Yöntem makalesi

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

DOI:

10.3791/55623

⸱

13 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok parametreli flüoresan algılama (MFD) modunda tek molekül seviyesinde Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak yüksek hassasiyetli boyacılar arası mesafe ölçümlerinin nasıl yapılacağı üzerine bir protokol burada sunulmuştur. MFD, fotofizik ve deneysel eserleri azaltmak için flüoresanın tüm "boyutlarını" maksimize eder ve rijid biyomoleküllerde ~ 1Å kadar bir doğrulukla boyarmadde mesafe ölçümünü sağlar. Bu yöntem, ligand bağlanması üzerine reseptörün aktivasyonunu açıklamak için N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanının üç konformasyonel durumunun tanımlanması için kullanılmıştır. Bilinen kristalografik yapıları deneysel ölçümlerle karşılaştırırken, daha dinamik biyomoleküller için 3 A'dan küçük bir alan üzerinde anlaşmışlardır. Biyomoleküllerin tüm boyutlarını kapsayan bir dizi mesafe sınırlamaları toplamak dinamik biyomolekülün yapısal bir modelini mümkün kılabilires.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal biyoloji çalışmalarının temel amacı, biyomoleküler makinelerin yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmaktır. Biyomoleküllerin ( örn., Proteinler ve nükleik asitler) ilk görsel izlenimi 1950'lerde X-ışını kristalografisi 1 , 2 ile oluştu. X-ışını kristalografisi, kristal ambalaj ile sınırlandırılmış yüksek çözünürlüklü, statik yapısal bilgiler sağlar. Bu nedenle, X-ışını yapısal modellerinin doğasında olan hareketsizliği, biyomoleküllerin dinamik doğasından kaçınır; bu, çoğu biyolojik fonksiyonları etkileyen bir faktördür 3 , 4 , 5 . Nükleer manyetik rezonans (NMR) 6 , 7 , 8 sulu solüsyonlarda yapısal modelleri çözerek problemin alternatif bir çözümünü sağlamıştır. Büyük bir avantajNMR, yapısı, dinamikleri ve fonksiyonu arasındaki gerçek ilişkileri netleştirmeye yardımcı olan biyomoleküllerin ve konformasyonel toplulukların intrensek dinamik doğasını kurtarma yeteneğidir. 3 , 4 , 5 . Bununla birlikte, NMR, numune büyüklüğü ve büyük miktarlarda numune ile sınırlı olduğundan, daha büyük sistemler için karmaşık etiketleme stratejileri gerektirir. Bu nedenle, yapısal biyolojide alternatif yöntemler geliştirmek için acilen bir ihtiyaç vardır.

Tarihsel olarak, Förster rezonans enerji transferi (FRET) 9 , yapısal biyolojide önemli bir rol oynamadı FRET'in düşük doğruluklu mesafe ölçümleri sağladığı yanılgısından dolayı. Bu protokolün amacı, FRET'in nanometre ölçeğindeki mesafeleri belirleme yeteneğini tekrar gözden geçirmektir; bu mesafeler, biyomoleküllerin yapısal modellerini oluşturmak için kullanılabilir. İlk deneysel doğrulamaFRET verimliliğine R - 6 bağımlılığının bağımlılığı, 1967'de Stryer tarafından 10 "spektroskopik cetvel" olarak çeşitli uzunluklarda poliprolinlerin ölçülmesi ile gerçekleştirildi. Benzer bir deney, 2005 yılında tek molekül seviyesinde başarılmıştır 11 . Poliprolin molekülleri ideal olmayan oldukları ortaya çıkmış ve bu nedenle çift sarmallı DNA molekülleri daha sonra kullanılmıştır 12 . Bu, kesin uzaklık ölçümleri için pencereyi açtı ve biyomoleküllerin yapısal özelliklerini tanımlamak için FRET'in kullanılması fikrini verdi.

FRET, boyanacak mesafe aralığı ~ 0.6-1.3 R 0 arasındayken optimaldir, burada R 0 Förster mesafesidir. Tek moleküllü FRET deneylerinde kullanılan tipik fluoroforlar için R 0 ~ 50 A'dır. Tipik olarak FRET, yapıları ve dinamikleri çözme ve ayırma becerisi bakımından diğer yöntemlere göre birçok avantaj sunmaktadırHeterojen sistemler: (i) Floresansın nihai hassasiyetinden dolayı, tek moleküllü FRET deneyleri 13 , 14 , 15 , 16 heterojen toplulukları bireysel üyelerin yapılarını doğrudan sayarak ve aynı anda karakterize ederek çözümleyebilir. (Ii) Kompleks reaksiyon yolakları tek moleküllü FRET çalışmalarında doğrudan çözülebilir, çünkü bir toplulukta senkronizasyona ihtiyaç yoktur. (Iii) FRET, biyolojik olarak ilgili dinamikleri içeren geniş bir yelpazede, zaman içinde 10 yılı aşan geniş bir zaman alanlarına erişebilir. (Iv) FRET deneyleri, in vitro olarak ve in vivo olarak herhangi bir çözelti koşulunda gerçekleştirilebilir. FRET'in flüoresans mikroskobu ile kombinasyonu, canlı hücrelerdeki moleküler yapıların ve etkileşimlerin incelenmesine olanak tanır 15 , 16 , > 17 , 18 , 19 , hatta yüksek hassasiyetle 20 . (V) FRET , neredeyse her boyutta ( örneğin, poliprolin oligomerler 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptaz 26 ve ribozomlar 27 ) uygulanabilir. (Vi) Son olarak, biyomoleküllerin tüm boyutlarını içeren mesafeler ağı, statik veya dinamik moleküllerin 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Bu nedenle, tek moleküllü FRET spektroskopisi, mesafeye göre sınırlandırılmış yapısal modellemede kullanılabilecek kadar hassas mesafeler türetmek için kullanılabilir. Bu, flüoresans bilgisinin sekiz boyutunu ( yani uyarma spektrumu, floresans spektrumu, anizotropi, floresans ömrü, floresan kuantum verimi, Makroskopik zaman, flüoresans yoğunlukları ve flüoroforlar arasındaki mesafe) doğru ve tam olarak mesafe sınırlamaları sağlar. Buna ek olarak, darbeli araya sokulan uyarılma (PIE), MFD(PIE-MFD) 42 ile direkt uyarım akseptörünün flüoresansını izlemek ve 1: 1 donör-toplayıcı stokiyometri içeren numunelerden kaynaklanan tek molekül olaylarını seçmek için kullanılmıştır. Tipik bir PIE-MFD kurulumu, foton algılamanın farklı spektral pencerelerde ve kutuplama özelliklerinde dört farklı kanala ayrıldığı bir konfokal mikroskop gövdesine bağlı iki palslı araya sokulmuş uyarma lazerleri kullanır. Daha fazla ayrıntı Şekil 1'de bulunabilir .

FRET'in 26 , 30 FRET sonuçları ile uyumlu atomistik benzeri yapısal modelleri elde etmek için FRET'in hesaplama yöntemleriyle birleştirilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Mevcut protokolün amacı, FRET kaynaklı mesafelerde yapısal modeller oluşturmak için ilgili metodolojiyi gözden geçirmek değildir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar diğer tekniklerle ( örn. Küçük açılı X ışını saçılmasıIng ya da elektron paramanyetik rezonans), bütünleyici yapısal biyoloji alanını doğuruyor 43 , 44 , 45 , 46 . Halihazırdaki amaç yapısal biyolojide nicel bir araç olarak FRET'in yolunu açmaktır. Bir örnek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki (LBD) üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanıldı. Nihai amaç, belirtilen sınırlamaları aşmak ve FRET'i, yüksek hassasiyette ölçülen mesafeler sağlayarak biyomoleküllerin yapısal belirlenmesi için kullanılan bütünleştirici yöntemler arasında getirmektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PBS Tampon Hazırlama ve Oda Tedavisi

NOT: Islak kimyasal deneyler yaparken bir laboratuar ceketi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Lazeri hizalarken göz koruma kullanın.

  1. PBS tampon preparasyonu
    1. 400 mL distile edilmiş suda 4.5 g Na2HPO4, 0.44 g NaH2PO4 ve 3.5 g NaCI çözündürün. 7.5 pH değerine getirin ve solüsyonu 1 saat süreyle otoklavlayarak sterilize edin (otoklav sistemine bağlı olarak).
    2. 15 mL PBS solüsyonunu alın ve 0,1 gr odun kömürü ile karıştırın. Karışımı, 0.2 um gözenek boyutlu 20 mL şırınga filtresi kullanarak filtreleyin . PBS tamponunu oda sıcaklığında mühürleyin ve saklayın.
  2. Mikroskop bölmeli kapak cam tedavisi
    1. 500 μL damıtılmış su ve 5 μL polisorbat 20 noniyonik sürfaktan ekleyin (Malzeme Listesine bakın)(Bakınız Malzeme Listesi) ve iyice karıştırın. Bırakın 30 dakika bekletin. Polisorbat 20 solüsyonunu çıkarın ve bölmeyi iki kez damıtık suyla yıkayın. Kurutun.
      NOT: Oda kullanıma hazırdır.

2. DNA Numune Hazırlama

NOT: Çift sarmallı DNA (dsDNA) standart numunelerinin oluşturulması için tasarlanmış etiketli DNA iplikçikleri kullanın (Malzeme Listesine bakın). Belirlenen mesafeden ödün verebilecek eserlerden kaçınmak için tasarlanan oligoların bir polimerin ucunda boyaların olmaması gerekir. DNA sekansı katı bir vücut gibi davranacak şekilde seçilmelidir.

  1. Bir donör etiketli DNA sarmalının 1.5 uL'sini ve bir mikrofuzyon tüpüne bir tamamlayıcı (akseptör etiketli veya etiketsiz) DNA ipliğinin 4.5 uL'ini ekleyin ve nükleaz içermeyen suyun 24 uL'si ile karıştırın.
    NOT: Seçilen oligonükleotidlerin karışımına bağlı olarak, aşağıdaki örnekler oluşturulacaktır: no-FRET, loW-FRET veya yüksek FRET dsDNA'ları.
  2. DNA'yı bir termal karıştırıcı kullanarak hibridize edin: 95 ° C'de 10 dakika, 90 ° C'de 10 dakika, 80 ° C'de 10 dakika, 70 ° C'de 10 dakika, 60 ° C'de 10 dakika, 50 ° C'de 10 dakika 40 ° C, 10 dakika 30 ° C, 10 dakika 20 ° C, 10 dakika 10 ° C ve 5 ° C'de tutma.
    NOT: Üretilen dsDNA standartları, uzun süreli bir depolama için bir -20 ° C dondurucuda tutulabilir veya derhal kullanılabilir.

3. Protein Numunesinin Hazırlanması

Not: Bakteriyel sistemlerde ilgi protein ekspresyonu için rekombinant DNA ile başlayarak, mesafelerin ölçüldüğü kalıntıların sisteine ​​dönüştürülmesi mümkündür. Bunu yapmak için standart bölgeye yönelik mutagenez teknikleri kullanın 47 . Protein saflaştırma işlemini kolaylaştırmak için rekombinant ve mutasyona uğramış DNA'yı bir saflaştırma etiketi içeren bir vektör içine klonlayın ( örn.Bir His-etiketi). NMDA glutamat iyonotropik reseptör (GluNl) LBD'den ( yani, pET-22b (+) vektör içine klonlanmış NMDA GluNl LBD'den) glutamat altbirim 1 ligand bağlama alanı (LBD) kullanıldı.

  1. Protein ifadesi
    1. Transform DNA plazmitini seçilen ifade sistemine yerleştirin 48 .
      NOT: Aşağıdaki adımlar, çözünür bir proteinin ekspresyonunun Escherichia coli'ye dönüştürüldüğünü varsayacaktır . Örneğin, transfekte edilmiş memeli hücreleri 49 veya dönüştürülmüş böcek hücreleri 50'den saflaştırma da mümkündür ve ayrıntılı basamaklar başka yerlerde bulunabilir. Seçilen E. coli suşunun ilgili protein için uygun olduğundan emin olun. Örneğin, disülfür köprüleri içeren proteinlerin ekspresyonu, daha az azaltıcı bir hücre içi bölmeye sahip yetkili hücrelerden oluşan bir suşu gerektirir (bkz. Malzeme Listesi).
    2. Başlatıcıya inoküle et E. Koli kültürü için tek bir dönüştürülmüş koloni almak için steril bir pipet ucu kullanarak 48 . 100 mL seçici LB ortamına atın (Malzeme Listesine bakın) ve kültürün gece boyunca 37 ° C'de büyümesine izin verin.
    3. LB suyu hazırlayın (Malzeme Listesine bakın). Sterilizasyonu için otoklavlayın.
    4. 1: 500 oranında 2 L seçici LB ortamına gece kültürü ilave ederek dönüştürülmüş E. coli'nin büyük ölçekli kültürlerine inoküle edin.
    5. Önümüzdeki birkaç saat içinde, 600 nm'de kültürün absorbans okumalarını (Abs) izleyerek, bazen 600 nm'de (OD 600 ) optik yoğunluk olarak veya hücre yoğunluk ölçeri kullanarak kültür büyümesini değerlendirin. Okumaların zamanla arttığını unutmayın.
    6. Kültür 0.7'lik bir OD 600'e ulaştığında, 0.5 mM izopropil-β-d-1-tiogalaktopiranozit (IPTG) nihai konsantrasyonuyla protein ekspresyonunu indükleyin. 20-2 ° C'de 20 ° C'de sarsıntı E. coli'yi sallayın4 saat.
    7. Protein indüksiyonundan sonra, 3,000 xg ve 4 ° C'de 20 dakika bükerek E. coli'yi peletleyin. Süpernatantı atın ve kullanıma kadar -80 ° C'de hücre içi protein ihtiva eden E. coli peletini saklayın.
  2. Protein saflaştırması
    1. Seçilen bir liziz yöntemini kullanarak E. coli'yi Lyse ( örneğin, sonikasyon, Fransız basıncı, nitrojen kavitasyon, vb. ) 51 .
    2. 18500 xg ve 4 ° C'de lizatı 1 saat santrifüj ederek zar ve hücre öpünü döndürün.
    3. His etiketli bir protein için, süpernatantı, hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi (Bkz. Malzeme Tablosu ) 52 kullanarak dengelenmiş, nikel yüklü, hareketsiz hale getirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) sütununa yükleyin .
      NOT: NMDA GluNl LBD için dengeleme tamponu: 200 mM NaCl, 20 mM Tris ve 1 mM Glisin, pH 8. NM için elüsyon tamponuDA GluNl LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glisin ve 400 mM İmidazol, pH 8.
      1. IMAC kolonunu düşük miktarda (~ 12 mM) imidazol içeren tamponla yıkayın.
      2. 12 mM ila 400 mM arasındaki bir imidazol doğrusal gradyeni kullanarak IMAC sütunundaki proteini eleyin.
    4. Proteini imidazol 53 içermeyen dengeleme tamponu içinde gece boyunca, adım 3.2.3.2'den çıkan eluat'ı diyaliz hortumuna yerleştirerek ve 2-3 saat süreyle sürekli karıştırma altında dengeleme tamponuna batırarak. En az bir kez daha tekrarlayın.
      NOT: 3.2.3-3.2.6 adımları His-etiketli bir proteinin saflaştırılmasını varsaymaktadır. Başka bir yöntemle arındırılıyorsa, protokolü buna göre ayarlayın.
    5. Diyaliz edilen proteinin 280 nm'de absorbans alarak protein miktarını ölçün ve Bira Yasası ( Absorbans birimi = ε L c , burada ε Sönüm katsayısı (M -1 cm -1), Burada elde edilebilir 54 ; L ışık yolunun uzunluğudur (cm); Ve c protein konsantrasyonudur (M).
      NOT: Bradford testi ve bicinchoninic asit testi de dahil olmak üzere çeşitli protein tayin analizleri mevcuttur. Her ikisi de doğru sonuçlar verir.
  3. Protein etiketleme
    1. Saflaştırılmış proteine ​​1: 1: 8 protein: verici: alıcı molar oranı ile donör (maleimid reaktif siyan yeşil boya) ve alıcı (maleimid reaktif uzak kırmızı boya) floroforlar ekleyin.
    2. 30 dakika boyunca buz üzerinde protein ve florofor karışımı inkübe edin. Kuluçka süresinin daha uzun olması mümkündür.
    3. 0.5 mL Ni-Nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) agaroz sütunu (Malzeme Listesi'ne bakın) paketleyin ve protein inkübe edildiyse adım 3.2.3'deki ile aynı denge tamponunu kullanarak dengeleyin.
      NOT: Yüklenen proteinin miktarını reçine bağlama kapasitesine uygun olarak tutun.
    4. 30 dakika sonraKübasyon, protein / florofor karışımı adım 3.3.3'te hazırlanan kolona yükleyin ve yerçekimi akışı ile arındırın.
    5. Aşırı floroforu 5 mL dengeleme tamponu ile yıkayın.
    6. Etiketli proteini yerçekimi ile 0.5 mL elüsyon tamponu ile dört kez eleyin. Protein daha önce başka proteinlerden saflaştırıldığından, herhangi bir degrade gerekli değildir.
    7. Hangi fraksiyonun etiketli proteini içerdiğini tanımlamak için her bir eluatın UV-Vis spektrometresi ile kontrol edilmesi. Proteinden (280 nm) ve her flüorofordan (siyan-yeşil fluorofor için 493 nm ve uzak kırmızı fluorofor için 651 nm) gelen absorbans doruklarının, gözle görülebilmesi için 230-700 nm'lik absorbansı tarayın. eluat.
      NOT: Tipik olarak protein, fraksiyon 2'de elütecektir.
    8. Kömürle işlenmiş PBS ile tuzdan arındırma sütununu dengeleyin (bkz. Malzeme Tablosu ) (adım 1.1).
    9. Yerçekimi akışıyla etiketli proteini tuz giderme sütununa yükleyin.
      NOT: Yüklenen proteinin miktarını seçilen tuz giderme sütunu kapasitesine uygun olarak tutun 55 .
    10. Yerçekimi akışı ile 3.5 mL odun kömürü ile işlemden geçirilmiş PBS kullanarak elute edin ve elüattan 0.5 mL'lik fraksiyonlar toplayın.
    11. Hangi fraksiyonda etiketli protein bulunduğunu belirlemek için her eluatın absorbansını 230-700 nm'den taramak için bir UV-Vis spektrometresi kullanın.
      NOT: Adımlar 3.3.8-3.3.11 temelde bir tampon değişim basamağı görevi görür. Bu amaca hizmet eden diğer protokoller de mümkündür ( örn. Geniş diyaliz). Alternatif olarak, adım 3.3.2. Adım 3.3.8'e doğrudan gidebiliriz.

4. Topluluk Koşullarında Gerekli Ölçümler (Küvette)

  1. Förster sabitinin tayini
    1. Fluorometredeki florüsyon emisyonunu (cps) f D , tarayıcıyı tam em권 elde etmek için vericiyi 15 nm'de maksimum absorpsiyon dalga boyuna uyararak tarayınYayın tayfı. Uyarım dalga boyundan 5 nm sonra başlayıp 150 nm sonra biten emisyonu izleyin. Emisyon polarizörünü 54.7 ° 'ye ayarlayarak büyü açısı koşullarını kullanın Ve uyarma polarizörlerini 0 ° 56'ya ayarlayın.
      NOT: Burada kullanılan donor florofor için Abs maksimumu 490 nm'de oluşur; Uyarma dalga boyu olarak 475 nm kullanılır ve 480-650 nm'lik emisyon izlenir. Alıcı için Abs maksimumu 645 nm'de oluşur; Uyarma dalga boyu için 630 nm kullanılır ve 635-735 nm arasındaki emisyon izlenir.
    2. Florimetreyi, 400-700 nm arasında değişen alıcı floroforun (Abs A ) bir uyarım taraması yapmak için kullanın ve emisyon polarizörünü 54.7 ° 'ye ayarlayarak büyü açısı koşullarını kullanın Ve uyarma polarizörlerini 0 ° 56'ya ayarlayın. Emisyon monokromatörünü, maksimum emisyon dalga boyundan sonra 15 nm'ye ayarlayın. Maksimum exci'ye normalleştirmeDeğer.
    3. Yayımlanmış tablolarda, kabulcinin sönme katsayısını bulun, ε A (M -1 cm -1 ) 56 veya üretici tarafından sağlanan değerleri kullanın.
      NOT: Bu yazıda kullanılan alıcı fluorofor için yayınlanan değer ε A647 = 270,000 cm -1 M -1 56'dır .
    4. J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 kullanarak spektral örtüşümü hesaplayın, burada f D , Abs A ve ε A yukarıda tanımlandığı gibidir ve dalga boyu (nm) dir. 4.1.1-4.1.3 adımlarında elde edilen tüm dalga boyuna bağlı değerleri sütunlar halinde listelemek için bir çalışma sayfası kullanın. Onları dalga boyuna göre hizalayın. Donör emisyonunun minimum dalga boyu (λ min ) ile alıcı emicinin maksimum dalga boyu arasındaki toplamı yapınE ( λmax ).
    5. Aşağıdaki formülü kullanarak Förster sabitini (R o ) hesaplayın. R = o = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , burada J adım 4.1.4'te önceden hesaplanan spektral örtüşme, Κ 2 Yönlendirme faktörü, Φ F, D Verici fluoroforun flüoresan kuantum verimi ve n floroforun bulunduğu ortamın kırılma indisidir.
      NOT: n = 1.33 (sulu tampon kullanılıyorsa) ve κ 2 = 2/3 kullanın.
    6. Donör fluoroforun kuantum verimi değerini bulun (Φ F, D , Yayınlanmış tablolarda (bakınız: Referans 57) ve Adım 4.1.4'te elde edilen spektral örtüşme değerini, Eörnek kullanılarak Förster sabitinin son değerini hesaplamak için kullanınAdım 4.1.5'ten itibaren
      NOT: Kuantum verimi yoksa, hesaplamak için aşağıdaki 4.2 adımını izleyin. Bu durumda, verici ömrü τ D, r = 4.0 ns'ye karşılık gelen Φ F, D = 0.8 kullanın.
  2. Floresan kuantum veriminin belirlenmesi
    NOT: Aşağıdaki prosedür yalnızca dinamik söndürmeyi varsaymaktadır. Statik söndürmeyi dikkate almak için, Referans 56'ya bakın. Ancak, PIE-MFD deneyleri, statik soğutma durumunda bile kuantum veriminin belirlenmesinde yararlıdır (Sonuçlara bakınız).
    1. Kuantum veriminin (Φ r ) belirlendiği hem alıcı hem de donör fluoroforlar için benzer emilim ve emisyon profillerine sahip bir referans fluorofor seçin.
      NOT: Donör için, Φ r = 0.8 ve τ r = 4 ns, kabul edici için Φ r = 0.32 ve τ r = 1.17 ns, wSırasıyla mavi-yeşil fluorofor- ve uzak-kırmızı fluorofor-etiketli oligonükleotidler için Φ r ve τ r'ye tekabül eder 57 .
    2. Sihirli açı koşullarında zamanla ilişkili tek foton sayımı (TCSPC) yöntemini kullanarak zamana bağlı floresans bozunumunu (f (t)) ölçün.
    3. Floresans bozunumunu f (t) = Σ i x i e -t / τ i şeklinde bir mono veya çok üstel bozunma fonksiyonu ile uydurun, burada x i Nüfus fraksiyonudur ve τ i Nüfus floresan ömrüdür.
    4. Türlerin ortalama ömürlerini hesaplayın, <τ> x = Σx i τ i , Burada x i Nüfus fraksiyonudur ve τ i Nüfus floresan ömrüdür.
    5. Kullanın thE formülü Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Referansın flüoresan ömrünü ve kuantum verimini ve aynı zamanda verici fluoroforun flüoresan ömrünü takarak verici fluoroforun flüoresans kuantum verimi hesaplanır.
      NOT: Bu yöntem dinamik söndürmeyi varsayar. Diğer Φ F, D tayinleri için Lakowicz 56 izleyin.

5. PIE-MFD Tek-molekül Tespiti (SMD) için Deney Hizalama

NOT: Ölçümler alırken ışıkları kapatmak daha iyidir.

  1. Donanım ayarı (Şekil 1)
    NOT: Şekil 1'de gösterilen, evde yapılı bir MFD kurulumu, tersine çevrilmiş bir mikroskop gövdesinde iki atımlı lazer ve 4 algılama kanalı ile bu deney için kullanılır. Benzer ticari sistemler var.
    1. 485 nm ve 640 nm lazerleri ve MFD kurulumunun tüm dedektörlerini açın. TCSPC edinimi ve lazerleri kontrol eden yazılımı açın. Lazer tekrarlama hızının 40 MHz olduğundan emin olun.
    2. 485 nm'lik atımlı lazer gücünü, 60X 1.2 NA suya daldırma objektifinin bir görüntü düzleminde 60 μW'a ve pulsed interleaved uyarılma modunda (PIE-MFD) 42'de 23 μW'a kadar 640 nm'lik atımlı lazer gücünü ayarlayın.
      NOT: PIE-MFD'yi ayarlamak için iki lazer sinyali lazer kontrol yazılımı içerisinde geciktirilir. 485 nm lazer uyarımı için, algılama TCSPC kanalları (TAC kanalları) 1-12,499'dur ("istem" kanalı). 640 nm lazer uyarımı için, algılama TCSPC kanalları (TAC kanalları) 12.499-50.000'dir ("gecikme" kanalı).
    3. Mikroskop objektif merceği ile kapaklı cam slayt arasına objektif daldırma sıvısı (iki damıtık su damlası) ekleyin. Görüntü düzleminin çözümün içinde ve cam yüzeyden uzakta olmasını sağlamak içinCam-sıvı arayüzünde lazerlerin yansıması nedeniyle ikinci parlak odak noktasını bulduktan sonra ayar düğmesini bir buçuk tur döndürün.
    4. Kapak camının merkezine 1 uL 100 nM Rhodamine 110 ila 50 mcL damıtılmış su ekleyin. Çözümün aynı zamanda mikroskop objektifinin merkezinde olmasına dikkat edin.
    5. Alınan fotonların sayısını en yükseğe çıkarmak için satın alma yazılımındaki foton sayı hızını izlerken iğne deliğini (boyut: 70 μm) konumlarını (x ve y yönü her seferinde bir) ayarlayın.
  2. Standart ölçüm SMD (karanlık bir odada çalışmak)
    1. Satın alma yazılımında "* .ht3" formatında 58 zaman etiketli zaman çözümlenmiş (TTTR) kontrol panelindeki "Start" düğmesine basarak adım 5.1.4'deki örneği kullanın ve sayı oranının 120 sini kaydedin.
    2. Çevrim floresan korelasyon spektroskopisini (FCS) hesaplayın 59 ,Difüzyonun karakteristik zamanını, konfokal hacimdeki moleküllerin sayısını, üçlü durum kinetiğini ve moleküler parlaklığı belirlemek için , 60 , 61 ( yani, FCS ölçümü).
      1. FCS için yazılımı açın (Kristine, MFD suite). Deney ayarlarını "Seçenekler" -> "Kurulumu Seç" seçeneğini tıklayarak seçin. Benzer deney ayarlarına sahip bir dosya seçin ve dosyadaki başlık bilgilerini okumak için "dosyadan parametreleri al" ı tıklayın.
      2. FCS gerçekleştirmek için "Operate" -> "Correlate" seçeneğini seçin.
        NOT: Kanal numaralarının doğru bir şekilde belirtildiğinden ve buna göre istemi veya gecikme kanallarını seçmek için "TAC Gate" (TCSPC kanalları) işaretli olduğundan emin olun.
      3. Uygun rutini açmak için "Çalıştır" -> "Korelasyon Eğrilerinin Küresel Uyumu" seçeneğini seçin. Yazılımdaki "denklem # 24" kullanınE ve "başlat" ı tıklayın.
        NOT: Yazılımdaki Denk. 24, serbest difüzör flüoresan moleküllerinin üç boyutlu bir Gauss aydınlatma profilinde (örneğin 61 : 1) otokorelasyon fonksiyonunu (Gc) açıklar.
        figure-protocol-1
        Burada, N , saptama hacmindeki ortalama molekül sayısıdır, x T karakteristik zaman t T , tc ile üçlü durum kinetiği gösteren moleküllerin fraksiyonudur, korelasyon zamanı, t diff , geometrik Parametre ω , ve ω Gauss aydınlatma profilini tanımlar. Uyumdan sonra, difüzyon süresine ve konfokal hacimdeki moleküllerin sayısına dikkat edin.
    3. 10 uL 100 nM Rhodamine 101, 50 uL damıtılmışa ilave edinSu ve iyice karıştırın. Bu karışımı kapak camının üzerine yerleştirin ve damlacıkların objektif merceğinin ortasında olduğundan emin olun. 120 saniyelik veriyi TTTR formatında kaydetmek için TTTR kontrol panelindeki "başlat" düğmesine tıklayın.
    4. 50 uL damıtılmış suya 1 uL'lik 100 nM uzak-kırmızı fluorofor ekleyin ve iyice karıştırın. Bu karışımı objektif merceğinin ortasına yerleştirin. "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR formatında 120 s veri kaydedin.
    5. Objektif merceğin merkezine 50 uL damıtılmış su yerleştirin. "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR formatında 300 s veri kaydedin.
    6. Objektif merceğin ortasına 50 μL PBS tamponu yerleştirin. "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR formatında 300 s veri kaydedin.
    7. Adım 5.1.4'teki karışımın 1 μL'ini alın ve 50 μL damıtılmış su ile karıştırın. Bu karışımı kapak camına yerleştirin. Önce, "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR modunda 10 s veri toplayın. Daha sonra, TT'yi analiz edinTR modu dosyasına, 5.3. Adımda anlatıldığı şekilde Burst Entegrasyonu Flüoresans Ömrü (BIFL) analiz yazılımını (Paris, MFD paketi) kullanır.
      NOT: Hızlanma seçimi ve analiz yazılımından 26 , 61 saniyede patlama sayısını doğrulayın. Patlama seviyesi her 10 saniyede 35 civarında ise, tek moleküllü ölçüm için uygundur.
    8. Sayım oranını, tek moleküllü bir ölçüm standardı olarak ele almak için 1,5 saat süreyle TTTR formatında kaydetmeye devam edin ( yani, SMD'de TCSPC).
      NOT: Büyük dosya boyutundan dolayı, ham "* .ht3" dosyalarını BIFL kullanarak yüklemek ve işlemek için daha küçük boyutlu dosyalara bölün.
  3. Standart örneklerin BIFL kullanılarak analizi
    1. BIFL yazılımını açın (Paris).
    2. "Kurulumu onayla" otomatik pop-up penceresinde PIE için kurulumu seçin ve benzer deneysel ayarlarla dosyayı seçerek başlığı okuyun. "Parametreleri al" ı tıklayınM dosyası "nı tıklayın" Tamam "ı tıklayın. Açılır pencerenin kapanacağını ve Paris ön uçına entegre edildiğini unutmayın" İleri "nin altındaki" Tamam "ı tıklayın.
    3. Analiz edilecek ölçümü seçmek için "Veri Yolu Dizisi" üzerinde "Seç" i tıklayarak analiz edilecek dosyaları seçin.
      1. "Green scatter" (su ölçümü için), "Green BG" (tampon ölçüm için), "Green thick" (2 nM Rhodamine 110 ölçümü için), "Red scatter" (su ölçümü için), " (Bir tampon ölçümü için), "Kırmızı BG" (bir tampon veya su ölçümü için), "Kırmızı kalın" (20 nM Rhodamine 101 ölçümü için), "Sarı dağılım" (su ölçümü için), "Sarı BG" "Sarı Kalın" (2 nM uzak-kırmızı fluorofor ölçüm için).
      2. "İleri" nin altındaki "Tamam" ı tıklayın.
        NOT: "Yeşil" kanal, "istem" TCSPC kanallarındaki yeşil dedektörlerin sinyaline karşılık gelir.4; Kırmızı "kanalı," istem "TCSCP kanallarındaki kırmızı dedektörlerin sinyaline karşılık gelir" Sarı "kanal, gecikme TCSPC kanallarındaki kırmızı dedektörlerin sinyaline karşılık gelir.
    4. Tek moleküllü seçim parametrelerini ayarlamak için "Veri kesme Burstwise" seçeneğinin yanındaki "Ayarla" yı tıklayın. Yeni pop-up pencerede, "Eşik" altında interphoton varış süresini ve "min" altında tek molekül olayı başına minimum foton sayısını değiştirerek ortalama interphoton varış zamanından ("dt") iki standart sapma ile tek moleküllü olayları seçin . " Açılır pencereyi kapatmak için "Geri Dön" düğmesini tıklayın. "İleri" nin altındaki "Tamam" ı tıklayın.
      NOT: Eşik, ms cinsinden, arka plan sayma oranına bağlıdır. Kullanılan tipik en düşük foton sayısı 60'tır.
    5. Oluşturmak için başlangıç ​​flüoresan ömrünü "Renk uyumu parametreleri" ni ( ör .,,, Ve konvolüsyon) ayarlayınD "floresan çürüme parametrelerini" Yeşil "," Kırmızı "ve" Sarı "renklerde gösterir. Aynı pencerede "İsteğe bağlı" ve "Gecikmeli" için "gelen" ve "için" değerlerini ayarlayın. Açılır pencereyi kapatmak için "Geri Dön" düğmesini tıklayın. "İleri" nin altındaki "Tamam" ı tıklayın.
      NOT: 2 renkli uyarılma onay kutusunun seçildiğinden emin olun. "From" ve "to", flüorür bozunma histogramındaki başlangıç ​​ve bitiş kutularına karşılık gelir (TAC kanal numarası). İlk sığdırma parametreleri düzgün seçilirse, her kanaldaki flüoresan bozunmalarına sığdırma fonksiyonu eklenir.
    6. İşlenmiş tüm ascii dosyalarını bir üst klasöre kaydetmek için sabit sürücüdeki konumu seçin.
      NOT: Paris, seçilen tüm burst'leri işler ve diğer programlar tarafından görselleştirme için kullanılabilecek birden fazla ASCII çıktı dosyası oluşturur ( örn., Margarita MFD suite).

6. dsDNA Standartları ve Numune Ölçümleriurements

  1. Odacıklı bir kaplama camına 500 μL PBS tamponu ekleyin ve oda ile objektif lensi arasına bir damla damıtılmış su yerleştirin. Kontrol pedalındaki "Başlat" düğmesine tıklayın ve analiz için kullanmak için TTTR modunda 5 dak. Veri toplayın.
  2. DsDNA standartının küçük bir miktarını (genellikle 0.1 μL, konsantrasyonu yaklaşık 1 μM) alın, PBS tamponuna ekleyin ve iyice karıştırın. Önce, "Başlat" ı tıklayarak 10 s veri toplamalısınız. Ardından, 10 saniyede 35 patlama elde etmek için patlamayı kontrol edin (adım 5.2.7 ve 5.3'te olduğu gibi). Son olarak, yukarıda açıklandığı gibi> 2 saatlik verileri TTTR formatında toplayın.
  3. Adım 5.3.3'te olduğu gibi, dsDNA örnekleri için toplanan verileri analiz edin.
  4. MFD paketi (Margarita) kullanarak patlama histogramlarını görselleştirin ve FRET verimliliğine karşı <τ D (A) > f veya F D / F A'ya karşı <τ D (A) > f'yi gösterin.
    1. Açık tO Margarita yazılımını seçin ve "Dosya" -> "İçe aktarma *. ?? 4 ve * .mti dosyaları" nı seçin. Çeşitli alt klasörler içeren üst klasörü seçin.
    2. Paris'ten türetilen parametrelerden birinin "X" in (yan çizgi) yanında tıklanarak ( örneğin, tau yeşil veya <τ D (A) > f ) görselleştirmek için parametreleri seçin; Benzer şekilde, görselleştirmek için istenen parametreyi ( örn. FRET etkinliği, F D / F A veya S PIE PIE) seçmek için "Y" nın ordini için bunu tekrarlayın.
      NOT: Bu durumda yeşil, kırmızı ve sarı kanallarda uygun arka plan sayımı oranı için FRET etkinliği, F D / F A veya S PIE doğru; Verici ve alıcıların kuantum verimleri için; Algılama verimliliği oranı (g G / g R ) için; Ve karışma (α) için. Burada g G / g R = 3.7 ve α = 0.017, sadece cihaza bağlı. Arka plan sayım oranlarıKullanılan tampona bağlıdır ve kuantum verimi değerleri önceden saptanmıştır.
    3. "Yerleşim Denklemi" penceresini "Görüntüle" -> "Yerleşim Denklemi" ni tıklayarak açarak bir FRET satırı ekleyin. Açılır menüden statik FRET satırı seçin. Uygun FRET hattını oluşturmak için uygun verici ömür ve kuantum verimi parametrelerini seçin.
      NOT: çeşitli FRET göstergelerini korelasyon için FRET satırı üretilebilir.
  5. Margarita'da FRET verimliliğine karşı stokiyometri (S PIE ) göstererek stoikiometri parametresini kullanarak verici uyarılma kaynağı (β) tarafından alıcı uyarılma için düzeltme faktörünü belirleyin (Denklem 1, aşağıda).
    NOT: β, verici numunenin stokiyometri ölçeğinde S PIE = 1.0'da bir pike sahip olacağı şekilde seçilir; Alıcı-yalnızca örnek, S PIE = 0.0 stokiyometrisine sahip olmalı ve her iki etiketle dsDNA'nın, S PIE ~ 0.5 stoikiometrisinin olması gerekir.Br /> NOT: Cihaz şimdi hazırdır ve FRET etiketli numuneleri ölçmek mümkündür.
  6. Bölüm 3'te hazırlanan FRET etiketli numuneleri aşağıdaki 6.3-6.4 adımları ile ölçün ve analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir MFD kurulumu (lazer çizgileri: 60 μW'da 485 nm ve 23 μW'da 640 nm, bölüm 5.1) kullanan tipik smFRET deneylerinde, floresans numunesi düşük pikomolar konsantrasyonda ( 10-12 M = 1 pM) seyreltilir ve Bir alt-nanosaniyelik lazer darbesinin uyarı hacmi boyunca serbestçe dağılmış etiketli molekülleri uyaran bir konfokal mikroskopta. Tipik bir konfokal hacim <4 femtolitre (fL) 'dir. Düşük konsantrasyonlarda, tek seferde tek bir molekül tespit edilir. Etiketli moleküllerden ya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, PIE-MFD tek moleküllü FRET deneyleri kullanılarak, boyalar arası mesafeleri yüksek hassasiyetle hizalamak, kalibre etmek ve ölçmek için protokol sunulmuştur. Tüm enstrüman parametrelerini titizlikle kalibre ederek, ölçülen uzaklıkların doğruluğunu artırabilir ve Angstrom doğruluğuna erişebilirsiniz. Bunu yapmak için, daha fazla karakterizasyon için popülasyonları analiz etmek ve tanımlamak için çeşitli çok boyutlu histogramlar kullanılır. Ölçülen numunelerin kararlılığını doğrulamak için ortalama makro zam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, bu maddenin içeriğiyle rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VJ ve HS, NIH R01 GM094246'dan VJ'ye verilen desteği onaylar. HS, Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama Programı ve Clemson Üniversitesi'ndeki Optik Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Teknolojileri Merkezi'nden yeni teşebbüs kredilerini onayladı. Bu proje aynı zamanda Körfez Sahil Konsorsiyumu için Keck Merkezi'nden (NIGMS Grant No.1 T32GM089657-05) Interdisciplinary Bioscience Training için bir eğitim fakültesi ve DD için Ortak İnsan Hastalıklarının Translasyonel Çalışmaları için Schissler Vakfı Topluluğu tarafından da desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
kömürMerck KGaAK42964486 320
şırınga filtresiFisherbrand09-719Cboyut: 0.20 ve mikro; m
odacıklı kapak camıFisher Scientific1554091.5 borosilikat cam, 8 kuyulu
mikroskop kapak camıFisher Scientific063014-9boyut: 24 x 60-1.5
Nükleaz içermeyen suFisher Scientific148859nükleaz içermeyen
ara-20Thermo Scientific2832010 Polisorbat 20
alıcı DNA zinciri çözeltisi ( Yüksek FRET)Entegre DNA Teknolojileri1781248955&akut;-d(CGG, CCT, ATT, TCG, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG, AT(Cy5)C, GCC, TTA, AAC, GTT, CGC, CTA, GAC ETIKETI, TCC, AAG, TAT, TGC)
alıcı DNA zinciri (Düşük FRET)Entegre DNA Teknolojileri1779564245&akut;-d(CGG, CCT, ATT, TCG, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG, ATC, GCC, TT(Cy5)A, AAC, GTT, CTA, CTA GAC ETİKETİ, TCC, AAG TAT, TGC)
donör DNA zinciriEntegre DNA Teknolojileri1779514375&akut; -d(GCA, ATA, CTT, GGA, CTA, GTC, TAG, GCG, AAC, GTT, TAA, GGC, GAT, CTC, TGT, TT(Alexa488)A, CAA, CTC, CGA, AAT, AGG, CCG)D
DNA zinciri, (FRET yok)Entegre DNA Teknolojileri, 5&akut; -d(CGG, CCT, ATT, TCG, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG, ATC, GCC, TCA, AAC, GTT, CGC, CTA, GAC ETIKETI, TCC, AAG, TAT, TGC)
termal döngüleyiciEppendorfE6331000025nexus gradyanı
Alexa Fluor 488 C5  MaleimideThermo ScientificA10254el yazmasında camgöbeği yeşili florofor olarak adlandırılmıştır
; MaleimideThermo ScientificA20347el yazmasında uzak kırmızı florofor olarak adlandırılır
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Et suyu, MillerFisher ScientificBP1426E. coli< / em>
AmpisilinSigma-AldrichA0166kültürü için100 ve mikro'da kullanılır; Plazmit seçimini sürdürmek için seçici LB ortamında g/mL nihai konsantrasyon
Tetrasilin Calbiochem5834612.5 & mikro'da kullanılır; Disülfid bağı oksidasyonunu kolaylaştırmak için Origami B (DE3) suşlarında gor (flutathione redüktaz) mutasyonunu sürdürmek için seçici LB ortamında g / mL nihai konsantrasyon
KanamisinFisher ScientificBP906-515 & mikro'da kullanılır; Disülfid bağı oksidasyonunu kolaylaştırmak için B(DE3) boyalarında trxB (rioredoksin redüktaz) mutasyonunu korumak için seçici LB ortamında g/mL nihai konsantrasyon
Origami B(DE3) Yetkili HücrelerMillipore70837-3Disülfür köprüleri ile protein ekspresyonu için yetkin E. coli hücreleri
İzopropil-β-D-tiyokalaktopiranosit (IPTG)Fisher ScientificBP1755E. coli protein ekspresyonunun indüksiyonu için
HiTrap Şelatlama HPGE Yaşam Bilimleri17-0409-01
Ni-NTA Agaroz'unQiagen30210
PD-10 Tuz Giderme KolonuGE Yaşam Bilimleri17-0851-01
AktaPurifierGE Yaşam Bilimleri28406264FPLC Enstrüman
Diyaliz tüpüSpektrum laboratuvarları13256215 kD MWCO 24 mm Düz genişlik, 10 metre/rulo
DikroiklerSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Işın ayırıcı polarizörQioptiq Linos G33 5743 00010 x 10 film polarizör
Yeşil geçişli dosyalayıcı ChromaET525 / 50mET525 / 50m 25 mm çap montajlı
Kırmızı geçiren filtreChromaET720 / 150mET720 / 150m 25 mm çap montajlı
Güç ÖlçerThorLabdPM200
UV-Vis spektrofotometreVarianCary300Bio
Fluorolog 3 florometreHoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC denetleyicisiHoribaFluorohub-BTopluluk ölçümleri için TCSPC elektroniği
NanoLed 485LHoriba485LMavi diyot lazer
NanoLed 635LHoriba635LKırmızı diyot lazer
Olympus IX73 MikroskopOlympusIX73P2FMikroskop çerçevesi
PMA 40 Hibrit DedektörPicoQuant GmbH932200, PMA 40Yeşil algılama için optimize edilmiştir
PMA 50 Hibrit DedektörPicoQuant GmbH932201, PMA 50Ed shifter hassasiyeti için optimize edilmiştir
485 nm lazerPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 nm lazerPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 ve TTTR satın alma yazılımıPicoQuant930021Pikosaniye olay zamanlayıcısı ve Zamanla İlişkili Tek Foton Koparma Ünitesi, TTTR edinme yazılımı
SEPIA II SLM 828 ve SEPIA yazılımıPicoQuant910028Pikosaniye darbeleri için Lazer sürücüsünü içerir, SEPIA yazılım denetleyicisini içerir.
bilgisayarDelloptiplex 7010işlemci: i7-3770 ram: 16GB
FRET Konumlandırma ve Tarama (FPS) yazılımıHeinrich Heine Üniversitesisüitinde bulunan Accesibel Volume clacualtor'u içerir
Heinrich Heine ÜniversitesiBIFL yazılım paketi Paris'i içerir; Çok parametreli hisotramların görselleştirilmesi için Margarita ve http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html'da Olasılık Dağılım Analizi yazılımı mevcuttur
% , , , , , , Alexa Fluor 647 C2  , His etiketli protein İmidazol Sigma-Aldrich 56749 Büyük Ölçekli FPLC Saflaştırılması için  http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html MFD

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838(2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121(2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791(2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256(2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792(2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206(2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432(2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104(2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek molek ll FRETok parametreli Floresan Alg lamaBoyalar Aras Mesafe l mNMDA Resept rLigand Ba lanma AlanKonformasyonel DurumlarFloresan Rezonans Enerji TransferiHassas Mesafe l mleri

İlgili makaleler