Yöntem makalesi

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

10.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55585

⸱

17 Nisan 2017

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Bu makalede

Özet

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Özet

Lipid damlacıkları viryon morfojenezinin varsayımsal bir site olarak, farklı patojenlerin, en belirgin Hepatit C Virüsü (HCV) replikasyonu için hayati önem taşır. Kantitatif lipit damla proteom analizi lokalize ya da virüs enfeksiyonları gibi koşullar altında lipid damlacıkları yer değiştirir proteinleri tanımlamak üzere kullanılabilir. Burada başarılı HCV enfeksiyonu takiben lipid damlacığı proteomu değişiklikleri karakterize etmek için kullanılan edilmiş bir protokol açıklar. Bu hücre kültürü (SILAC) Amino Asitler ile kararlı İzotop Etiketleme kullanmakta ve böylece, kütle spektrometresi ile proteinlerin miktarını belirlemek için "ağır" amino asitler ile hücreler popülasyonu tamamen Proteomun etiketleyin. 1 ve hipotonik tampon maddesi içinde mekanik olarak parçalanmıştır: lipit damla izolasyonu için, iki hücre popülasyonları (örneğin, HCV ile enfekte olmuş / "hafif" terimi, amino asitler ve enfekte olmamış kontrol / "ağır" amino asit) 1 karışımı karıştırılır. çekirdek ve hücre d çıkarılmasından sonradüşük hızlı santrifüjleme ile ebris lipit damla bağlı proteinler, izotonik tampon içinde üç yıkama safhası ile takip iki ardışık ultrasantrifügasyon adımlarla zenginleştirilmiştir. lipit damla fraksiyonların saflığı farklı hücre içi bölmelere tanıyan antikorlar ile Western blot ile analiz edilir. Lipit damlacık ilişkili Bundan sonra proteinler Coomassie boyama ile takip edilen SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılır. triptik sindiriminin sonra, peptidler, sıvı kromatografisi-elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS / MS) ile kantifiye edilir. Bu yöntemi kullanarak, biz yanlısı veya antiviral konak faktörleri temsil edebilir HCV enfeksiyonu üzerine lipid damlacıkları ile işe proteinleri belirledi. Önerilen yöntem, bu tür patojen ile enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi çeşitli hücreler ve kültür koşulları, çeşitli uygulanabilir.

Giriş

Lipid damlacıkları oldukça nötr lipidlerin bir çekirdekten oluşan dinamik sitoplazmik (ve nükleer) hücre organelleri (trigliserit (TG) ve kolesterol ester (CE)) gömülü protein 1 ile birlikte fosfolipitlerin bir tek tabaka ile kaplanır. Tüm hücre tipleri lipid damlacıkları üretmek, ancak, ebat, lipid bileşimi ve protein dekorasyon değişir. Lipid damlacıkları enerji ve membran ön-madde rezervuar ya da protein birikintilerinin olarak hizmet dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonları yerine getirirler. Buna ek olarak, lipid alımı ile, bu sinyal molekülleri lipotoksisite hücreleri, salma lipidler korumak ve protein bozulması ve endoplazmik retikulum (ER), stres tepkileri 2 katılmaktadırlar. Bu şekilde, bir protein konakçı lipid damlacıkları bağlanan ve diğer organellere ile üretimi, bozulma, ticareti ve etkileşimi idare. Bunlar arasında (PLIN1-5) iyi niyetli lipit damlacığı bağlayıcı proteinlerin perilipin ailesidirf "> 3.

Lipit damlacık biogenesis muhtemelen nötr lipidlerin bir lens, son maya 4 güzel görselleştirilmiştir bir oluşturma yöntemi, ER-yerleşik enzimler membran çift katman içinde birikir nötral lipidlerin sentezini katalize eden ER, başlar. Bükme Membran ve yüksek fosfatidik asit ve diasilgliserol seviyeleri daha sonra lipit damlacık oluşturma 5 için gerekli olan temel nötral lipitler ve koruyucu fosfolipidlerin eşzamanlı sentezi, fosfolipid biyosentezinde yer alan proteinleri çekmek için düşünülmektedir. ER ikamet transmembran etki barındıran enzimler bu işlemi katalize eder. büyük lipid damlacıkları Genişleme bir amfipatik heliks liman ve böylece lipid damlacıkları ER'den hareket edebilir lipid sentezleyen enzimlerin farklı sınıfının aktivitesini gerektirir. lipid damlacıkları lipidlerin harekete trigliserit lokal aktivasyonu yoluyla meydana gelirE ve diasilgliserol lipazlar yağ trigliserit lipaz (ATGL) hormona duyarlı lipaz (HSL) veya makro ve microlipophagy veya farklı otofajik yollar ile otofajiyi 6 dolayımlı şaperon. Lipid damlacıkları ve ER (beta-oksidasyon ve lipid sentezi için) olarak mitokondri gibi diğer hücresel organeller, etkileşime girmez, fakat (lipid sentezi ve protein göçünü gibi) da lizozomun endozomlarda, ve hücre içi bakteri 7 ile uyarılan vakuollü. Gerçekten de bakteri, virüs ve hatta parazitler, bunların HCV 8 arasında replikasyon ve kalıcılığı için lipid damlacıkları hedefler.

HCV enfeksiyonu yılı 9 başına yaklaşık 0,5 milyon ölüme muhasebe dünya çapında karaciğer ile ilişkili morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. HCV enfeksiyonlarının gerçek sayı bilinmiyor, ancak son tahminler 130 düşündürmektedir - 150 milyon insan kronik olarak enfekte olmaktadır. hiçbir vaccinE var, ancak son zamanlarda onaylanmış direkt etkili antiviraller büyük ölçüde standart interferon-bazlı terapi ile karşılaştırıldığında tedavi edici müdahalelerin artırılması. Ancak, dünya çapında hastaların tedavi olasılığı nedeniyle yeni tedavilerin son derece yüksek maliyetlere sınırlandırılacaktır. Tüm bireylerde yaklaşık yarısı kronik karaciğer yağlanması hastalığı (steatoz), hepatositlerde lipid damlaları aşırı birikimi ile karakterize edilen bir durum geliştirme HCV ile enfekte edilmiştir. İlgi çekici bir lipid damlacıkları farazi viral montaj alanlarında 10, 11 olarak işlev gören, HCV replikasyonu için hayati hücresel organellere ortaya çıktı.

HCV ile enfekte olmuş hücrelerde viral protein çekirdek ve NS5A diasilgliserol asiltransferaz-1 (DGAT1) inhibitörleri olarak, trigliserid biyosentezi üzerinde bağlı olan bir süreç içinde lipid damlacıkları lokalize lipid damlacıkları ve daha sonra, HCV partikül üretimi 12 kaçakçılığı zarar >, 13, 14, 15. Buna ek olarak, iç kısmın veya NS5A ya lipit damla bağlayıcı bölgeleri mutasyonlar HCV düzeneğinin 16, 17 bastırır. Çekirdek ve NS5A sonra yakından 16 damlacıklar lipit bağlantılı zarlara, diğer viral proteinler, ve aynı zamanda viral RNA replikasyon komplekslerinin işe. Tüm viral proteinlerin bir uyumlu eylem enfeksiyöz viral döl 10, 11 başarılı üretimi için gereklidir. yapısal proteinler viryonların parçasıdır ve yapısal olmayan proteinleri, bu işlem için gerekli protein-protein etkileşimlerini kolaylaştırmak. İlgi çekici hakiki lipit damla bağlayıcı protein PLIN3 / TIP47 hem HCV RNA replikasyonu ve virionlar 18 serbest bırakılması, 19 için gerekli olan 20. Bu son gelişmelere rağmen, özellikle HCV replikasyonu geç evrelerinde virüs konak etkileşimlerin mekanik detayları, düzensiz sınırlı kalır ve lipit damlacıklarının kesin işlevi bilinmemektedir.

Burada, ilişkili proteinlerin kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, lipid damlalarıyla-böler co ve etkili HCV olgunlaşması 21 için gerekli olan bir konakçı proteini olarak, HCV enfeksiyonu sırasında lipit damla proteomu derin değişiklikler ve tanımlanan anneksin A3 bulundu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hücre Kültüründe Amino Asitler ile Kararlı İzotop Etiketleme (SILAC) için Medya 1. Hazırlık

Not: Burada, SILAC protein kantitasyonu Takımı - DMEM SILAC etiketlenmesi için kullanılmıştır 13 C6 L-Arginin-HCl 50 mg ile takviye edilmiştir. diyalize edilmiş fetal dana serumu (FCS) SILAC protein kantitasyonu Kit ile sağlanır.

  1. DMEM ortamı her bir şişeden 50 mL çıkarın ve diyaliz edilmiş FCS, 50 ml.
  2. 13C 6 L-Lizin-2HCI 50 mg ve ortamın 1 mL 13 C6 L-Arginin-HCl, 50 mg çözülür. İyice karıştırın ve DEM + FCS ortamı için amino asitler ekleyin.
  3. 1x Kalem / Strep ve 1x L-glutamin yerine ekleyin. Steril-filtre, bir 0.45 um filtre kullanılarak ortam. "Ağır" SILAC aracı olarak şişe etiketleyin.
  4. L-Arginin-HCl, 50 mg L-Lizin-2HCI 50 mg ile 1.3 - "hafif" orta hazırlamak için, tekrar 1.1 adımları tekrarlayın. "Şeklinde şişe etiketleyinışık" SILAC ortamı.

2. SILAC-etiketleme ve amino asit eklenmesi kontrol

  1. Hücreleri tripsinize edin (1x Tripsin-EDTA) ve bölünmüş, 1 x 10 orta 2 mL, iyi "ağır" SILAC ortamı ile bir ve "ışık" ile bir ihtiva eden bir 6-yuvalı kültür plakasının 2 kuyulara 5 Huh7.5 hücreleri SILAC ortamı.
  2. Kültür en az 6 geçiş için hücreler (bölünme oranı: 1: 6); 6 geçişinden sonra, "ağır" terimi, amino asitlerin dahil edilmesi,% 95'ten fazla olmalıdır.
  3. Hasat "ağır" 1 x 10 6 hücre - ve "hafif" -etiketli hücre popülasyonu dahil etkinliğini analiz etmek için. 1x PBS hücrelerin yıkayın ve 160 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  4. MS-tamponu (150 mM NaCI, 1 x proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş 50 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1 mM EDTA) tampon maddesi içinde 150 uL hücre pelet yeniden süspanse edildi ve 30 dakika süreyle buz üzerinde hücrelerin inkübe. Parçalayıcı c4 ° C'de sonikasyon ile arşın.
    NOT: Aşağıdaki Burada kullanılan ultrasonik titreşim ayarları şunlardır: zamanlayıcı, tutun; çıkış kontrolü, 8; görev çevrimi,% 80; ve 2 x 30 sinyal.
  5. 11.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika için santrifüjleme ile hücre debrisini uzaklaştırmak. yeni bir tüpe süpernatant aktarın ve bu, deterjan-uyumlu bir protein deneyi ile protein konsantrasyonu belirlenir.
  6. 95 ° 'de 6x numune tamponu (375 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 25.8, gliserol, 123 mg / ml SDS, mavi 600 ug / mL bromofenol ve 60 uL / ​​ml β-mersaptoetanol), kaynatın ile proteinin 75 ug karıştırın Cı 5 dakika ve yaklaşık olarak 1 saat süre ile tampona 180 V de (3.02 g / L Tris baz, 18.8 g / L glisin, ve 1 g / L SDS) çalışan veya üreticilerine göre SDS içinde SDS-PAGE ile protein ayırmak 'talimatlar.
  7. Coomassie boyama çözeltisi içine jel aktarın. Her kuşaktan gelen aynı protein bandı keser. tripsin ile protein sindirimi ve MS analizi sırasında dahil edilmesi etkinliğini analizs, olarak 22 tanımlanan.

SILAC etiketli Huh7.5 Hücreleri 3. lipid Damlacık İzolasyonu

  1. Hücrelerin bir popülasyonunu enfekte (yani, "hafif," amino asitler ile işaretlenmiş olan) (örneğin, Jc1 NS5AB-mKO2 BSD, MOI 1), 37 ° C'de 4 saat boyunca, 21 açıklandığı gibi virüs stokları ile inkübe edilerek bir HCV raportör virüsü ile .
    NOT: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD 21 daha önce açıklanan, bir yinelenen NS5A NS5B bölünme bölgesi arasında Blastisidin Direnç geninin (BSD) izledi enfeksiyon oranlarını izlemek için bir floresan muhabir (monomerik Kusabira Portakal 2, mKO2) taşıyan bir HCV virüsü, 23. HCV ile çalışmak BSL2 + (ABD) ya da S3 ** (Almanya) biyogüvenlik düzeyi çevreleme ve uygulamalarını gerektirir. Bunun yerine HCV ile enfeksiyon, hücreler farklı patojenler ile enfekte edilebilir.
  2. HCV ile enfekte olmuş "hafif" hücreleri olan ve olmayan & # Expand34;. Ağır" hücresi kültürlerinin pasajlayarak sırasında PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile bir kısım düzeltmek ve 21 tarif edildiği gibi floresan markör proteinin akış sitometrisi (örneğin, mKO2) ile HCV enfeksiyonu oranlarını belirlemek; . Jc1 NS5AB-mKO2 BSD HCV ırkı kullanılarak olması halinde, HCV-pozitif hücreleri seçmek için "hafif" ortama 10 ug / ml blastisidin S ekleyin: enfeksiyon oranları lipit damla izolasyon NOT% 90'dan daha fazla olmalıdır.
  3. lipit damla izolasyonundan önce, 1 d, PBS, trypsinize, "hafif" ve "ağır" ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın ve bir Neubauer sayım odası kullanarak hücreleri sayın. Tohum 150 cm2 hücre kültürü çanağı içinde, her bir popülasyonda 7 x 10 6 hücre. "Hafif" ve "ağır" hücre nüfus başına en az 5 yemekleri hazırlayın. Kültür ortamı / bulaşık O / N 30 mL hücreleri.
  4. Ortamı çıkarın ve 1 x PBS içinde hücreleri yıkayın. 1x hücreleri AyırPBS, bir hücre kazıyıcı kullanılarak.
  5. Bir Neubauer sayım odası kullanılarak her iki hücre popülasyonları sayın ve bir 50 mL santrifüj tüpüne eşit hücre sayısını havuz. 160 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  6. PBS çıkarın ve sukroz tamponu (0.25 M sukroz, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş), 1 mL hücre pelletini. Bir dar Dounce homojenizatör hücre süspansiyonu aktarın ve buz üzerinde 200 vuruş ile hücreleri lize.
    NOT: tripan mavisi boyama kullanarak komple hücre parçalanmasını onaylayın.
  7. 1.5 ml mikrofüj tüpüne lizat transferi ve 1000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika için çekirdek ve hücre artıkları aşağı doğru döndürün.
  8. Santrifüj işleminden sonra, bir giriş kontrol olarak -20 ° C'de post-nükleusunun 25 uL (PNS) ait bir kısım saklayın.
  9. 3 mL santrifüj tüpüne (11 x 60 mm) altındaki PNS fraksiyonunun geri kalan yerleştirin ve ~ lipit damla yıkama tamponu ile (Bindirme; 4 mL total) (50 mM potasyum fosfat tamponu pH 7.4, 100 mM potasyum klorür, 1 mM EDTA ve 1 mM fenilmetansülfonil florit).
  10. 100,000 x g'de 2 saat ve 4 ° C'de santrifüje. (- lipid damlacıkları miktarına bağlı olarak 500 uL, yaklaşık 250) borunun tepesinden itibaren bir bükülmüş, küt kanül kullanılarak yüzer lipit damla fraksiyonu hasat. bir santrifüj tüpüne (11 x 60 mm) lipid damlacık fraksiyonu koyun, yağ damlacık yıkama tamponu (~ 3.5 mL, 4 mL toplam) ile bindirme ve santrifüj adımı tekrarlayın.
  11. tüpün üst kısmından bir bükülmüş, küt kanül kullanılarak yüzer lipit damla fraksiyonu Hasat ve yeni bir 1.5 mL mikro santrifüj tüpüne lipid damlacıkları aktarın. 21.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca lipit damla yıkama tamponu ve spin 500 uL ekleyin.
    NOT: lipid damlacıkları tampon üstünde yüzen beyaz bir bant olarak görünür.
  12. Bir jel yükleme pipet kullanarak onun altında bulunan yıkama tamponunu çıkarın ve bu yıkama adımı üç kez tekrarlayın.
  13. Bir jel yükleme pipet ucu kullanılarak yıkama tamponu nihai uzaklaştırıldıktan sonra, NP-40 liziz tamponu 10 uL (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI,% 1 NP-40, 5 uL lipit damla fraksiyonlarının karıştırın ,) proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiştir. enfeksiyöz madde ile çalışan halinde virüsü etkisizleştirmek için 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe örnek. Bir deterjan uyumlu protein deneyi ile, protein seviyesini tespit etmek; proteinin en az 35 ug, MS-analizi için gereklidir.
  14. -20 ° C'de yağ damlacık fraksiyonları saklayın.
  15. 4x yükleme boyası ile lipit damla fraksiyonunun gelen miktarda karıştırın. Bulaşıcı malzeme ile çalışıyorsanız virüsü inaktive 1 saat buz üzerinde inkübe edin. 5 dakika boyunca 95 ° C'de kaynatılır.
  16. üreticinin protokolüne göre SDS-PAGE kullanılarak proteinleri ayırın. Coomassie boyama çözeltisi içine jel aktarın. jelden tüm protein bantlarını keser. Triptik içinde jel sindirim 24 / Sup>, numune buharlaşması ve% 0.1 formik asit bunları çözülür. LC-MS / MS ile analiz edin.
    Not: Burada, LC-MS / MS kuadropol-Time-of-flight kütle spektrometre (Q-TOF) ya da bir doğrusal Trap kuadropol (LTQ) Orbitrap kütle spektrometresi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Her iki alet, bir nano UPLC sistemi için bir ESI-kaynakla birleştirilmiştir. Veri analizi ve LC-MS / MS 21, 22 tarif edilen şekilde gerçekleştirilmiştir Q-TOF ve Orbitrap kütle spektrometresinde analiz eder. insan keratin ile numuneyi kontamine etmemeye büyük özen gösteriyoruz. Her zaman keratin içermeyen pipet uçları ve tüpler kullanın. Keratin içermeyen kimyasallarla laminer bir akış hunisi altına tamponlar hazırlayın. Kullanmadan önce, damıtılmış su ve etanol ile tüm yüzeyleri ve cihazlarını temizlemek. Her zaman eldiven ve bir laboratuvar önlüğü giyerler.

Lipit Damlacık Saflık 4. analizi

  1. lipit damla fraksiyonları 1 hacimde seyreltik: 2 ve giriş fraksiyonları NP-40 lys 1:10 (adım 3.9)tampondur. enfeksiyöz madde ile çalışan halinde virüsü etkisizleştirmek için 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bir deterjan uyumlu protein deneyi protein seviyesini belirler.
  2. 6x numune tamponu ile proteinin eşit miktarlarını karıştırın ve enfeksiyöz madde ile çalışan halinde virüsü etkisizleştirmek için 1 saat boyunca buz üzerinde örneklerin inkübe edin. SDS-PAGE ile devam edildi ve 90 dakika boyunca 80 V tank lekeleme ile nitroselüloz zarı üzerine proteinleri aktarın.
    Not: tampon (TBS-T (10 mM Tris-HCI, pH 7.6, 150 mM NaCI ve% 0.05 Tween 20) içinde% 5 yağsız kurutulmuş süt tozu) bloke edilmesini, membranın bloke edildikten sonra (lipit damla belirteçleri karşı yönlendirilmiş antikorlar ile inkübe örn , PLIN1, PLIN2 veya PLIN3) ve diğer alt-hücresel kompartımanlara (belirteçleri, örneğin sekonder ve HRP ile birleştirilmiş antikorlar ardından CALR, MnSOD veya tübülin). Proteinlerin tespit edilmesi için, kimyasal ışıl ısı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lipid damlacıkları virionların toplanması farazi siteleri gibi HCV enfeksiyonu için hayati önem taşıyan fakat morfojenez ve virionlarına dışarı çıkması moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu süreçte yer alan yeni bir ana bağımlılık faktörlerini tanımlamak için, HCV ile enfekte olmuş hücrelerin 21 (Şekil 1A) kantitatif lipit damla proteom analizi yapıldı. Biz, lipid damlacıkları saflaştırılması için bir protokol kurulmuş ve rutin lip...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, örneğin viral enfeksiyonlar gibi çeşitli kültür koşulları altında, lipid damlacıkları ile bağlantılı proteinlerin zenginleştirme ve tükenmesi karşılaştırma kantitatif lipit damla proteom analizi için lipid damlacıkları izole etmek için bir protokol açıklar. Alternatif bir yöntem olarak, proteom analizi toplam pik yoğunluklarına dayalı etiket içermeyen sayımsal ile gerçekleştirilebilir. Bu yöntem dinamik aralık sınırlaması vardır ve metabolik sorunları önler. SILAC yaklaşımın avantajı Numuneler lipit damla izolas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz JFH1 inşa T. Wakita (Ulusal Enstitüsü Jc1 yapılar için R. Bartenschlager (Heidelberg Üniversitesi), Huh7.5 hücreleri için CM Rice (Rockefeller Üniversitesi), J. McLauchlan (Medical Research Council Viroloji Birimi) thank HCVcc raportör yapılan için Enfeksiyon Hastalıkları, JFH1 için Japonya) ve B. Webster ve WC Greene (Viroloji Gladstone Enstitüsü ve İmmünoloji). Bu çalışma DFG gelen fonlarla desteklenmiştir (HE 6889 / 2-1 (EH), 337 / 15-1 2013 ANİ ve ANİ 337 / 16-1 2013 (HS)). Heinrich Pette Enstitüsü, Deneysel Viroloji Leibniz Enstitüsü Free ve Hamburg Hansa Şehri ve Federal Sağlık Bakanlığı tarafından desteklenmektedir. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SILAC Protein Kantitasyon Kiti - DMEMThermo Fisher89983 
13< / sup>C6 L-Arginin-HCl 50  mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x KonsantreRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glisin - TamponGeyer Th. GmbH & Ve Tic. Ltd. Şti.A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Yaşam Teknolojileri Ltd. Şti.350500038 
Hücre Kültürü için Penisilin / Streptomisin ÇözeltisiSigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml ve nbsp;
DPBS 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Tripsin-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
Sodyum Klorür BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Proteaz İnhibitörü Kokteyli 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D (+) - Sükroz BioChemica< / em>AppliChem GmbHA3935,1000
Hidroklorik asit (HCl) %37 saf Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Testi Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Bromofenol mavisiAppliChem GmbHA2331
β-Merkaptoetanol AppliChem GmbHA4338
BlasticidinInvivogenant-bl-1 
Potasyum Klorür AppliChem GmbHA1039
Fenilmetansülfonil Florür AppliChem GmbHA0999
Potasyum Fosfat MonobazikSigma-Aldrich Chemie GmbH 
Dipotasyum HidrojenfosfatSigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Yağsız kurutulmuş süt tozuAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1 / TIP47 100 ve mikro; gabcamab47639
Kalretikülin, pAb 200 ve mikro; gEnzo Yaşam Bilimleri GmbH ADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH &T6074 200 ve mikro; L  
Etanol mutlak (EtOH)Geyer Th. GmbH & Ve Tic. Ltd. Şti.A3678,0250  
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
Anti-fare HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-tavşan HRPThermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 
96 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıGreiner Bio-One GmbH 655 180 
Terumo Şırınga 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 & m SARSTEDT 83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Prekast Jeller, Herhangi bir kD çözücü jelBio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
6 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıGreiner Bio-One GmbH 657160 
Yemekler Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH &10098720 - 168381 
Hücre SıyırıcıneoLab Migge GmbH C-8120 
Tüp, 50 mLGreiner Bio-One GmbH 227261 
SafeSeal Tüp RNase içermez SARSTEDT 72.706.400 
Ultra Şeffaf Santrifüj Tüpleri 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Emme İğneleriTranscodent6482
Biyosfer Fil. Uç 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biyosfer Fil. İpucu 200SARSTEDT 70.760.211 
Biyosfer Fil. İpucu 10SARSTEDT 70.1130.210 
Dounce Doku ÖğütücüFisher Scientific GmbH 
Dounce Tamamen Cam Doku Öğütücüler İçin 11883722 HavaneliFisher Scientific GmbH 
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Termomikser konforu, Termoblok 1.5 mLEppendorf5355  000.127
Mini-PROTEAN Tetra Hücresi, Mini Trans-Blot Modülü ve PowerPac Temel Güç Kaynağı, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Çok Döküm HazneliBioRad165-4110
PowerPac HC Güç KaynağıBiorad164-5052
Santrifüj ve nbsp;Eppendorf5424R
Santrifüj Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 
Sonsuz M1000 PROTecan
2213091201519600110389444335649

Kaynaklar

  1. Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  4. Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
  5. Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
  6. Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
  7. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49(2015).
  8. Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
  9. Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
  10. Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
  11. Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
  12. Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
  13. Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
  14. Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
  15. Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
  16. Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
  17. Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
  18. Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302(2013).
  19. Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
  20. Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
  21. Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
  22. Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
  23. Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
  24. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  25. Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
  26. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
  27. Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
  28. Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
  29. Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SILAC EtiketlemeUltrasantrif j A amalarWestern Blot AnaliziSDS PAGE Ay r mLC ESI MS MS KantifikasyonuHCV Enfeksiyon ModeliPerilipin Belirte leriProtein Konsantrasyon Analizi

İlgili makaleler