Yöntem makalesi

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

DOI:

10.3791/55655

⸱

18 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, birden fazla fare dokusundan ara fılaman (IF) proteinlerinin hızlı ve etkin izolasyonu için biyokimyasal prosedürler sunulmaktadır. İzole edilmiş IF'ler, kütle spektrometresi ve diğer biyokimyasal testlerle translasyon sonrası modifikasyon değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta filamentler (IF), aktin filamentleri ve mikrotübüller ile birlikte, her hücrenin kritik bir yapısal öğesi olan hücre iskeletini oluştururlar. Normal işleyen IF'ler mekanik ve stres direnci hücrelere neden olurken, işlevsiz bir IF sitoskeletonu hücresel sağlığa zarar verir ve birçok insan hastalıklarıyla ilişkilendirilmiştir. Translasyon sonrası modifikasyon (PTM), fizyolojik değişikliklere ve stres koşullarına bağlı olarak IF dinamiklerini eleştirel olarak düzenler. Bu nedenle, IF'lerin PTM imzasındaki değişiklikleri izleyebilme özelliği, IF sisteminin hücresel yaralanma sırasında bir stres tepkisi olarak daha iyi bir fonksiyonel anlayışa ve nihai olarak şartlandırılmasına katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, 70'den fazla bireysel gen tarafından kodlanan ve dokuya bağlı bir şekilde ifade edilen çok sayıda IF proteini, farklı PTM'lerin göreli önemini belirlemede önemli bir zorluktur. Bu amaçla IF proteinleri üzerinde PTM'lerin izlenmesini sağlayan yöntemlerAilenin izole edilmiş üyeleri yerine bir organizma genelinde bu alanda araştırma ilerlemesini hızlandırabilir. Burada, 9 değişik fare dokusundan (beyin, kalp, akciğer, karaciğer, ince bağırsak, kalın bağırsak, pankreas, böbrek ve protein) IF proteinlerinin toplam, deterjana özülebilir ve deterjana dirençli fraksiyonunun izolasyonu için biyokimyasal yöntemler sunuyoruz. dalak). Ayrı bir fare dokusunun lizing matrisi ve otomatik homojenizasyonunu kullanarak IF proteinlerinin hızlı izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol daha ortaya koyduk. Otomatik protokol, yüksek numune hacmi olan deneylerde (birden çok hayvanı ve deney grubu içeren hastalık modellerinde olduğu gibi) IF'leri profillemek için kullanışlıdır. Ortaya çıkan numuneler, kütle spektrometresi tabanlı PTM profillemesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akım analizleri için kullanılabilir. Bu yöntemleri kullanarak, farklı fare dokularındaki (beyin ve karaciğer) IF proteinlerinin ekspresyonlarına paralel olarak değiştiğini gösteren yeni veriler sunmaktayızYaşlanma esnasında serum düzeyleri ve PTM'ler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IF'ler, insanlarda 73 gen ile kodlanan ve altı ana tipte sınıflandırılan protein ailesidir: I-IV tipleri sitoplazmiktir ( örn., Epitelyal ve saç keratinleri (K), miyosit desmin, nevrofilamentler, glial fibriler asidik protein (GFAP) ve diğerleri); V tipi nükleer lamindir; Ve tip VI, göz mercekinde 1 IF'lerdir. Moleküler organizasyonları bakımından, IF proteinleri üç ortak alana sahiptir: yüksek oranda korunmuş sargılı bobin çubuk alanı ve küresel "baş" ve "kuyruk" alanları. IF protein tetramers, mekanik koruma 2 , stres algılama 3 , 4 , transkripsiyon regülasyonu 5 ve büyüme ve diğer kritik hücresel fonksiyonlarla ilgili olan dinamik sitoskelet ve nükleoskelet yapılarını şekillendiren olgun filamentlere dahil olan kısa filament öncüleri oluşturmak üzere bir araya gelir."1 , 6 , 7 .

IF sisteminin işlevsel önemi, nöropatiler, miyopati, cilt kırılganlık bozuklukları, metabolik işlev bozuklukları ve erken yaşlanma sendromları gibi IF genlerinde missense mutasyonlarının yol açtığı birçok insan hastalıklarının varlığı ile vurgulanır. Bazı IF geni mutasyonları neden olmaz, ancak taşıyıcılarını karaciğer hastalığında basit epitel keratin gibi hastalığın ilerlemesine yatkın hale getirir. İkincisi, epitelde IFN'lerin kritik stres koruyucu işlevlerinden kaynaklanmaktadır. Genel olarak IF'ler bazal koşullar altında en bol hücresel proteinler arasındadır, ancak çeşitli stres türleri boyunca daha da kuvvetle uyarılırlar10. Örneğin, nematod C. elegans'daki proteom çapındaki değişiklikleri değerlendiren son çalışmalar, çoklu IF'lerin yüksek şekilde düzenlendiğini ve aga eğilimli olduğunu ortaya koymuşturOrganizmal yaşlanma sırasında 11 , 12 . Uygun bir IF yapısının idame ettirilmesi, çeşitli stres biçimlerine karşı hücresel direnç için zorunlu olduğu için, IF agregasyonu yaşlanma sırasında işlevsel düşüşe katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, stres yaşayan farklı dokularda birden fazla memeli IF proteinini inceleyen organizma düzeyinde çalışmalar bulunmamaktadır.

IF'ler, hücresel talepleri karşılamak için adapte olmuş dinamik yapılardır. Örneğin, Keratinler, çözünebilir (lifsiz) ve çözünmeyen (lifli) protein havuzu 13 arasında biyosentezden bağımsız bir şekilde geçiş yapmaktadır. Normal fizyolojik koşullar altında, toplam K8 / K18 havuzunun deterjan içermeyen tamponda yaklaşık% 5 oranında ekstrakte edilebileceği, non-iyonik deterjan Nonidet P-40'da çözünür hale getirilebilecek yaklaşık% 20'ye kıyasla biyokimyasal olarak Triton- X100 14 , 15 yaş üstü. Mitoz sırasında basit tip epitelyal K8 ve K18 14'ün çözünürlüğünde dikkate değer bir artış vardır; bu, epidermal keratinlerde daha az belirgindir, ancak vimentin ve diğer tip III IF proteinleri 15 , 16'da daha belirgindir. IF proteinlerinin çözünürlük özellikleri, filament yeniden düzenlenmesi ve çözünürlüğü için anahtar post-translasyonel modifikasyon (PTM) olan fosforilasyon ile sıkıca düzenlenir 17 , 18 , 19 , 20 . Çoğu İE, korunan alanlarda bir dizi PTM tarafından kapsamlı bir düzenleme altına girer ve işlevsel değişikliklerle sonuçlanır 17 .

Bu yöntemin amacı IF alanında yeni araştırmacılar ile IF fare dokularında IF proteinlerinin çalışılması için biyokimyasal ekstraksiyon ve analitik yöntemler getirmektir. ÖzelMüttefik olarak, yüksek tuz ekstraksiyon yöntemiyle IF proteinlerinin izole edilmesine ve kütle spektrometresi ve PTM hedefleyen antikorlar vasıtasıyla PTM'lerin değişimlerinin değerlendirilmesine odaklanıyoruz. Bu yöntemler, önceden yayınlanmış prosedürleri 21 üzerine inşa etmekte ancak IF ailesinde düzenleme için ortak mekanizma ortaya çıkarmak için farklı IF protein tiplerini çıkarmak için değişiklikler içermektedir. Örneğin, belirli bir lisin kalıntısındaki K8 asetilasyonu filament organizasyonunu düzenlerken, hiperazetillenme K8 çözünmezliğini ve agregat oluşumunu teşvik eder 22 . Yakın zamanda yapılan küresel proteomik profil çalışmaları, dokuya özgü IF proteinlerinin çoğunun aynı zamanda asetilasyon hedefi olduğunu ve çoğu IF asetilasyon sahasının yüksek oranda korunmuş çubuk alanıyla sınırlandırıldığını ortaya koymuştur. Bu, IF sisteminin küresel profillemesi için uygun yöntemlere duyulan ihtiyacın altını çizer. Opti'de otomatik homojenizasyon kullanarak çok sayıda dokudan IF proteinlerini izole etmek için hızlı bir yöntem de sunuyoruzMized lysing matrisi. Elde edilen müstahzarlar, kütle spektrometrisi ve diğer metotlar ile aşağı akım PTM analizi için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

1. Preparatlar

  1. Triton-X tamponu (% 1 Triton X-100, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde hacim getirin). 500 mL yapmak için: Triton X-100 ve 500 mM EDTA'dan her biri 5 mL, 490 mL PBS'ye, pH 7.4'e karıştırın. Triton-X tampon çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
  2. Yüksek Tuz Tamponu (10 mM Tris-HC1, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCI, 5 mM EDTA,% 0.5 Triton X-100, çift damıtılmış (dd) H20 ile hacim getirin) hazırlayın. 500 mL yapmak için: 10 mL 0.5 M Tris-HC1 (pH 7.6), 14 mL 5 M NaCI, 55.9 g KCI, 5 mL 0.5 M EDTA ve 2.5 mL Triton X-100 karıştırın, hacmi 500'e ayarlayın ML, çift damıtılmış su kullanılarak). Yüksek Tuz Tamponu çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
  3. Kullanımdan hemen önce, uygun bir miktarda Triton-X ve Yüksek Tuz Tamponu ( Örneğin her 25 mg'lık doku örneği için 1 mL) bir proteaz veya proteaz / fosfataz inhibitör kokteyli ile inkübe edin ve inhibitörleri içeren kullanılmayan tamponları atın.
  4. 1 x PBS, pH 7.4 içinde 5 mM EDTA hazırlayın. 500 mL yapmak için: 5 mL 0.5 M EDTA, 495 mL 1x PBS (pH 7.4) içine karıştırılır.
  5. Veteriner kılavuzlarına ve kurumsal standartlara uygun onaylanmış protokolleri kullanarak farklı fare organlarını (beyin, kalp, akciğer, karaciğer, pankreas, kolon, bağırsak, böbrek, dalak) izole edin 23 . Doku toplama prosedürü, proteaz bakımından zengin dokuların RNA ve protein bütünlüğünü korumak için ( örneğin pankreasın ilk önce işlenmesi gerekir) 5 dakikayı aşmamalıdır.
  6. İleriki RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve IF gen ekspresyonu için nicel gerçek zamanlı PCR analizi için az miktarda doku (~ 5-20 mg) kesin ve RNA depolama çözeltisine yerleştirin. RNA depolama çözeltisi tüplerini gece boyunca 4 ° C'de doku ile birlikte yerleştirin ve daha fazlaToraj ve izolasyon adımları.
  7. Doku geri kalanını daha küçük parçalara ( örneğin 0.5 cm) kesin ve cryovial içine yerleştirin. Viyalleri -80 ° C'de veya sıvı azot ile sıkıca tutun ve depolayın, daha uzun süreli depolama için.

2. IF Gen İfade Analizi

  1. RNA depolama çözeltisi reaktifinde saklanan dokulardan RNA'yı çıkarın. Üreticinin protokolüne göre herhangi bir uygun / tercih edilen RNA ekstraksiyon yöntemini kullanın.
  2. RNA konsantrasyonunu ölçün ve üreticinin protokolüne göre uygun bir ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA üretmek için 2 μg RNA kullanın.
  3. Üretilen cDNA ve fare IF genine spesifik primerler kullanılarak, her örnekteki üç teknik kopyalama ve üreticinin protokolüne göre boş kontrol içeren qPCR reaksiyonları oluşturuldu.
  4. IF gen ekspresyonunu, farklı koşulları ( örneğin genç yaşlı dokuya kıyasla) karşılaştırarak katlama değişimi olarak nicelendirin.

3. PImmunoblot için Toplam Doku Lizatlarının Tazmini

  1. 1 mL 2x azaltılmayan SDS numune tamponunda 25 mg doku homojenize edin. Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir kolorimetrik protein deneyi yapılacaksa örnek tamponundan bromofenol mavisi boyası atın.
  2. İndirgenmiş numuneler yapmak için% 5 (v / v) 2-merkaptoetanol (2-ME) ilave edin. İndirgeyici olmayan örneklerin 200 μL'sine 10 μL 2-ME ekleyin.
  3. Deterjan ve indirgeme ajanı ile uyumlu protein deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Boya, numune tamponuna zaten dahil edilmişse, protein miktarı, Coomassie esaslı leke 24 de dahil olmak üzere çeşitli teknikler yoluyla bir jel çalıştırıldıktan sonra tahmin edilebilir.
  4. Tüm örnekleri vorteksleyin ve 95 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  5. Hem indirgeyici hem de indirgeyici olmayan koşullar altında western blotlama yapın. Monomerik türlerin ortaya çıkması için maruz kalma zarını kısa bir süre (<1 dak) ve yüksek moleküler kütle kompleksleri içeriğini ortaya çıkarmak için daha uzun (> 1 dk.)IF proteinleri. Toplama izlenmesi halinde, tüm jel / membranı inceleyin (jel kuyularının dipleri dahil).
  6. Paralel bir jel çalıştırın ve yükleme kontrolü olarak protein lekesi ile leke 24 . Hastalık modellerinde veya yaralanma deneylerinde toplam protein lekesi, farklı stres koşulları altında değiştiği için, 'oda temizliği' proteinleri ( örn., Aktin, GAPDH) için immünoblotlara karşı bir yükleme kontrolü olarak kullanılmalıdır.

4. Dokuya Özgü IF'lerin Deterjanlarda Çözünür ve Yüksek Tuzlu Eksiklerinin Hazırlanması

  1. 1 mL buz gibi Triton X-100 tamponunu bir cam tüp homojenleştiricisine ilave edin ve buz üzerine yerleştirin.
  2. Sıvı nitrojen deposundan küçük bir doku parçasını (~ 25 mg) çıkartın ve doğrudan cam homojenleştiriciye yerleştirin. Homojenleştirmek (50 vuruş) için bir politetrafloroetilen havlu kullanın ve kabarcık oluşumunu önleyin. Homojenizatörü ve lizatını her zaman soğuk tutun.
  3. Lizatı bir 1.5 mL micr'ye aktarınBuz üzerinde osantrifüj tüpü ve önceden soğutulmuş santrifüjde (4 ° C) 10 dakika süreyle 20,000 xg'deki santrifüj.
  4. Süpernatant fraksiyonunu ayrı bir tüp içine alın. İmmünopresipitasyon (ip) ve IF proteinlerinin deterjana-çözünür havuzunun analizi için kullanılabilen Triton X çözünür fraksiyonu. Beyin dokusundan daha temiz bir IF çıkarımı elde etmek için 4.1-4.4 adımlarının tekrarlanabileceğini unutmayın.
  5. 1 mL Yüksek Tuz Tamponunu doku peletine ilave edin, temiz bir homojenleştiriciye aktarın ve 100 darbeden kurtulun. Homojenat'ı tekrar mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüp, soğuk odada 1 saat boyunca dönen bir çalkalayıcıya yerleştirin.
  6. Homojenatları 20,000 xg'de 20 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  7. Pelete 1 mL buz soğukluğundaki PBS / EDTA tamponunu ilave edin ve son bir temizleme aşaması olarak temiz bir homojenleştiricide pelleti homojenize edin (20 vuruş) *. Yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle 20.000 xg'da santrifüj ederek IF protein-Zengin yüksek tuzlu ekstrakt (HSE).
    * İsteğe bağlı olarak, bu adımda homojenleştirme yerine girdap.
  8. Süpernatantı atın ve önceden ısıtılan 300 μL azaltılmayan SDS numune tamponu içindeki peletleri eritin. Peleti başlangıçta pipetleme ve vorteksleme ile parçalayın ve daha sonra numuneleri 95 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  9. Pelet sağlamak için girdap ve pipet eritilir. Pelletlerin tamamen çözülmesi birkaç dakika sürebilir.
  10. Analiz edilene kadar tüm numuneleri -20 ° C'de saklayın.

5. Yüksek hacimli Deneylerde IF Protein Ekstraksiyonu için Otomatik Doku Lizisi

  1. RNA ekstraksiyonu için, parçalama matrisi D (küçük seramik küreler kullanır) içeren bir tüp içine lizis tamponu (25 mg doku başına 600 μL tampon) yerleştirin ve doku lizerinde 25 sn süreyle iki kez nabız atın. 20.000 xg'de santrifüj ederek lisatı matristen ayırın ve izole olarak bir sonraki aşamaya geçin.
  2. Protein ekstraksiyonu için, Trit'i yerleştirin.(Ya da toplam lizat hazırlıyorsa SDS numune tamponu) SS lising matrisi bulunan bir liz tüpünde (tek bir paslanmaz çelik boncuk kullanınız). Birden çok matrisi test ettikten sonra bu seçildi, çünkü geleneksel douncing yöntemi ile benzer kalitede IF protein özleri üretti. Otomatik yöntemin pankreas ve dalak için optimal olmadığını ve bu dokular için standart homojenleştirme protokolünün kullanılması gerektiğini unutmayın.
  3. Yüksek Tuzlu Ekstraktın hazırlanmasına devam etmek için, bir mıknatıs kullanarak borudaki paslanmaz çelik boncuğu çıkarın ve tüpleri 20,000 xg'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  4. El ile protokolün 4. adıma (yukarıdaki) devam edin.
  5. Analiz edilene kadar tüm numuneleri -20 ° C'de saklayın.

6. Translasyon sonrası modifiye edilmiş IF proteinlerinin immüno-zenginleştirilmesi

  1. PBST tamponu (PBS içinde% 0.02 Tween-20) hazırlayın. 50 mL yapmak için 10 mL Tween-20, 50 mL PBS, pH 7.4 ekleyin.
  2. PTM antikorunu hazırlayınSolüsyonu (200 uL PBST içinde 1-10 ug antikor). Genel olarak, 3 μg antikor / reaksiyon, gerekirse daha da optimize edilebilecek iyi bir başlangıç ​​koşuludur.
  3. Her reaksiyon için, bir mikrosantrifüj tübüne manyetik boncukların 50 mcL'si alınır, mıknatısa yerleştirilir ve boncuk saklama çözeltisini aspire edin.
  4. Antikor çözeltisinde yeniden askıya alınarak ve rotatöre (küçük hacimlerin karıştırılmasını sağlamak için uçtan uca) inkübe edilerek 20 dakika boyunca oda sıcaklığında boncuklar immüno çökeltme antikoruna konjuge edin.
  5. Tüpleri mıknatısa yerleştirin ve antikor çözeltisini aspire edin.
  6. Antikor-konjüge boncuklar bir kez 200 mcL PBST durulayın ve yıkama tamponu kaldırın.
  7. Boncuklara 0.6-1 mL doku lisatı ilave edin, nazik pipetleme ile karıştırın ve rotatorda soğuk bir odada 3 saat inkübe edin.
  8. Tüpleri mıknatısa yerleştirin, lisatı çıkarın ve boncukları PBST'nin 200 μL'si ile beş kez yıkayın. Son yıkama adımından sonra boncukları 100 _6; L PBS (Tween-20 yok) ve temiz yeni bir tüpe aktarın. Boruyu mıknatısa yerleştirin.
  9. PBS'yi aspire edin ve 100 μL'lik indirgenmeyen numune tamponu ekleyin. İndirgeme örnekleri yapmak için 50 μL'yi çıkarın ve 2-ME (% 5) ekleyin. Numuneleri 95 ° C'ye 5 dakika ısıtın.
  10. İP parçasını mıknatıs üzerindeki boncuklardan ayırın ve yeni bir tüp içine alın.
  11. Analiz edilene kadar örnekleri -20 ° C'de saklayın.

7. Kütle Spektrometresi Analizinde IF protein numunelerinin hazırlanması

  1. Kütle spektrometri analiziyle ilgili önemli zaman ve maliyet olduğundan, bir çalışma başlatmadan önce bir proteomik uzmanı ile bir istişarede bulunun.
  2. Kirlenmeyi önlemek için özel tedbirler alın. Tüm jelleri temiz eldivenlerle tutun ve temiz kaplarla inkübe edin, sadece ddH2O kullanarak yıkayın (sabuntan kaçının).
  3. Standart koşullara göre bir SDS-PAGE jelinde 20-50 μL HSE örneğini (Bölüm 4 ve 5'ten) çalıştırın.
  4. Bir protein lekesi ile 1 saat boyayın. Birkaç kez durulayın ve gece boyunca ddH2O de leke temizleyin. IF protein bantları lekelemeden sonra kolayca görülebilir olmalıdır.
  5. Jeli plastik tabaka koruyucuların arasına yerleştirin, eksize edilecek ve analiz için gönderilecek bantları tarayın ve işaretleyin.
  6. IF protein bantlarını yeni bir temiz tıraş bıçağı kullanarak ayırın.
  7. Jel bantlarını temiz mikro santrifüj tüplerine yerleştirin ve bir kütle spektrometresi tesisine nakledin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lizing matrisi kullanarak birden çok fare dokusundan IF proteinlerinin yüksek tuz esaslı ekstraksiyonu için yeni hızlı bir yöntem.

Orta fılamat protein fraksiyonunun hacmini epitel dokudan izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem 25,26 burada dokuz farklı organı ve doku lizisi için daha hızlı bir prosedürü içerecek şekilde değiştirildi. Geleneksel yöntem için 3 manue...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IF proteinlerinin biyokimyasal olarak tanımlanmasını sağlayan yöntemler, IF proteinleri hem hücresel hem de doku stresinin belirteçleri ve modülatörleri olduğu için, memeli sistemlerinde çok sayıda patofizyolojik olayı anlamak için yararlı olabilir. Mevcut yöntemin arkasındaki ilke, IF proteinlerini hücrelerden ve dokulardan izole etmek, ayırmak ve yeniden oluşturmak için 1970'lerde ve 1980'lerde geliştirilen başlangıç ​​prosedürlerine dayanmaktadır, bunlar genellikle düşük ve yüksek tuzlu çözeltiler ve Triton-X...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] ve P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill'e] tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, qPCR ve batı leke deneyleriyle ilgili yardım için Deekshita Ramanarayanan'a teşekkür ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009immünopresipitasyon
boncukları PBSThermoFisher Scientific10010049tamponlar için
Purelink RNA mini kitiThermoFisher Scientific12183018Dokudan RNA ekstraksiyonu
Purelink DNAse setiThermoFisher Scientific12185010Akolon DNA sindirimi
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Ddynabeads ile kullanım için mıknatıs
GelCode Mavi Leke ReaktifiThermoFisher Scientific24592kütle spektrometresi uyumlu jel lekesi
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106western blot'ta kullanım için
Yüksek Kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kitiThermoFisher ScientificGenekspresyon analizinde kullanım için
Proflex 3 x 32 oyuklu PCR SistemiThermoFisher Scientific4484073PCR sistemi
PVDF transfer membranı Western blot içinThermoFisher Scientific88520
Power Up SYBR ana karışımıqPCR analizi için ThermoFisherScientificA25778
RNAlaterRNA izolasyonu öncesi doku depolaması içinThermoFisher ScientificAM7020
Novex %4-20 Tris Glisin JelThermoFisher ScientificXP04205BOXPrekast protein jeli
Anti-Keratin 8 antikor (TS1)western blot tespiti içinThermoFisher ScientificMA514428
Vimentin Triswestern blot tespiti içinThermoFisher Scientific
25x)jellerinin ıslak transferi içinThermoFisher ScientificLC3675
2x SDS Numune TamponuThermoFisher ScientificLC2676hazırlamak için protein jel örnekleri
Tris Glisin SDS Koşu Tamponu (10x)ThermoFisher Proteinjellerini çalıştırmak içinLC26755
Lysing boncukları - Matrix DMP Biyomedikaller116913100Doku bozulması ve RNA ekstraksiyonu için Lizis boncukları ve matris tüpleri
Lizing boncukları - Matrix SSMP Biyomedikal116921100Doku bozulması ve protein ekstraksiyonu için lizis boncukları ve matris tüpleri
NanoDrop Lite SpektrofotometreThermoFisher ScientificND-LITEprotein ve nükleik asit ölçümü
Precellys 24 homojenizatörBertin InstrumentsEQ03119Otomatik doku homojenizatörü
üzerinde4368813 çözeltisiK8 Anti-Vimentin'in Glisin Transfer Tamponunun MA511883 (Protein bilimsel

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287(2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231(2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598(2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Intermediate Filament ProteinsPost translational ModificationsMouse Tissue IsolationAging associated ChangesDetergent Soluble FractionHigh Salt ExtractionAutomated Tissue HomogenizationMass Spectrometry ProfilingImmunoprecipitation AssayWestern Blot Analysis

İlgili makaleler