Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yetişkin kök hücreleri ve rejeneratif mekanizmaların çalışmada planarya yassı kurtların vivo model sisteminde bir elyaf. Bu onların bol pluripotent kök hücre nüfus ve çoğu hayvanlar için felaket olacaktır yaralanmalar sonrasında tüm hücre ve doku tiplerini rejenere etme kabiliyetine büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, planarya göz rejenerasyon için bir model olarak popülerlik kazanmıştır. (Iki doku tiplerinin gibidir: pigment hücreleri ve fotoreseptör) tüm göz yeniden kabiliyetleri görme sistemi rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaların diseksiyon sağlar. Göz ablasyon rejenerasyon büyük ölçüde tek başına göz doku ile sınırlı olduğunu En önemli olan göz spesifik yolları ve mekanizmaları incelemek için (örneğin, başı kesilerek ya da delik açma gibi) diğer tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Bu Video makalenin amacı güvenilir beyni rahatsız veya dokuları çevreleyen olmadan planarian optik fincan nasıl kaldırılacağını göstermektir.solucan ve kurulu bir koloninin bakım kullanımı da tarif edilmektedir. Bu teknik, cerrahi soğuk plaka üzerinde immobilize Planaryalar optik fincan oymak için bir 31 G, 5/16 inç insülin iğne kullanır. Bu yöntem geniş bir uygulama yelpazesi için izin 1-2 hafta içinde rejenere gözlü, tek ve çift göz ablasyon kapsar. Özel olarak, bu ablasyon tekniği kolayca rejeneratif mekanizmaları ve evrim, göz kök hücreleri ve bakım ve phototaxic davranışsal tepkileri ve nörolojik olarak daha iyi anlaşılması için farmakolojik ve genetik (RNA interferansı) ekranları ile birleştirilebilir.
Giriş
Planaryalar yetişkin kök hücre aracılı yenilenmeyi incelerken için güçlü bir model organizma bulunmaktadır. Bu parazitik olmayan tatlı su yassı kurtların, merkezi sinir sistemi ve beyin 1 de dahil olmak üzere her türlü kayıp dokuları, yeniden yeteneği gösterirler. (In situ hibridizasyon, immünohistokimya, RNA interferans (RNAi), ve transkriptomik içinde, örneğin, bir sıralı genom olarak) kadar geri son 10-15 yılda planarian alanında 1700 2, teknolojik gelişmeler olarak ele bu tarihi organizma olduğu güncellenmiş . Özellikle, planarya geçenlerde göz araştırma 3 yükselen bir model olarak popülerlik kazanmıştır.
Planaryalar iki doku tipleri, fotoreseptör nöronlar ve pigment hücreleri ile prototipik gözleri; Bu onun göz kök hücre popülasyonunun karakterizasyonu etkin ve aynı genlerin birçoğu omurgalı gözü DE düzenleyen olduğunu göstermiştirvelopment Planaryalar 4, 5 muhafaza edilir. Optik bardak dorsal olarak bulunur ve fotoreseptör nöronların beyaz, pigmentsiz dendrit ve yarım ay siyah pigment yapan hücrelerden, ve bunun üzerine kiyazmanın ile beyin innerve edilir. Yeniden yaratıcı süreçler, 6 açıklık için bir model olmasının yanı sıra, planarian göz görme mekanizmaları 7 evrim eğitimi için uygundur, davranışsal tepkileri ışığa 8 ve davranış 9 nörolojik temeli (planarya negatif phototaxis ekran).
Planaryalar Göz rejenerasyon büyük ölçüde iki ana bağlamlarda incelenmiştir: Baş yenilenme parçası başının kesilmesini 4, 10 takip ve sadece göz dokularının 11 eksizyonu aşağıdaki gibi 12 Sup. Basit ve anlaşılır olarak göz yenilenmesine En planarian çalışmalar decapitation yöntemini kullanmışlardır. Bazı çalışmalar, sadece göz (kısmi dekapitasyon) 15 arkasında amputasyon gerçekleştirilir rağmen bugüne kadar en yaygın planarian göz eksizyon yöntem olup, ince bir cam kılcal boru 13, 14 ile delik açma ile olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin tüm potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike (örneğin, beyin, bağırsak, ve nephridia gibi) sadece göz dışındaki birçok doku kaybını içermektedir. Burada sunulan göz ablasyon protokolü göze daha özeldir verilerin ortaya çıkmasına neden (özellikle beyinde hariç) göz dokularına, eksizyonu kısıtlar. Ayrıca, beslenme başlamak için 7-14 gün sürebilir kafası kesilmiş solucanlar aksine, göz kesilip solucanlar performe edilmesi (RNAi gıda ile teslim edilir) RNAi deneyleri izin ablasyon 12 24 saat içinde besleyecekeş zamanlı d.
Göz ablasyon başarılı dekapitasyon daha gerçekleştirmek için teknik olarak zor olsa da, göz eksizyonu içeren güncel çalışmalar onların prosedürlerine ilişkin ayrıntılı talimatlar yer verilmemiştir. Bu video makalede amacı sürekli altta yatan beyin dokuları rahatsız ve mümkün olduğunca az diğer dokulara çıkarmadan planarian optik fincan kaldırmak için araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem hem tek ve çift göz yakmakta ve araştırmaların geniş bir yelpazede uygulanabilir edilebilir. En yenilenmesi deneylerinde olduğu gibi, göz ablasyon farmakolojik ve genetik (RNAi) ekranlar, hem de davranışsal çalışmalar her iki kombinasyon için uygundur. Burada, solucan işlenmesi için yöntemler tarif bir planarian koloni bakımı ve göz ablasyon tekniği kendisi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hayvan Kültür ve Taşıma
NOT: Bu protokol Schmidtea mediterranea, yaygın rejenerasyon araştırma için kullanılan bir sıralı genomun 16, 17 ile diploit planarian türler kullanır. Bununla birlikte, deney gibi Girardia tigrina ve Girardia dorotocephala (ticari olarak temin edilebilir) gibi başka türler ile aynı başarılıdır.
- Ultra saf (ya da süzülmüş deiyonize edilmiş) su içinde 0.5 g / L deniz tuzu yapılan "sonsuz su" solucanlar koruyun. Sonsuz su tutmak için steril bir polipropilen ya da cam kaplar kullanın. Bkz Ek Dosya 1 solucan su hazırlama ile ilgili ayrıntılar için.
Not: sabun gibi kaplar (ya da diğer malzemeleri) temizlemek için sabun kullanmayın solucan için toksiktir; yerine% 70 etanol ile silin ve kurumaya bırakın.- mikroplardan korunmak için Planarya çalışırken eldiven giyin.
Not: Solucanlar sabun, ağartıcı, şampuan, saç kremi, ve el temizleme dahil olmak üzere çevresel toksinler ve kimyasallar, çok hassastır.
- mikroplardan korunmak için Planarya çalışırken eldiven giyin.
- Kapaklı polipropilen gıda kapları Ev koloniler, ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) hava değişimi için kısmen açık bıraktı. Petri kutuları ya saklayın deney kurtlar (100 mm tabak için 20 solucanlar) veya non-muamele edilmiş doku kültürü plakaları (12 oyuklu plakalar için oyuk başına 1 solucan). Stresi azaltmak karanlıkta hem koloniler ve deneyleri tutmak.
NOT: Koloniler solucan litre suya en fazla 500-1000 den solucanlar olmalıdır. Hava akımı bu yemeklerin içine tasarlanmıştır beri deneyler için, tam yerinde kapaklarını bırakın. - Bir transfer pipeti ile ilgili püresi bırakarak kap boyunca yiyecek damla yerleştirerek püre haline getirilmiş organik et ve tavuk karaciğer haftada bir deneysel olmayan solucanlar besleyin. içinde gıda tüketmek Worms 2 saat izin verkabını temizlemeden önce koyu (adım 1.4). Uzun süreli (ay) C, mağaza kısa süreli (haftalar) boyunca -20 ° C'de püre ya da -80 Kullanımdan önce; (Bakteri çiçek ve solucanlar zarar verebilir gibi) yeniden kullanım için püresi dondurursam yoktur.
Not: Karaciğer bir hormon veya antibiyotik içerir ve tercihen önceden dondurulmuş edilemez. Santrifüj, dondurmadan önce püresi (ya da teknolojide beslemeye) havanın çıkartılması ve yüzer gıda önlemek için kullanılırlar. Gıda kabın dibine batar gerekir. püresi 1 mL 500-1,000 solucanlar için yeterlidir. - Kolonilerin ve deneyler hem taze solucan su ile haftada bir kez Değişim su. Koloni kaplar da ağartılmamış kağıt havlu ile silinmiştir edilmelidir (mukus lekeleri çıkarmak için tuzak atıklar) (besleme ve tekrar 2 gün sonra 2 saat sonra), besleme solucanlar için haftada iki kez solucanlar açlıktan veya bir haftada bir kez. biyofilm muhafaza etmek için, kabın% 80'den fazla silme yoktur.
- Kaplarla (ya da cerrahi Setu arasında solucanlar taşıp) Bir transfer pipeti kullanarak. kap yüzeylerine yapışan serbest solucan için, yüzeyin serbest bırakmak için solucan / arkasında üzerinde su fışkırtma. pipet alt inç (tiner) kısmı içinde solucan tutmaya çalışırken Ardından, pipet içine solucan emmek.
- onları emmeye önce solucan küçük bir su miktarı ile Backload pipetler.
- pipet ile dokunarak yumuşak bedenli solucanlar yırtılma önlemeye yardımcı olmak için, daha doğrusu solucan kendisinden daha, solucan etrafında su taşımak için deneyin.
- solucanlar transfer veya su yerine sürece örtülü deneysel yemekler tutun.
2. Hazırlık
- Deneylerden önce solucanlar az bir hafta beslenmesi durdurun.
- ≥1 hafta boyunca beslenirler ve uzunluk olarak en az 5-7 mm edilmemiş olan solucanlar seçin. solucan su dolu bir Petri kabı 2/3 solucan aktarın ve çanak altına bir cetvel kaydırarak solucan uzunluğunu onaylayın. w ölçünnormlar ise tamamen uzatılmış ve hareketli.
NOT: Sonraki .bağışık ve in situ hibridizasyon analiz içinde, daha büyük solucanlar (8-10 mm) performans ile çalışmak daha kolay olduğunda daha küçük (5-7 mm) solucanlar daha iyi çalışırken - özellikle aşındırılması için öğrenme. - solucanlar, bütün hasarsız ve yakın zamanda yenileyici değildir emin olun.
NOT: Normal solucanlar kıyasla rejenerasyon solucanlar, baş ve / veya arka bölgede daha hafif (veya hiç) pigment olacaktır. - solucanlar üzerinde RNAi'yi veya farmakolojik tedaviler gerçekleştirmek, bu noktada bunu. kurtlar tedavisi (RNAi için gibi) bir parçası olarak beslenen olsaydı, 2.2 adıma devam etmeden önce en az 7 gün son beslenmeden sonra bekleyin.
- ≥1 hafta boyunca beslenirler ve uzunluk olarak en az 5-7 mm edilmemiş olan solucanlar seçin. solucan su dolu bir Petri kabı 2/3 solucan aktarın ve çanak altına bir cetvel kaydırarak solucan uzunluğunu onaylayın. w ölçünnormlar ise tamamen uzatılmış ve hareketli.
- % 70 etanol ile çalışma alanı ve diseksiyon mikroskobu baz temizleyin ve tamamen kurumasına izin verin. Kapsamı solundaki seçilen solucanların koyunuz. Kapsamı sağında, 5/16 inç insülin iğne 1 ile 5. forseps bir çift, bir 31 G yerml şırınga ve temiz bir aktarım pipet.
- alet tezgah (kontaminasyona neden olabilir) dokunmasını tutulmasını sağlamak. temiz forseps, iğne ve pipet tutmak için (örneğin bir çubuk geri kalanı gibi) sert bir öğesini kullanın. Alternatif olarak, yeni bir kahverengi (ağartılmamış) ve kağıt havlu üstüne yer araçlar.
NOT: Sağ elini bireyler ilgilendirmeyen Bu ve sonraki talimatlar yazılır. Solak bireyler sağ / sol yön ters olmalıdır.
- alet tezgah (kontaminasyona neden olabilir) dokunmasını tutulmasını sağlamak. temiz forseps, iğne ve pipet tutmak için (örneğin bir çubuk geri kalanı gibi) sert bir öğesini kullanın. Alternatif olarak, yeni bir kahverengi (ağartılmamış) ve kağıt havlu üstüne yer araçlar.
- Sonraki bir çalışma alanı için ve lif içermeyen doku mendillerin bir kutu, taze sonsuz bir su kaynağı, ve (tezgah üstü korunmuş olarak) ilave bazı aktarım pipetler yerleştirin. yayma kolaylığı için bir plastik yıkama şişesinde yer solucanı su. Ayrıca ablasyona Hayvan toplam kapsamına sağındaki işaretlenmiş bir 12-kaynaklı plaka (veya 100 mm Petri kabı) yerleştirin.
- Ismarlama bir Peltier plakası kullanılarak solucanlar hareketsiz hale getirmek için ise, t depresyon içine Peltier plakası pozisyonO mikroskop taban ve Peltier plakasının çalışma yüzeyi yeterince soğuk kadar DC güç kaynağı çıkış ayarlayabilirsiniz (tipik olarak ~ 5 V) .Alternatively, yarım su ile dolu bir 100 mm Petri kabı doldurarak soğuk plaka yapmak ve en az 24 saat süre ile dondurma. Kapağı atın ve kesici bir alan tabanındaki 100 mm tabak için alt tarafının, daha sonra buz (Şekil 1A) yüzeyine doğrudan baş aşağı bir 60 mm Petri kabı kapağını yerleştirin.
- Su, 100 mm tabak içinde dondurulur sonra, bir buz "volkan" plakasının merkezinde bir görünebilir. Bu durumda, yüzeyden herhangi bir düzensizlik kaldırmak için, buz düz kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma.
NOT: ameliyatları sırasında buz, erimeye çok daha zor ablasyon yapma olacaktır. önceden birkaç buz yemekleri hazırlayın, ve en kısa sürede 60 mm yemeğin kapak yüzen başlar başlamaz tahlil sırasında olanları eritmek için donmuş olanları değiştirin.
- Su, 100 mm tabak içinde dondurulur sonra, bir buz "volkan" plakasının merkezinde bir görünebilir. Bu durumda, yüzeyden herhangi bir düzensizlik kaldırmak için, buz düz kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma.
- hazırlamakcerrahi yüzeyi. Plastik parafin film bir 5 cm x 10 cm parça kesin (4 cm2 olursa petri soğuk plaka kullanılarak) ve hareketsiz hale getirme cihazının merkezi üzerine yerleştirin. Bir lifsiz bir doku Katlama bir kare yaklaşık 2 cm2 olarak mendil ve filmin üzerine yerleştirin. Beyaz filtre kağıdı 1.5-2 cm2 'lik bir parça kesin ve mendilin üzerine yerleştirin. Şekil 1B-1E bakın.
- katlanmış tutun eldivenli parmak ile yerinde silin ve hafifçe katlanmış devam etmesini sağlamanın silin kırmak için solucan su kullanmayın. düz mendil rulo bir transfer pipeti kenarıyla.
NOT: Soğuk sıcaklık hareket solucanlar tutmaya yardımcı olur. Çalışma "kuru" da hareketsiz hale yardımcı olur. Doku kurtlar (öldürücü olan) tamamen kurumasına izin vermeden, ameliyat sırasında nemli solucan tutarak, filtre kağıdı içinden su fitilleme eylemleri silin.
- katlanmış tutun eldivenli parmak ile yerinde silin ve hafifçe katlanmış devam etmesini sağlamanın silin kırmak için solucan su kullanmayın. düz mendil rulo bir transfer pipeti kenarıyla.
3. Cerrahi Ablasyon
- Yerleştirmek üzere bir transfer pipet kullanınfiltre kağıdı üzerine, e solucan sırt tarafı yukarı. Işık kaynağını açın ve hafif solucan odaklanmış şekilde Goosenecks yönlendirmek. Gözleri (tüm solucan görünümünde olması gerekmez) açıkça görünecek şekilde diseksiyon kapsamı odağı ve büyütme ayarlayın; 5X büyütmede iyi bir başlangıç noktasıdır. Kafa (mikroskop ön tarafına doğru) araştırmacı doğru işaret şekilde sağa doğru, açılı 30-40 derece parafin filmi döndürerek solucan döndürün.
- Aşırı solucan hareket etmesini önlemek için parlak ışık kullanımından kaçının. Planaryalar olumsuz phototaxis görüntülemek ve parlak ışık kaçmasına dener.
- Solucan (boğaz görünür açılış) yukarı bakacak şekilde ventral yana konumlandırılmış, yavaşça (gözleri görünür olan) sonsuz dorsal tarafına kadar yeniden konumlandırmak için forseps donuk tarafında kullanır. hayvan yeniden konumlandırma zaman yumuşak doku yoluyla yırtılma riskini en aza indirmek için forseps sivri ucu ile hayvanın yaklaşan kaçının.
- Gözler odakta açıkça böylece mikroskop odağı ayarlayın. Ayrıca gözleri ve çevresindeki kafa dokuları hem görünümde olmasını sağlamak.
- O (başparmak ve işaret parmağı arasında) kalem sanki sağ elinde taze bir iğne / şırınga tutun. Peltier plakasına (veya Petri kabı soğuk plaka) karşı sola başparmak Brace ve şırınganın alt kısmı dinlenme olan bir dayanak noktası (Şekil 2A) ve sol baş kullanımı. Mikroskopla Bak ve iğne konik görünür olmasını sağlamak.
NOT: İğneler çok keskindir. Onları tutarken dikkatli olun. lateks veya nitril eldiven giyerek biraz koruma sunabilir.- prosedürü boyunca sürekli iğne / şırınga tutun yardımcı ve tokalaşarak önlemek için sol baş parmağını kullanın.
- Ameliyat yüzey stabil tutmak yardımcı olmak için sol başparmak ve (cerrahi yüzeyinde parmağı ile) sol işaret parmağı ile yaklaşık 40 ° 'lik bir açı olun.
- İle(Kaşık gibi) yukarı doğru bakacak şekilde iğne konik, göz (Şekil 2B) dik açılarda iğne yerleştirin. yavaşça sağdan sola scooping gözün optik fincan (beyaz, pigmentsiz bölge) üzerinde uzanan doku ince tabaka nüfuz iğne ucu kullanın. Çok nazikçe dibe delinme veya optik fincan sınırlarını yok etmek değil dikkat ederek optik fincan içinde yer alan herhangi bir pigmentli dokuyu.
- Sonsuz işlemi sırasında herhangi bir noktada> 1-2 dakika için bir filtre kağıdı üzerinde kalmışsa, solucan rehidrate sonsuz bir su damla ekleyin.
NOT: Dehidrasyon müthiş yaralanmalara solucanın duyarlılığını artıracaktır.
- Sonsuz işlemi sırasında herhangi bir noktada> 1-2 dakika için bir filtre kağıdı üzerinde kalmışsa, solucan rehidrate sonsuz bir su damla ekleyin.
- Tekrar siyah pigmentli dokularda (pigment hücreleri) her kadar adım 3.3, hem de optik fincan (fotoreseptör hücrelerinin dendritler) beyaz dokuların her olarak çıkarılır. dikkatli bir doku temizleme ile silerek iğnenin ucuna yapışmış kesilmiş dokuları çıkarın. çift göz abla isesiyon, istenen bu noktada ikinci gözü baskılamak edilir.
Not: zarar görmesini önlemek için, iğneler daha sonra silme uzak başparmak ve işaret parmağı arasından yoluyla iğne çekmek için diğer elini kullanarak, başparmak ve işaret parmağı ile yapılan mendil temiz bir doku ile iğne kavranarak temizlenebilir. Seçenek olarak ise, iğne ıslak bir doku temizleme yüzeyi üzerine sürülmüştür ve temizlik için incelenebilir. - Tamamlandığında taze solucan su içeren bir etiketlenmiş çanak solucan taşımak için bir transfer pipet kullanın. Grup verileri analiz için, bir tek 100 mm Petri tabağına 20 solucanlar yerleştirebilir. Zamanla aynı bireylerde rejenerasyonu izleme Eğer bir 12 plaka her kuyuya 1 solucan yerleştirin. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, tabaklar / kuyu tüm solucan suyun çıkarılması ve daha fazla taze solucan su ile değiştirerek solucanlar yıkayın.
- filtreden solucanlar kaldırmak için, sonsuz küçük bir su miktarı ile pipet backload ve solucan üzerine su bırakın. Bu t kaldırması gerektiğinifiltre kağıdı kapalı o solucan, derhal transfer için pipet içine emilmesine.
- ışıktan korunmalıdır ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) deneyleri inkübe edin ve rejeneratif süreci takip.
NOT: Solucanlar sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek sıcaklık kontrollü inkübatör içinde saklanabilir, ancak bu kesinlikle gerekli değildir. Çoğu oda sıcaklıkları yeniden oluşturmak için solucan yeteneğini etkilemez 5 ° C, sadece değişir. - Arzu edildiği takdirde, imünohistokimya için solucan (Şekil 3-4) ve / ya da in situ hibridizasyon gen ekspresyonunun analiz düzeltmek. Farklı tespit yöntemleri planarian immünohistokimya 18, 19, 20 ve in situ melezleme 21, 22, 23 protokolleri bulunmaktadır.
- Deneyler sonuçlandığı, sacrifice çanak sonsuz suyun çıkarılması ve% 70 etanol ile değiştirerek solucanlar canlı. parçalanması ve grimsi açmak için solucanlar için kontrol 3-5 dakika solucanlar inkübe edin.
- bir kez kurban Normal atık olmayan tedavi solucanlar yerleştirin. çevre, özellikle yerli olmayan türlerin içine canlı solucanlar tanıtan kaçının.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ilk 1-2 saat sonra cerrahi, hayvanlar sağlam solucanlar (ancak yine de hareket edecek) ile karşılaştırıldığında hareket azalma gösterebilir. Arzu edildiği takdirde, solucanlar (RNAi beslenmesi için, örneğin) ameliyattan sonraki 24 saat içinde yiyeceklerdir. zamanla aynı bireylerde göz rejenerasyonu aşağıdaki, her iki ameliyat öncesi (bozulmamış) ve 1 saat sonrası ablasyon (HPA) her solucanın fotoğrafını çekmek için emin olun. 4 gün sonra ablasyonu (DPA) tarafından rejenere pigment hücrel...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu göz ablasyon tekniği beyin dokusu hariç ve göz dokuları için esas eksizyon kısıtlayarak (örneğin, delikli zımba gibi) mevcut yöntemlerle daha da iyileştirir. teknisyenler deneyimsiz ama vicdani lisans öğrencilerine microsurgeries yaşanan den uygulama ile, bu teknik, çoğu kişiler tarafından yapılabilir. Tekniğin önceki immünohistokimya ile ya da göz işaretçi (ler) 4, 5, 13 için in situ melezleme her göz dokuları tama...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar işlevsel tahlil ile yardım için bu göz ablasyon tekniği, Taylor Birkholz mükemmelleştirmek için Michelle Deochand teşekkür etmek istiyorum, Peltier plakaları hakkında bilgi almak için, anti-arrestin antikoru Michael Levin ve Junji Morokuma. Bu çalışma WSB Batı Michigan Üniversitesi'nden SFSA hibe ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anında Okyanus deniz tuzları | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Galon" kutusu (net ağırlık 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L tüy bırakmayan mendil | Kimberly-Clark | 34155 | 4,5 x 8,5 inç |
| Whatman #2 filtre kağıdı | Sigma | WHA1002125 | Daireler, 125 mm çap, beyaz |
| Easy Touch İnsülin şırıngası (iğneli) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc şırınga, 31 G 5/16 inç iğne |
| 100 mm Petri kabı | VWR | 25384-342 | 100 mm x 15 mm |
| 60 mm Petri kabı | VWR | 25384-092 | 60 mm x 15 mm |
| Dumont #5 forseps | Güzel Bilim Aletleri | 11254-20 | Inox, düz uçlu, 11 cm |
| Transfer pipetleri | Samco Bilimsel | 225 | Dereceli, büyük ampul, 7.5 mL, non steril |
| Parafilm M parafin film | Markası | 701606 | 4 inç x 125 ft rulo |
| 12 kuyulu işlenmemiş doku kültürü plakası | VWR | 15705-059 | İşlenmemiş, düz dipli, steril, Falcon marka |
| Plastik gıda kapları (koloni için) | Ziploc | Büyük dikdörtgen | 2.25 qt (2.12 L), 10 "x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planarya (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | "kahverengi" planarya olarak satılır; en sık bunlar G. tigrina (diğer adıyla Dugesia tigrina), ancak bazen G. dorotocephala (diğer adıyla Dugesia dorotocephala); her ikisi de işe yarayacaktır. |
| Planarya (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea ticari olarak mevcut değildir. Şu anda hayvanlar sadece onları kullanan ve fazladan hayvanları olan laboratuvarlardan temin edilebilir. |
| Kahverengi kağıt havlular | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1 Katlı Çok Katlı Kağıt Havlu, AĞARTILMAMIŞ |
| Yıkama şişesi (solucan suyu için), isteğe bağlı | VWR | 16650-275 | Yıkama Şişeleri, Düşük Yoğunluklu Polietilen, Geniş Ağız, 500 mL |
| Anti-sinapsin antikoru, isteğe bağlı | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 3C11 | Süpernatant |
| Anti-arrestin antikoru, isteğe bağlı | n/a | n/a | Ticari olarak mevcut değildir. Michael Levin, Tufts Üniversitesi |
| Nalgene Lowboy damacanadan musluklu (solucan suyu depolamak için) nazik hediye, isteğe bağlı | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polipropilen, düşük profilli plastik koloni kaplarını doldurmayı kolaylaştırır |
| Özel Peltier plakası, isteğe bağlı | Williams Makinesi, Foxboro, MA | n / a | Tasarım özellikleri, Tufts Üniversitesi'nden Junji Morokuma'nın izniyle: Peltier plakası standart bir termoelektrik ısı pompasından yapılmıştır (örneğin, All Electronics Corp Katalog # PJT-1, 30 mm < sup>2 < / sup>). Kare ısı pompası ince aynalı bir yüzeyle kaplanır, daha sonra dairesel bir pleksiglas formunda (~50 mm çapında) 30 mm2 kare bir deliğin içine yerleştirilir. Bu form, ısı pompasına benzer kalınlıktadır ve yuvarlak bir soğutucunun (~ 115 mm çapında) merkezinde iyi bir alete aynı hizada oturur. Form/ısı pompası Silikon bazlı ısı emici bileşiği ile lavaboya "ankrajlı". Uçlar, hem formdan hem de soğutucudan açılan deliklerden geçirilir. Soğutucunun alt yarısı, mikroskobunuzun taban plakasının açıklığına uyan bir "ayak" içine yerleştirilmiştir. |
| DC güç kaynağı (Peltier plakası için), isteğe bağlı | B & K Precision | 1665 | Ayarlı Alçak Gerilim DC Güç Kaynağı, 1-18 V (DC), 1-10 amper. |
| Diğer ortak malzemeler | |||
| Eldiven | |||
| Tıraş bıçağı | |||
| Makas | |||
| Deveboynu aydınlatmalı | |||
| Çubuk dayanakları, isteğe bağlı |
Kaynaklar
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708(2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76(2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45(2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2(2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8(2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
