik Işık Kılavuzu | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forseps | FST | FS-1670 | Larvaları sıralamak ve işlemek için kullanılır. Larvaları kazara delme veya yaralama riskini azaltmak için forseps uçlarını hafifçe düzleştirdiğinizden ve |
| Boya Fırçası | Dick Blick Sanat Malzemeleri | 06762-1002 | Larvaları sıralamak ve işlemek için kullanılır. Kullanım sırasında boya fırçasının nemli olması faydalıdır. |
| 35 mm x 10 mm Polistiren Petri kabı | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polistiren Petri kabı | Falcon | 351007 | |
| Siyah vinil parçası (en az 2 inç x 2 inç) | Kontrast sağlamak ve larvaları soğuk proba yönlendirmek için kullanılır | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Yiyecekleri taşımak için kullanılır |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Aşırı nem varsa larvaları ve soğuk probu kurutmak için kullanılır |
Kaynaklar
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837(2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343(2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39(2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735(2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
