$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitülerince yayınlanan Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (NIH Yayın No. 85-23 1985) uygundur ve Giessen Üniversitesi yerel etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 200-250 g ağırlığındaki yetişkin erkek Wistar sıçanları kullanıldı.
1. Otoklavlama
- İşlem yapılmadan en az bir gün önce, bütün cerrahi aletleri, pipet uçlarını ve Pasteur pipetleri izolasyon işleminde 121 ° C'de 30 dakika süreyle otoklavda bekletin.
2. Medyanın Hazırlanması ve Çözümler
NOT: Adımlar 2.1-2.4'teki çözeltiler, izolasyondan bir hafta öncesine kadar hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir, ancak izolasyonun yapıldığı günlerde 2.5-2.8 arasındaki adımlarla çözümleri hazırlayabilir. Tamponların ve ortamların eksiksiz tarifleri Tablo 1'de verilmektedir . Tüm ortamları ve çözeltileri 37 ° C'yeHazırlanmaya başlamadan önce su banyosu hazırlayın.
- Powell ortamını, Tablo l' de listelenen kimyasalları, oda sıcaklığında (RT) 4.5 L H20 içerisinde eriterek hazırlayın. 2.0 N NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın ve hacmi 5.0 L'ye getirin. Çözelti steril filtre edin ve 4 ° C'de saklayın.
- M199 toz ortamı 4.5 L H20 ile eriterek kreatin, L-karnitin ve taurin (CCT) ortamı hazırlayın. Tablete göre HEPES tozu medyaya ekleyin ve 15 dakika karıştırın. Tablo 1'e göre kreatin, karnitin, taurin ve Ara-C'yi ekleyin. İyi karıştırın, pH metre ile pH'ı 2,0 N NaOH ile 7,4'e ayarlayın ve hacmi 5,0 L'ye getirin. Steril filtre ve 4 ° C'de saklayın.
- Orta M199'a% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 2 penisilin / streptomisin (Pen / Strep) ekleyerek fibroblastlar için hücre kültürü ortamı hazırlayın. DMEM, M199 olarak eşit derecede uygundur ve fibroblast hücre kültürü için de kullanılabilir.
- MV2 hücre kültürünü hazırlayınE ortamı için üreticinin talimatlarına göre ek karışımın tüm içeriğini bazal MV2 ortamına ekleyerek endotel hücreleri için hazırlanmıştır. 5 mL alikot alın ve bir su banyosu içinde 37 ° C'ye ısıtın.
- 0.05 g sığır serumu albümini (BSA) 50 mL Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde çözerek ve buna 0.5 mL 200 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ilave ederek endotel hücre izolasyon tamponunu hazırlayın. Steril filtreyi kullanın ve 4 ° C'de saklayın.
- 9.9 mL PBS'ye 200 mM'den 0.1 mL ilave ederek endotel hücre yıkama tamponunu hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
- 27 mg kollajenazın 5 mL Powell ortamında çözündürülmesi ve buna 12.5 uL 100 mM CaCl2 solüsyonu ilave edilerek kollajenaz çözeltisi hazırlayın. Su banyosunda 37 ° C'ye ısıtın.
- 12.5 μL, 25 μL ve 100 mM CaCl 2 çözeltisinin 120 μL'sini ekleyerek kardiyomiyositler için artımlı Ca 2+ restorasyon çözümleri 1, 2 ve 3'ü hazırlayınIyonu sırasıyla 6 mL, 6 mL ve 12 mL Powell ortamı içerebilir.
- Her 35-mm hücre kültürü çanak laminin içeren ön kaplama orta 1 ml ekleyerek izolasyon bir gün önce kardiyomiyosit için hücre kültürü yemekleri ön ceket. Onları gece boyunca 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
3. Manyetik Boncukların Hazırlanması
- Buz üzerinde 1.5 mL numune tüpüne 0.5 mL endotel hücre izolasyon tamponu yerleştirin.
- 5 μL (2 x 10 6 ) pan fare IgG manyetik boncuk ekleyin ve iyice karıştırın.
- Tüp manyetik rafa 1 dakika yerleştirilir. Boncuk tüpün duvarına mıknatısa doğru yapışır. Yüzen maddeyi 1 mL pipetle dikkatlice çıkarın.
- Yıkamayı iki kez tekrarlayın ve son olarak, 50 μL endotel hücresi izolasyon tamponundaki boncukları tekrar askıya alın ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
4. Langendorff Perfüzyon Sisteminin Hazırlanması
- TemizleLangendorff sistemini 2 L damıtılmış su ile perfüzyonla yıkayın.
- Sistem boyunca 50 mL Powell ortamını 5 dakika boyunca dolaştırın ve ortamı atın.
- 80 mL taze Powell orta maddesi ilave edin. Gaz silindirinden bir cam Pasteur pipetiyle kabarcıklanarak "karbogen" ile devamlı bir şekilde perfüze edin. Ortamın sistem üzerinden devri daim yaptırmasına izin verin. Sistem şimdi kalbi perfüze etmeye hazırdır ( Şekil 1A ).
5. Sıçanın Diseksiyonu
- Sıçanı, 5 litrelik bir desikatörde bir davlumbazın altına yerleştirin ve havalandırma deliğinden 1.5 mL% 4-5 izofluran ekleyin ve kapağı kapatın.
NOT: Hayvanı sıvı izofluran ile doğrudan temastan kaçınmak için, hayvanı desikatöre yükseltilmiş delikli plakanın üzerine koyun. - Sıçan kapak refleksini kaybedene kadar bekleyin (genellikle ~ 5 dak) ve sonra sıçanı desikatöre götürün. Sıçanı servikal çıkıkla euthanize edin.
- Karın derisini ve yatan kas horizasını kesin.Ortada bir çift keskin makas kullanarak müttefik. Bundan sonra kasları dikey olarak sıçanın göğüs kafesine kadar kesin ve toraks açın. Kalbi ciğerler ile birlikte çıkarın ve hemen orjinalleri buz soğukluğunda% 0.9 NaCl solüsyonuna yerleştirin.
- Akciğerleri bir çift makas yardımıyla çıkarın ve atın. Herhangi bir bağ dokusunun kalbini temizleyin ve brakiocefalik gövdenin dala kaudal olarak aort kesmek.
6. Kalbin Perfüzyonu ve Kollajenazla Sindirim
- İki çift ince, kıvrımlı forseps kullanarak kalbi Langendorff perfüzyon sistemindeki aort yoluyla bağlayın (Bölüm 4). Miyokardın geriye doğru şekilde perfüze olmasını sağlamak için perfüzyon sisteminin kanülünün ucunu ilk aort dalı ile aort kapağı arasına yerleştirin. Bir timsah kelepçe kullanarak aortu düzeltin.
- Kalbi bir ameliyat dikişiyle düzeltin ve timsah kelepçesini çıkarın ( Şekil 1B ).
- Herhangi bir kalıntı kanı temizlemek için perfüzyon maddesinin (35 mL) kalpten damla damla geçişine (60 damla / dak; 5 mL / dakika) izin vermek için kanül valfini açın. Bu aşamadaki akışları atın.
NOT: Perfüzyonun herhangi bir evresinde hava kabarcığı oluşumundan kaçının; bu, eksik hücre sızıntısına ve hücre izolasyon prosedürünün başarısız olmasına neden olur. - Sarkan kalbi toplama hunisine (kalp odası: Şekil 1B ) yerleştirin ve perfüzyon ortamını toplama hunisinden rezervuara ( Şekil 1A ) sirküle edecek olan peristaltik pompayı çalıştırın.
- Kollajenaz çözeltisini (2.8. Adımdan) perfüzyon ortamına ekleyin. Kolajenaz çözeltisinin tekrar dolaştırılması ile kalbi 30 dakika süreyle çalıştırın.
NOT: Hücrenin verimini optimize etmek için bu adım çok önemlidir. Perfüzyon süresi, partiye bağlı olarak değişebilen kollajenazın aktivitesine bağlıdır. Opti olanı bulmak için kollajenazın 3-4 partisini test edinMal aktivitesi; Tekrarlanabilir sonuçlar için en az bir yıl için yeterli olan en uygun partinin büyük miktarı satın alınabilir. - Sindirim süresinin sonunda, perfüzyonu durdurun, kalp Langendorff sisteminden bir çift makas kullanarak çıkarın ve bir cam Petri kabına koyun.
- Kesip atriyum atın ve artık yağ dokularını çıkarın. Epitelyal hücrelerin kirlenmesini önlemek için dikkatle iki çift forseps yardımı ile perikard soyun.
NOT: Gerekirse saf kalp epitel hücreleri elde etmek için perikard kollajenaz ile daha da sindirilebilir. Bu çalışmada ayrıntılı protokol verilmemiştir, çünkü bu, mevcut protokolün kapsamı dışındadır. - Kalbi bir çift makasla ortadan kesin ve doku kıyıcıya koyun. Kalbe 2-3 kez küçültün ve kıyılmış dokuyu 12 mL'lik sindirim tamponunda Langendorff perfüzyonundan tekrar askıya alın.
NOT: h parçasını kesmeÖlü kardiyomiyositlerin daha yüksek bir oranına neden olacağı için aşırı derecede yedirin. - Kıyılmış dokuyu 15 mL kollajenaz içeren disosiyasyon ortamına aktarın ve 5 mL tek kullanımlık bir plastik pipet kullanarak tekrar süspansiyon ile arada sırada karıştırarak 5-10 dakika boyunca bir su banyosunda sindirin.
- Sindirim periyodunun sonunda, hücre süspansiyonunu 100 um elekten geçirin. Doku parçalarını ve sindirilmemiş malzemeyi atın.
- Langendorff perfüzyonunun sonunda, perfüzyon sistemini derhal en az 1 L damıtılmış su ile yıkayın. Sistemi, 100 mL 0.1 N NaOH'yi 30 dakika boyunca tekrar sirküle ederek boşaltın ve sistemi 2-3 L damıtılmış suyla yıkayın. Sistemi havayı yıkayarak kurutun ve açıklığı para filmle örtün.
7. Sıçan Kardiyak Hücre İzolasyonu
- Kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü
- Hücre süspansiyonunu 1 dakika 25 x g'de santrifüjleyin (br olmadan)Akes) kardiyomiyositlerin pelet haline getirilmesi. Kardiyomiyositlerin oda sıcaklığında santrifüj uygulanmadan 10 dakika dinlendirilmesine izin verilebilir.
- Dikkatle, yeni bir 50 mL tüp içinde bir atılabilir plastik pipet yardımı ile endotel hücreleri ve fibroblast içeren süpernatantı çıkarın.
- Ca 2+ 6 mL solüsyon 1 (Adım 2.9) kardiyomiyosit peletini süspansiyon haline getirin. Hücrelerin düşük Ca2 + konsantrasyon ortamına ayarlaması için 1 dakika bekleyin ve hücre süspansiyonunu 1 dakika boyunca (frensiz) 25 xg'de tekrar santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve hücre pelletini 6 mL Ca 2+ solüsyon 2 (Adım 2.9) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin 1 dakika boyunca Ca 2+ ara konsantrasyonuna ayarlanmasına ve son olarak hücrelere 12 mL Ca 2+ solüsyon 3'ün (Adım 2.9) ilave edilmesine izin verin. Tek kullanımlık bir plastik pipet yardımı ile karıştırın.
- 1 dakika 25 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve hücreleri 20 mL pre-Çarp CCT orta. Laminin (Adım 2.9) ile önceden kaplanmış 20 steril 35 mm hücre kültürü çanağının her birine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin CO 2 içermeyen hücre kültürü inkübatöründe 2 saat süreyle bağlanmasına izin verin.
NOT: Kardiyomiyositleri ayrıca CO 2 ortamında kültürlenebilir; Ancak, bu durumda bikarbonat tamponlu ortamlar kullanılmalıdır. - 2 saat sonra, ölü hücreleri yok etmek için ortamı yeni 2 mL CCT ortamı ile değiştirin.
NOT: Hücreler planlanan herhangi bir deney için hazırdır ve canlı hücrelerin önemli bir kaybı olmaksızın tipik bir hücre kültürü inkübatöründe (CO 2 içermeyen) 3 gün boyunca kültürlenebilir. Tipik sağlıklı çubuk şeklindeki kardiyomiyositleri Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Endotel hücreleri ve fibroblastların izolasyonu
- Endotel hücreleri ve fibroblast içeren süpernatantı (basamak 7.1.2'den itibaren), 250 xg'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Supe'yi yok etRnatant ve hücre pelletini, 2 mL numune tüpünde 1.5 mL endotel hücresi izolasyon tamponuna tekrar süspanse edin.
- Hücre süspansiyonuna 3 μg (1: 500) fare anti-sıçan CD31 antikoru ekleyin ve uç uca rotasyon ile 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: En iyi seyreltme için antikor titrasyonu önerilir. Bu adım, RT'de olduğu gibi 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir; endotel hücreleri tarafından antikorun hızlı içselleştirilmesi düşük verime neden olacaktır. - Önceden hazırlanmış (Bölüm 3) pan anti-fare IgG boncukları hücre süspansiyonuna ilave edin ve uçtan uca rotasyon ile 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
NOT: Alternatif olarak fare anti-sıçan CD31 antikoru, manyetik boncuklara önceden bağlanabilir ve daha sonra hücre süspansiyonuna eklenebilir. Bununla birlikte, bu, boncukların hücre süspansiyonu ile inkübasyon süresini artıracak ve endotel dışı hücrelerin spesifik olmayan bağlanmasına ve dolayısıyla diğer hücre türlerinin daha yüksek bulaşmasına neden olabilir. - birAntikor inkübasyon süresinin sonuna kadar, hücre süspansiyonunu içeren bir tüpü bir manyetik rafta yerleştirin ve tüpün kenarına endotel hücrelere bağlı manyetik boncukların yerleşmesi için 2 dakika bekleyin.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde hücre süspansiyonunun geri kalanını (esasen fibroblastlar içeren) çıkarın ve 10 mL'lik fibroblast hücre kültürü ortamı (Adım 2.3) içeren 10 cm'lik hücre kültürü çanağına ekleyin. % 5 CO 2 içeren tipik bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İşlem, Adım 7.3'te devam eder.
- Endotel hücreleri içeren manyetik boncuklar ile tüp 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
- Tübü kapatın, manyetik raftan çıkarın ve boncukları 4-5 kez hafifçe yukarı aşağı sallayarak dikkatle tekrar süspanse edin. Tüpü manyetik rafa tekrar yerleştirin, boncukların borunun duvarına 1 dakika kadar yerleşmesini sağlayın ve yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın.
- Kirleten n'lerden kurtulmak için yıkama adımlarını 5-7 kez tekrarlayın.Endotel hücreleri.
- MV2 endotel hücresi kültür ortamı 1 ml boncuklar bağlı endotel hücreleri Tekrar, bir 12 well plaka tek bir kuyu eklemek ve CO 2 hücre kültürü kuluçka inkübe edin.
- Hücrelerin gecede bağlanmasına izin verin ve ertesi gün ortamı değiştirin ve sonra her 2-3 günde bir hücreleri yarı konfluent olana kadar (genellikle 5-7 gün) değiştirin.
NOT: 3-4 gün sonra tipik konfluent olmayan endotel hücreleri ve 7-10 gün izolasyondan sonra konfluent endotel hücreleri sırasıyla Şekil 3A ve 3B'de gösterilmektedir. Hücreler daha sonra tripsinize edilebilir (bölüm 7.4) ve bir T25 hücre kültürü şişesine ekilir.
- Fibroblastların yıkanması ve kültürü (basamak 7.2.6'ya devam edin)
- 1 saat inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve önceden ısıtılmış PBS'nin uygun bir hacmini ekleyerek hücre kültürü çanağına bağlanan fibroblastları yıkayın. PBS'yi aspire edin ve2-3 kez tepkimeye sokun ve son olarak önceden ısıtılmış taze fibroblast hücre kültürü ortamı ekleyin.
- Eklenen hücreleri bir sonraki gün tekrar önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın (önceki aşamada olduğu gibi) ve önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Ortamı her 2-3 günden sonra değiştirin. İzolasyonun 2. gününde fibroblastların tipik bir fenotipi Şekil 4A'da gösterilmiştir.
NOT: Fibroblastlar genelde 5-7 gün içinde yarı konfluent olurlar ve daha sonra trippine edilmeye hazır olurlar (bölüm 7.4) ve planlı deneyler için kullanılırlar. Bu prosedürle, genellikle% 95-99 saf fibroblast elde ediyoruz. İzolasyonun 7. gününde fibroblastların tipik bir fenotipi Şekil 4B'de gösterilmektedir.
- Endotel hücreleri ve fibroblastların tripsinasyon
- Ortamı hücre kültürü çanak aspire ve hücreleri kapsayacak kadar önceden ısıtılmış PBS ekleyin.
- PBS'yi aspire edin ve hücreleri örtmek için yeterli tripsin-EDTA solüsyonu (sırasıyla% 0.05 ve% 0.02) ilave edin.37 ° C inkübatör 5 dakika boyunca.
- 1 mL'lik bir pipet yardımı ile hücreleri yukarıya ve aşağıya pipetleyerek hücreleri tekrar süspanse edin ve% 10 FCS ekleyerek tripsin eylemini durdurun.
- Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle 250 xg'de santrifüje tabi tutarak hücre süspansiyonunu peletleyin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı uygun bir hacminde tekrar süspanse edin.
8. Endotel Hücre Karakterizasyonu
NOT: Endotel hücrelerinin saflığı Dil-Ac-LDL alımı ve von Willebrand faktörünün (vWF) immün boyaması ile belirlenir. Hücreler, flüoresan veya konfokal mikroskopi ( Şekil 3C-3E ) ile görselleştirilir.
- Endotel hücreleri tarafından Dil-Ac-LDL alımı
- Endotel hücreleri (adım 7.4) Trypsinize ve 12 kapaklı plaka (yaklaşık 10 x 10 4 hücre / cm 2 ) cam lamelleri gece boyunca onları kültür.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL pre-w ile yıkayınSilahlı HBSS.
- HBSS'yi aspire edin ve 10 μg / mL Dil-Ac-LDL içeren 1 mL endotel hücre kültürü ortamı ilave edin ve 4 saat boyunca 37 ° C inkübatöre hücreleri bırakın.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın ve 1 mL% 4 paraformaldehitle (PFA, PBS içinde çözülmüş olarak) sabitleyin. Onları PFA ile 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
NOT: PFA aşındırıcıdır; PFA çözeltisini kullanırken daima asite dayanıklı eldiven kullanın. - PFA aspire, 1 ml PBS ile 12 yuvalı plakada lamel hücreleri yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca nükleer boyama çözümü TO-PRO (10 μM) ile inkübe edin.
NOT: Mikroskop için uygun filtre varsa, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 ug / mL) de kullanılabilir. Bu durumda inkübasyon süresi 10 dakikaya indirilmelidir. - 1 ml'lik PBS ile 12 oyuklu plakada lamel hücreleri durulayın, PBS aspirat ve adım üç kez tekrarlayın.
- C alın12 kuyucuklu plakayı çıkarın ve bir damla montaj ortamı ile cam bir slayda monte edin. Hücreler bir floresan / konfokal mikroskop altında görselleştirmeye hazır. Dil-Ac-LDL için 530-560 nm, TO-PRO için 640 nm ve DAPI için 340-380 nm'lik bir uyarım filtresi kullanın.
- Von Willebrand (vWF) boyama
- Adım 8.1.1'de açıklandığı gibi endotel hücrelerini kültürleyin.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış HBSS ile durulayın; Bundan sonra, adım 8.1.4'te tarif edildiği gibi% 4 PFA ile sabitleyin.
- PFA'yı aspire edin, iki kere 1 mL'lik PBS ile 12 oyuklu plakada lamellerin üzerindeki hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 mL% 0.1 Triton X-100 (PBS içinde) ile hücreleri permeabilize edin.
- Geçirgen hale getirme çözeltisini aspire edin ve hücreleri bloke edici çözelti (PBS içerisinde% 5 BSA /% 5 FCS) ile 1 saat boyunca inkübe edin.
- 4 gece nemlendirilmiş bir odada gece boyunca tavşan anti-vWF antikor (1: 100) ile hücreleri inkübe edin. Bu olmadan bir lamel ekleyinBirincil antikor negatif kontrol olarak.
- 1 mL PBS ile üç kez 12 kaplı plakada lamelleri yıkayın ve 1 saat boyunca eşek anti-tavşan Alexa Fluor-488 antikor (1: 500) ve nükleer boyama çözümü TO-PRO ile hücreleri kuluçkaya yatırın RT'de.
- 1 mL PBS ile 12-iyi plakada lamel hücreleri durulayın, PBS aspirat ve adım üç kez tekrarlayın.
- 12 yuvalı plakadan lamelleri alın ve bir damla montaj ortamı ile cam slayt üzerine monte edin. Hücreler bir floresan / konfokal mikroskop altında görselleştirmeye hazır. VWF için 490 nm ve nükleer boyama için 640 nm'lik bir uyarılma filtresi kullanın.