Method Article

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

DOI:

10.3791/55655

⸱

May 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, birden fazla fare dokusundan ara fılaman (IF) proteinlerinin hızlı ve etkin izolasyonu için biyokimyasal prosedürler sunulmaktadır. İzole edilmiş IF'ler, kütle spektrometresi ve diğer biyokimyasal testlerle translasyon sonrası modifikasyon değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta filamentler (IF), aktin filamentleri ve mikrotübüller ile birlikte, her hücrenin kritik bir yapısal öğesi olan hücre iskeletini oluştururlar. Normal işleyen IF'ler mekanik ve stres direnci hücrelere neden olurken, işlevsiz bir IF sitoskeletonu hücresel sağlığa zarar verir ve birçok insan hastalıklarıyla ilişkilendirilmiştir. Translasyon sonrası modifikasyon (PTM), fizyolojik değişikliklere ve stres koşullarına bağlı olarak IF dinamiklerini eleştirel olarak düzenler. Bu nedenle, IF'lerin PTM imzasındaki değişiklikleri izleyebilme özelliği, IF sisteminin hücresel yaralanma sırasında bir stres tepkisi olarak daha iyi bir fonksiyonel anlayışa ve nihai olarak şartlandırılmasına katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, 70'den fazla bireysel gen tarafından kodlanan ve dokuya bağlı bir şekilde ifade edilen çok sayıda IF proteini, farklı PTM'lerin göreli önemini belirlemede önemli bir zorluktur. Bu amaçla IF proteinleri üzerinde PTM'lerin izlenmesini sağlayan yöntemlerAilenin izole edilmiş üyeleri yerine bir organizma genelinde bu alanda araştırma ilerlemesini hızlandırabilir. Burada, 9 değişik fare dokusundan (beyin, kalp, akciğer, karaciğer, ince bağırsak, kalın bağırsak, pankreas, böbrek ve protein) IF proteinlerinin toplam, deterjana özülebilir ve deterjana dirençli fraksiyonunun izolasyonu için biyokimyasal yöntemler sunuyoruz. dalak). Ayrı bir fare dokusunun lizing matrisi ve otomatik homojenizasyonunu kullanarak IF proteinlerinin hızlı izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol daha ortaya koyduk. Otomatik protokol, yüksek numune hacmi olan deneylerde (birden çok hayvanı ve deney grubu içeren hastalık modellerinde olduğu gibi) IF'leri profillemek için kullanışlıdır. Ortaya çıkan numuneler, kütle spektrometresi tabanlı PTM profillemesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akım analizleri için kullanılabilir. Bu yöntemleri kullanarak, farklı fare dokularındaki (beyin ve karaciğer) IF proteinlerinin ekspresyonlarına paralel olarak değiştiğini gösteren yeni veriler sunmaktayızYaşlanma esnasında serum düzeyleri ve PTM'ler.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IF'ler, insanlarda 73 gen ile kodlanan ve altı ana tipte sınıflandırılan protein ailesidir: I-IV tipleri sitoplazmiktir ( örn., Epitelyal ve saç keratinleri (K), miyosit desmin, nevrofilamentler, glial fibriler asidik protein (GFAP) ve diğerleri); V tipi nükleer lamindir; Ve tip VI, göz mercekinde 1 IF'lerdir. Moleküler organizasyonları bakımından, IF proteinleri üç ortak alana sahiptir: yüksek oranda korunmuş sargılı bobin çubuk alanı ve küresel "baş" ve "kuyruk" alanları. IF protein tetramers, mekanik koruma 2 , stres algılama 3 , 4 , tr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

1. Preparatlar

  1. Triton-X tamponu (% 1 Triton X-100, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde hacim getirin). 500 mL yapmak için: Triton X-100 ve 500 mM EDTA'dan her biri 5 mL, 490 mL PBS'ye, pH 7.4'e karıştırın. Triton-X tampon çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
  2. Yüksek Tuz Tamponu (10 mM Tris-HC1, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCI, 5 mM EDTA,% 0.5 Triton X-100, çift damıtılmış (dd) H20 ile hacim getirin) hazırlayın. 500 mL yapmak ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lizing matrisi kullanarak birden çok fare dokusundan IF proteinlerinin yüksek tuz esaslı ekstraksiyonu için yeni hızlı bir yöntem.

Orta fılamat protein fraksiyonunun hacmini epitel dokudan izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem 25,26 burada dokuz farklı organı ve doku lizisi için daha hızlı bir prosedürü içerecek şekilde değiştirildi. Geleneksel yöntem için 3 manue.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IF proteinlerinin biyokimyasal olarak tanımlanmasını sağlayan yöntemler, IF proteinleri hem hücresel hem de doku stresinin belirteçleri ve modülatörleri olduğu için, memeli sistemlerinde çok sayıda patofizyolojik olayı anlamak için yararlı olabilir. Mevcut yöntemin arkasındaki ilke, IF proteinlerini hücrelerden ve dokulardan izole etmek, ayırmak ve yeniden oluşturmak için 1970'lerde ve 1980'lerde geliştirilen başlangıç ​​prosedürlerine dayanmaktadır, bunlar genellikle düşük ve yüksek tuzlu çözeltiler ve Triton-X.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] ve P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill'e] tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, qPCR ve batı leke deneyleriyle ilgili yardım için Deekshita Ramanarayanan'a teşekkür ederler.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009immünopresipitasyon
boncukları PBSThermoFisher Scientific10010049tamponlar için
Purelink RNA mini kitiThermoFisher Scientific12183018Dokudan RNA ekstraksiyonu
Purelink DNAse setiThermoFisher Scientific12185010Akolon DNA sindirimi
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Ddynabeads ile kullanım için mıknatıs
GelCode Mavi Leke ReaktifiThermoFisher Scientific24592kütle spektrometresi uyumlu jel lekesi
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106western blot'ta kullanım için
Yüksek Kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kitiThermoFisher ScientificGenekspresyon analizinde kullanım için
Proflex 3 x 32 oyuklu PCR SistemiThermoFisher Scientific4484073PCR sistemi
PVDF transfer membranı Western blot içinThermoFisher Scientific88520
Power Up SYBR ana karışımıqPCR analizi için ThermoFisherScientificA25778
RNAlaterRNA izolasyonu öncesi doku depolaması içinThermoFisher ScientificAM7020
Novex %4-20 Tris Glisin JelThermoFisher ScientificXP04205BOXPrekast protein jeli
Anti-Keratin 8 antikor (TS1)western blot tespiti içinThermoFisher ScientificMA514428
Vimentin Triswestern blot tespiti içinThermoFisher Scientific
25x)jellerinin ıslak transferi içinThermoFisher ScientificLC3675
2x SDS Numune TamponuThermoFisher ScientificLC2676hazırlamak için protein jel örnekleri
Tris Glisin SDS Koşu Tamponu (10x)ThermoFisher Proteinjellerini çalıştırmak içinLC26755
Lysing boncukları - Matrix DMP Biyomedikaller116913100Doku bozulması ve RNA ekstraksiyonu için Lizis boncukları ve matris tüpleri
Lizing boncukları - Matrix SSMP Biyomedikal116921100Doku bozulması ve protein ekstraksiyonu için lizis boncukları ve matris tüpleri
NanoDrop Lite SpektrofotometreThermoFisher ScientificND-LITEprotein ve nükleik asit ölçümü
Precellys 24 homojenizatörBertin InstrumentsEQ03119Otomatik doku homojenizatörü
üzerinde4368813 çözeltisiK8 Anti-Vimentin'in Glisin Transfer Tamponunun MA511883 (Protein bilimsel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Archite....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intermediate Filament ProteinsPost translational ModificationsMouse Tissue IsolationAging associated ChangesDetergent Soluble FractionHigh Salt ExtractionAutomated Tissue HomogenizationMass Spectrometry ProfilingImmunoprecipitation AssayWestern Blot Analysis

Related Articles