Böcek hücreleri hazırlamak ve onları mCD1d tetramers üreten rekombinant mCD1d proteinand üretimi amacı bakülovirüs ile enfekte Bir Yöntem.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.
Bu makalede
Özet
Özet
CD1 proteinler antijen sunan moleküllerin üçüncü sınıf oluşturmaktadır. Onlar noncovalently beta2-mikroglobulin ile ilgili yaklaşık 50 kDa glikozile ağır zincir olarak ifade edilen hücre yüzey glikoprotein. Bu lipidler ziyade peptidler bağlanır. Kendi yapısı MHC sınıf I ve sınıf II antijen sunan moleküllerin CD1 proteinlerin benzerlik teyit rağmen, mCD1d oluk nispeten dar, derin ve son derece hidrofobik ve klasik için açıklanan birkaç sığ cepleri yerine iki bağlayıcı cepleri var MHC antijen sunan moleküller kodlanmış. Kendi amino asit dizilerinin dayanarak, böyle bir hydrobphobic oluk lipid antijenlerin bağlanması için ideal bir ortam sağlar.
Doğal Öldürücü T (NKT) hücreleri, bağlı veya CD1d tarafından sunulan glikolipitler tanımak için kendi TCR kullanın. CD1 tarafından sunulan lipidler reaktif T hücrelerinin otoimmün ve bulaşıcı hastalıklara karşı koruma ve tümör rejeksiyon dahil edilmiştir. Böylece, CD1-reaktif NKT hücre yanıtı belirlemek, arındırmak ve izlemek için yeteneği büyük önem taşımaktadır. CD1d alfa Galactosyl seramid (a-Galcer) tetramers nesil NKT hücreleri biyoloji önemli bir anlayışa sahiptir. Diğer CD1 molekülleri inşa Tetramers de üretilen edilmiş ve bu yeni reaktifleri lipid tabanlı aşılara yanıt izlenmesinde potansiyel kullanımı ile büyük ölçüde ve otoimmün hastalıklar ve diğer tanı, lipid-reaktif T hücrelerinin fonksiyonları bilgi genişlettik tedaviler.
Protokol
I. Hücreler Çözülme
TN5 hücreler dondurulmuş flakon alın ve 37 ° C su banyosu içinde çözünme. 25cm 2 TC balon böcek Express orta 5ml (Invitrogen, katalog numarası 10486) ekleyin. Hızlı beş Glutamin olmadan geldiğini unutmayın; 100X glutamin kalem strep veya 1 lt medya tek başına Glutamine 10ml eklemek gerekir. TN5 hücrelerin içine ekleyin ve 30 dakika boyunca 27 ° C inkübatör inkübe. Daha sonra, balonun altına bağlanan hücreleri bozmadan nazikçe DMSO ile orta aspirat. Taze orta 5ml ekleyin.
II. Yetiştirme ve Hücreler genişletilmesi
Her gün hücrelerin izleyin. Balon yaklaşık% 7....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntemde, başlatmak, büyümek, Böcek hücreleri enfekte ve bu hücreleri kullanarak bakülovirüs nasıl titresi nasıl gösterilir. Bu prosedürün en önemli yönlerinden hücrelerin korunması ve bakülovirüs tam titresi bilmek. CD1 tetramers yarattı, onlar glikolipid reaktif T hücrelerinin analizi için güçlü bir araç olarak kullanılabilir. Baculovirus sistemleri de MHC sınıf II tetramers bu nedenle bu işlemi çok daha geniş uygulanabilirliği içeren rekombinant proteinler üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serumsuz Besiyeri | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Böcek Hücreleri | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiyotikler | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastik | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Tıpalı kapaklı flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Hücre Kültür Flaskı | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Konsantratör | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC cihazı | GE Healthcare | |||
| BrA Enzimi ve Tamponu | Biyotinilasyon Kiti | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agaroz Kolonu | His Tag Protein Saflaştırma Kolonu | GE Healthcare | ||
| Tuz giderme kolonu | Proteinden tuzları uzaklaştırmak için | GE Healthcare | ||
| MonoQ Kolonu | Anyon Değişim Kromatografisi | GE Healthcare | ||
| S200 Kolonu | Boyut Dışlama Kromatografisi | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glikolipid | |||
| PE- Streptavidin | Protein konjugasyonu için | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
Kaynaklar
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
