Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

Özet

Sıçan kauda epididimidlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini ölçmek için hücre izolasyonunu ve tam hücreli yama klemp kayıtlarını birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, primer epididimal epitel hücrelerinin işlevsel özelliklerinin araştırılmasına ve epididimin fizyolojik rolünün aydınlatılmasına izin verir.

Özet

Epididimis, sperm olgunlaşması ve üreme sağlığı için vazgeçilmez bir organtır. Epididimal epitel, moleküler ve morfolojik özelliklerde değil aynı zamanda fizyolojik özelliklerde de farklı olan karmaşık bağlanmış hücre tiplerinden oluşur. Bu farklılıklar, epididimal lümende post-testiküler sperm gelişimi için gerekli mikro ortamı birlikte kuran çeşitli işlevlerini yansıtmaktadır. Epididimal epitel hücrelerinin biyofiziksel özelliklerinin anlaşılması, hem fizyolojik hem de patofizyolojik koşullar altında sperm ve üreme sağlığında işlevlerini ortaya çıkarmak açısından önemlidir. Fonksiyonel özellikleri henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, epididimal epitel hücreleri hücresel olayları ve tekli hücrelerin zar özelliklerini ölçmek için kullanılan bir araç olan patch-clamp tekniği kullanılarak incelenebilir. Burada, hücre izolasyonu ve mezaya tüm hücre yama-kelepçe kayıt yöntemlerini anlatacağızSıçan kauda epididimitlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini kontrol edin.

Giriş

Erkek üreme kanalındaki epididim, bir mozaik epitel hücresi tabakasıyla kaplı bir organtır. Diğer epitel dokularında olduğu gibi, epididimal epitelin çeşitli hücre tipleri, temel hücreler, berrak hücreler, bazal hücreler ve immünolojik ve lenfatik sistemlerdeki hücreler de dahil olmak üzere, uyumlu bir şekilde çalışırlar ve tüp ön hattında bariyer olarak işlev görürler. Sperm maturasyonu ve fizyolojisi için destekleyici hücreler ^{1 , 2 , 3} . Böylece, bu epitel hücreleri üreme sağlığında önemli bir rol oynamaktadır.

Epitelyal hücreler, voltaj kapılı Na ⁺ veya Ca ²⁺ kanalları ^{4 , 5'in} yokluğundan dolayı depolarize edici uyaranlara yanıt olarak tamamen veya hiç aksiyon potansiyelleri oluşturamayan uyarılmayan hücreler olarak genelde kabul edilir. Bununla birlikte, epitelyal hücreler uni ifade ederQue iyon kanalları ve taşıyıcıları, salgı ve besleyici ulaşım gibi özel fizyolojik rollerini düzenler. ⁶ . Dolayısıyla farklı epitel hücreleri karakteristik elektriksel özelliklere sahiptir. Örneğin, başlıca hücreler, sıvı ve klorür taşınması için CFTR'yi ifade eder ve TRPV6'yı kalsiyum yeniden emilim için ekspres eder, buna karşın berrak hücreler lümen asidifikasyonu için ^{1 , 7 , 8 , 9} nolu proton pompa V-ATPaz'ını ifade eder. Epididimal epitel hücrelerin fizyolojik özelliklerini düzenleyen bazı taşıyıcı ve iyon kanalları rapor edilmiştir, ancak epididimal epitel hücrelerinin fonksiyonel özellikleri büyük ölçüde yapılmamış ^{10, 11, 12, 13} ile anlaşılmış değildir.

WhOle hücreli patch-clamp kayıt, hem uyarılabilir hem de uyarılmayan hücrelerin içsel özelliklerini incelemek için iyi bilinen bir tekniktir ve özellikle heterojen hücre numunelerinde ayrışmış hücrelerin işlevlerini incelemek için yararlıdır; Voltaj kelepçesi pasif membran özelliklerini ve tek hücrelerin ^{14 , 15} iyonik akımlarını ölçmek için kullanılır. Pasif membran özellikleri arasında giriş direnci ve kapasitans bulunur. Birinci parametre, hücre membranının yüzey alanını (iyon kanalları ve taşıyıcıların bulunduğu, hücre dışı ve hücre içi ortamı ayıran ince bir izolatör görevi gören bir fosfolipid çift katmanı) ima ettiğinde, iç membran iletkenliğini gösterir. Membran kapasitansı hücre zarı yüzey alanı ile doğru orantılıdır. Giriş direnci tarafından yansıtılan membran direnci ile birlikte, membran zaman sabiti, wHücre membran potansiyelinin iyon kanal akımlarının akışına ne kadar hızlı tepki verdiğini gösterir, belirlenebilir. Bu bağlamda, hücrelere uygulanan bir dizi voltaj kademesinden gelen akım yanıt karakteristiklerinin birleştirilmesiyle, hücrelerin biyofiziksel kinetiği ve özellikleri ^{15 , 16 , 17 , 18 olarak belirlenmiştir} .

Bu yazıda, fare kauda epididimisindeki epitel hücrelerinin izole edilmesi için prosedürleri ve tüm hücre yama kelepçesini kullanarak ayrışmış hücre karışımı içindeki farklı hücre tiplerinin membran özelliklerini ölçmek için gerekli adımları açıkladık. Epididimal ana hücrelerin farklı membran elektrofizyolojik özelliklerini sergilediğini ve iletkenliklerin diğer hücre türlerinden kolayca tespit edilebileceğini gösteriyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, yerel ve uluslararası gereklilikleri yerine getiren ŞangayTech Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülür.

1. Deney Hayvanları

1. Yetişkin bir erkek Sprague-Dawley sıçanını (~ 300-450 g) 8-12 hafta arasında kullanın. Sıçanlarda bu yaşta, sperm cauda epididimidlere ulaştı.

2. Rat Cauda Epididimidlerinden Epitelyal Hücrelerin İzolasyonu

NOT: Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar, aseptik olmayan koşullar altında gerçekleştirilir.

1. Diseksiyon cihazlarının ve reaktiflerin hazırlanması
   1. Diseksiyon araçlarını% 70 etanol içine daldırarak dezenfekte edin ve hava kurumasına izin verin.
   2. Isıtma banyosunu açın (32 ° C); 500 mL 1x Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 Orta (RPMI) ile% 1 (v / v) antibio takviyeli ve önceden ısıtınTikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin final) ve "RPMI (+ P / S 1: 100)" olarak etiketlendi. Bu adımı temiz hava akışı kontrollü bir çalışma istasyonunda gerçekleştirin.
   3. Gerekli olmayan amino asitler (0.1 mM) ve sodyum piruvat (1 mM) içeren ve 5-α-dihidrotestosteron (1 nM),% 10 sığır fetusu ile takviye edilmiş 1x500 ml Iscove Modifiye Dulbecco's Medium'ı (IMDM) hazırlayın ve önceden ısıtın Serum,% 1 (v / v) antibiyotikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin finali) ve "Tam-IMDM" olarak etiketlendi. 50 mL'lik alikotlar oluşturun ve parafilm ile sızdırmaz hale getirin; 4 ° C'de saklayın. Aseptik koşulları kullanın.
   4. Solüsyondaki her bir kollajenazın 1 mg / mL'si ile sonuçlanan kolajenaz Tip I ve Tip II kolajenazı RPMI'de (+ P / S 1: 100) çözerek bir kollajenaz enzim sindirim solüsyonu hazırlayın. 0.22 μm membran boyunca filtre edin ve "Collagenase Solution" olarak işaretleyin. Kullanana kadar oda sıcaklığında (RT) tutun. Enzim çözeltisinin hacmini ayarlayınEnzimin ağırlığı üzerine; Tek bir sıçandan alınan her iki kuda epididimidi için gereken minimum hacim 2 mL'dir.
   5. RPMI ile 35 mm'lik bir çanak doldurun (+ P / S 1: 100).
2. Sıçan kauda epididimidlerinin diseksiyonu
   1. Hayvanı ya sodyum pentobarbital 85 mg / kg ip kullanarak ya da hayvanın kuyruk tutma uyarısına tepki vermeyene kadar izofluran bölmesini kullanarak kurban edin; Servikal dislokasyonu takip eder.
   2. % 70 etanol ile silerek alt karınlarını dezenfekte edin, hafifçe alt test karınlarına doğru itin ve sonra skrotumun alt karnını açın.
   3. Epididimal yağ alın, tüm üreme organlarını (testis, epididimid ve vas deferens) inceleyin ve RPMI ile çanağa (+ P / S 1: 100) daldırın.
   4. Üreme organlarını RPMI (+ P / S 1: 100) ile çaydan bir aseptik çalışma istasyonuna aktarın.
   5. Bağlayıcı ve yağ dokularından ve epi'den gelen cauda epididimidleri ayırınDidimal kapsül. Bir epididimis ~ 0.2 mL Kollajenaz Çözeltisi ile 1.5 mL tüp içine yerleştirilir. Temiz bir hava akışı kontrollü çalışma istasyonunda bu adımı gerçekleştirin.
3. Tek hücrelerin sıçan kauda epididimidlerinden ayrılması
   1. Doku yumuşak bir sıvı haline gelene kadar ince makas kullanarak Collagenase Solution içindeki epididimidleri kesin. Makasları 1.5 mL'lik tüp içindeki geriye kalan (~ 0.8 mL) enzim solüsyonuyla hafifçe durulayın.
   2. Tüp, bir metal termomikserin üzerine 30 dakika, 37 ° C'de 1000 rpm'de sallama hızı ile yerleştirilir.
   3. Enzim-doku karışımını oda sıcaklığında 30 xg'de 3 dakika santrifüjleyin ve daha çok sperm içeren yapışkan süpernatantı boşaltın.
   4. Tüm enzimatik aktiviteyi söndürmek için pelleti 1 mL Tam-IMDM'ye tekrar süspanse edin. 49 mL RPMI (+ P / S 1: 100) içeren 50 mL tüp hücre süspansiyonu aktarın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, hücre süspansiyonunu, sabit trituratlıIyonu büyük, hücre agrega önlemek için. Bununla birlikte, hücre süspansiyonunun büyüyen hücre tek tabakalarına ihtiyaç duyması halinde, örgü filtre kullanmayın.
   5. Hücresel karışımı 30 dakika oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin; Süpernatanı boşaltın.
   6. Enzimatik tedavi edilen epididimal doku karışımlarından tekli hücreleri ayırmak için pelet 1 mL Full-IMDM'de en az 5 dakika nazik tritürasyon ile tekrar süspansiyon haline getirilir.
4. Aseptik koşullar altında epitelyal hücrelerin diğer hücrelerden ayrılması
   1. % 0.5 CO _2'de 32 ° C'de bir kuluçka makinesinde, hücre süspansiyonunu tam-IMDM içeren 10 cm'lik bir Petri kabında en az 8 saat boyunca veya gece boyunca kültürleyin.
   2. % 100 alkole batırarak steril lamelleri önceden hazırlayın. Hava kurutun ve kültür ortamının küçük bir hacmine daldırın. Lamelleri 6 cm'lik kültür bulaşıkları içine koyun veya 24 delikli bir tabakın tekli oyuklarına yerleştirin.
   3. Ertesi sabah, ayrılmış epitel hücrelerini hücre süspansiyonunu hafifçe toplarken hasat edinÇoğunlukla epitel hücrelerinden oluşan Petri kabından alınır. RT'de 5 dakika boyunca 30 xg'de hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve sonra süpernatanı boşaltın.
   4. ~ 2 mL Tam IMDM'de hücre topağını tekrar süspanse edin.
   5. Her steril lamelin merkezine toplanan hücre süspansiyonu 0.2 mL'sini tohumlayın.
   6. Hücrelerin gevşek cam lamelleri yapışmasına izin vermek için hücre süspansiyonu sıvı damlacık en az 10 dakika yerleşsin. Dikkatle bir 24 delikli plakanın her kuyusuna 10 cm çanağın kenarında 1 mL Tam-IMDM'yi veya 0.3 mL Tam-IMDM'yi ilave edin; Hücreleri rahatsız etmeyin.
   7. Yama-kelepçe deneyleri kadar 32 inkübatör lamelleri üzerinde izole tek hücreler ° C% 5 CO ₂ tutun.

3. Kayıt Çözümleri ve Mikroipipetler

NOT: Yama-kelepçe deneyleri için en kaliteli kimyasalları ve çözeltileri kullanın.

1. Stok solüsyonlarının hazırlanması
   1. Stok depolaması için tüm şişeleri otoklavda tutun ve tüm stok solüsyonlarını (korozif solüsyonlar hariç) filtreleyin ve kullanılmadan önce 0.22 μm membranlardan süzün.
   2. Tüm stok solüsyonlarını oda sıcaklığında önceden hazırlayın ve 4 ^o C'de saklayın: 5 M NaCl; 1 M KCI; 100 mM _MgCl2; 100 mM _CaCl2; 200 mM _{NaH2? 4;} 100 mM EGTA (KOH ile pH 7.0). Korozif çözümler olarak 5 M NaOH, 1 M HC1 ve 1 M KOH stokları kullanın.
2. Standart harici kayıt fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlanması
   1. Yama-kelepçe kayıt sabahında stok solüsyonlarını RT'ye ısıtın.
   2. _CaCl2 haricinde istenen son hacmine göre, her stok malzemeyi Pipet, PSS 500 mL hazırlanması için, örneğin: 140 mM NaCI 5M = 14 mi; 5 mM KC1 = 2.5 mL İM; 100 mM, 1.2 mM _MgCl2 = 6 mi; 200 mM, 1.2 mM _{NaH2? 4} = 3 mi.
   3. Çift ekle-distilled su (GKD ₂ O) son 400 mL hacim ve denge.
   4. 0.9 g glikoz ve 1.19 g HEPES tartılır ve çözelti karışımında tamamen çözülür.
   5. Karıştırılarak _CaCl2 stoku (2.5 mM = 100 mM 12.5 mL) eklenir.
   6. Nihai cildin% 99'unu ekleyin.
   7. NaOH veya HC1 kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
   8. Ozmolariteyi kontrol edin ve gerekirse 5 M NaCl veya glükoz kullanarak ayarlayın.
   9. Bir silindir içinde, 500 mL son hacme O GKD ₂ ekleyin.
3. Mikropipet iç çözeltilerinin hazırlanması (düşük EGTA K ⁺ temelli çözümler)
   1. 100 mM K-glukonat: tartılır ve istenen son hacim ve konsantrasyona bağlı olarak her bir stok reaktifler doğru birim pipet, ~ 30 mL GKD ₂ O bir hacme kadar 50 mL düşük EGTA K ⁺ merkezli bir Hücre-içi solüsyon hazırlamak için, örneğin = 1,17 g; 35 mM KC1 = 1.75 mL 1 M; 2 mM _MgCl2 = 1 mL100 mM; 0.1 mM EGTA = 0.05 mL, 100 mM; 10 mM HEPES = 0.072 g.
   2. Nihai hacmin ~% 95'ine yeterli su ekleyin ve çözeltinin oda sıcaklığında dengeye gelmesine izin verin. Çözümün berrak olduğundan emin olun.
   3. Çözeltiyi sürekli karıştırırken pH'ı KOH kullanarak 7.2'ye ayarlayın.
   4. Çözünene kadar 0.078 g Mg-ATP tartılır ve tamamen eritilir.
   5. Çözeltiyi buz üzerine yerleştirin ve ozmolarite ölçümü için küçük bir alikot kullanın; Genellikle, solüsyonlar ~ 290 mOsmol'u ölçer ve ayarlamaya ihtiyaç duymazlar. Ozmolarite 280-295 mOsmol'dan önemli ölçüde farklıysa, yeni bir çözüm hazırlayın.
   6. Son hacme GKD ₂ O ekleyin.
   7. Çözümü 500 mcL bölmelere bölün, 0.2 um şırınga filtresi ile süzün, sıkıca sızdırmaz hale getirin ve ≤ -20 ° C'de hemen saklayın.
   8. Yama-kenetleme deneyinin yapıldığı tarihte, buz üzerinde bir kısım hücre içi çözeltiyi çözdürün ve yama-kelepçe deneyi sırasında soğutulmaya devam edin.Bozulmayı önle.
4. Hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 5-10 M'luk dirençli mikropipet boyutları elde etmek için, cam kılcallardan yama pipetlerini çekin (aşağıdaki pipet çekmece kullanıcısının el kitabında).

4. Yama-Kelepçe Deneyi Kurma ve Hücrelerle Bütün Hücre Yapılandırması Oluşturma

1. Yama kenetleme denemesinin ayarlanması
   1. Yama-kelepçe kurulumunu açın (bilgisayar, bilgisayar kontrollü yükseltici, sayısallaştırıcı, vb. )
   2. Yama kelepçesi yazılımını açın ( örn. AXON pCLAMP10 veya HEKA PatchMaster) ve elektrofizyolojik kayıtlar için protokolleri ayarlayın. Sinyalin filtreyi 1-3 kHz'de düşük geçirme ve sayısallaştırıcıyı 10-20 kHz'de ayarlayın.
   3. Kamerayı, mikromanipülatörü ve ışık kaynağını açın.
   4. Bilgisayar kontrollü amplifikatör açıkken, topraklanmış olan patch-clamp teçhizatına elle dokunarak deneyci gövdesini topraklayın,Elektrik çarpmalarına karşı korumak için, kulaklığa dokunmadan önce.
   5. RT'de standart PSS ~ 1 mL ile dolu kayıt odasına cam lamel kültür epitel hücreleri aktarın. Patch-clamp deneylerinden önce bir pipet kullanarak banyo PSS'sini dikkatli bir şekilde en az iki kez değiştirin.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, planlanan deneye göre perfüzyon sistemini standart PSS veya başka bir harici çözüm ile doldurun. Yama-kelepçe deneylerine başlamadan önce ~ 2 mL / dakika'lık bir hızda birkaç kez PSS ile mikroskop destekli kayıt odasını (RC-26G veya RC-26GLP) çalıştırın. Perfüzyon sistemi boyunca sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olun.
   6. Ters çevrilmiş mikroskop altında, diferansiyel parazit kontrastlı optik sistem ile donatılmış 10X ve 40X hedefleri kullanarak hücreleri görüntüleyin ve seçin. Kayıt için büyük tekli izole hücreler arayın. İzole epididimal epitel hücrelerini kaba m ile küresel şekilleri ile tanımlayınMembranların bir ucundaki icrovilli ve hücre içi içeriğin polarize dağılımı ( Şekil 1 ).
   7. 1 mL şırınga (ev yapımı bir metalik olmayan mikrosiraj iğnesi) kullanarak, iç çözeltiyle bir mikropipet doldurun (düşük EGTA K ⁺ temelli çözüm, adım 3.3'e bakın). Mikropipette, mikropipetin direncini artırabilecek hava kabarcığı olmadığından emin olun. İç çözeltinin, klorür kaplı gümüş tel elektrotu, mikropipet tutacağı içine dalması için yeterli çözelti kullanın.
   8. Mikroipeti elektrot tutucusuna takın ve düşük bir pozitif basınç uygulayın (~ 0.2 mL şırınga hacmi). Düşük pozitif basıncı sonraki adımlardaki hücre membranına dokunana kadar sürekli tutun.
2. Kayıtlar için hücrelerle tüm hücre yapılandırması oluşturma
   1. Pipeti mikromanipülatörün en yüksek hızda banyo solüsyonuna daldırın. Pipet bulEkrana dijital kamera ile bağlantılı uç; Mikromanipülatör hızını orta-yüksek moda yavaşlatın.
   2. Bilgisayar kontrollü amplifikatörden üretilen bir voltaj kademesi ( örneğin 100 ms için 5 mV) uygulayarak veri toplama arabirimi komutunu ( örn . AXON sistemindeki "Membran Testi") kullanarak mikropipet direncini (5-10 MΩ) hızlı bir şekilde kontrol edin. Direnç bu aralığın dışına çıkarsa yeni bir mikropipet değiştirin.
   3. Mikroskop üzerine monte edilen objektifin altına inmeye başlayın; Yavaş yavaş seçilen hücreye doğru mikropipet yönlendirin. Her zaman önce hedefi indirin ve sonra, mikropipet seçili hücrenin orta yüzeyinin üzerindeyken, mikropipeti odak düzlemine indirin.
   4. Yazılımın komutan arayüzündeki "pipet ofset" komutunu kullanarak, pipet ile banyo çözeltileri arasındaki sıvı birleşim potansiyelini sıfırlayın.
   5. Bilgisayar kontrollü amplifikatör komisyonunu ayarlayınGerilim kelepçesine ve membran testine "Banyo" moduna geçin.
   6. Hücrenin daha net bir görünümü elde etmek için ince odaklanın, daha sonra düşük-orta hızda mikromanipülatörü kullanarak mikropipeti yavaş yavaş indirin.
   7. Mikroipet hücreye yakın olduğunda (membran test komutu tarafından tetiklendiğinde azaltılmış bir akım ile gösterilir), düşük pozitif basıncın derhal kaldırın ve gigaseal (> 1 GΩ) oluşturmak için zayıf negatif basınç uygulayın (0.1 mL şırınga hacmi) .
   8. Zar testi ile direnci izleyin. Direnç> 500 MΩ, ancak <1 GΩ ise, gigaseal oluşumuna yardımcı olabilecek negatif bir potansiyel (genellikle -60 mV'a ayarlanmış tutma potansiyeli) uygulayın. Mikropipetin geçici kapasitif akımı dengeleyin.
   9. Conta> 1 GΩ ve sabitse (yazılım arayüzünde gösterildiği gibi), hücre zarını kırmak için kısa ve kuvvetli bir emme uygulayın. Kendiniz için tazminat ödemeyinRies direnci ve hücre kapasitansı.
   10. Başarılı bir tam hücreli konfigürasyonu gerçekleştirdikten hemen sonra, -60 mV'lik bir tutma potansiyelinden 10 mV hiperpolarizasyon adımını (minimum zaman aralığı, 20 ms zaman süresi, sinyal örneği 20 kHz'de 5 iz) uygulayın.
   11. Voltaj modunu sıfır akım moduna geçirin ve yazılım arayüzünden okumaları işaretleyin veya hücrenin zar potansiyeli okumaları için boşluk içermeyen bir kayıt yapın (10-60 saniye).
   12. Geriye dönün ve gerilim modunda kalın ve gerilim protokollerini planlanan deneylere göre uygulayın ve mevcut tepkileri ölçün. Çıkarma, kayıtlar sırasında asıl sızıntı akımına uygulanmaz.
   13. Kayıtlardaki yanıtların kararlılığını veya hücrenin farklı parametrelerini izleyin. Örneğin, giriş direncini (R _i ), seri direncini (R _s ) ve hücrenin kontrolünü yapmak için "Membran Testi" komut arabirimini kullanınprotokollerin geçiş sırasında "Hücre" modunda membran test membran kapasitans (C, _m).
       NOT: Giriş direncindeki ani düşmeler genellikle gevşek bir yamanın varlığına işaret eder ve seri direncinde çarpıcı bir artış, hücre içi organellerin veya zar parçalarının tıkanıklığı gösteren mikropipet ucu göstergesi olabilir. Kayıt sırasında, sürüklenmenin oluşup oluşmadığını kontrol etmek için düzenli olarak mikropipet yerini izleyin, bu da yamanın kaybolmasına neden olabilir. Sürüklenme bir problem oluşturuyorsa, mikropipeti ve yama hücresini kayıt odasının altından dikkatlice kaldırın. Bu adım bazen yamanın kaybolmasına yol açabilir, bu durumda bütün hücre yaması-kelepçe prosedürünün tekrarlanması gereklidir.

5. Hücrelerin Pasif Elektrofizyolojik Özelliklerinin Analizi

1. Yama-kelepçe deneylerinden elde edilen verileri aldıktan sonra, Clampfit yazılımında aralıksız verileri açın ve ortalamayı ölçünHer hücre için dinlenme membranı potansiyeli. Alternatif olarak, değeri geçerli modda sıfır akım geriliminden aşağıya işaretlenmiş olarak kullanın. Sıvı bağlantı potansiyeline sahip değerleri düzeltin (bu çalışmada 12.4 mV).
2. Bir hücreden elde edilen 10 mV hiperpolarizasyon adımından (ΔV) verileri açın, adım öncesi ve aşamadaki akım farkını ölçün (Δ I _basamağı ) ve giriş direncini (R _i ) aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplayın:
   
3. Hücre kapasitesini hesaplayın (pF cinsinden C _m ) (10 mV hiperpolarizasyon adımından gelen aynı akım verisini, voltaj basamağı tetikleyicisinde yükseltilen ilk geçici bozunma akımı boyunca membran kondansatör akımı altındaki toplam alanı birleştirerek kullanın) Hücrenin toplam birikmiş yükünün (Q, pA • ms birimi cinsinden) değerini elde etmek için. Aşağıdaki denklemi kullanın:
   
4. Her bir hücre için seri direncin (R _s ) değerini, 10-mV negatif adımdan gelen başlangıç ​​geçici akımını, zaman sabiti bozunma akımını ( T cinsinden, ms cinsinden) elde etmek için standart bir üstel algoritma ile uyacak şekilde hesaplayın ve Denklem aşağıdaki gibidir:
   

Sonuçlar

Sıçan kauda epididimitlerinden epitel hücrelerinin izolasyonu için tarif edilen enzimatik sindirim prosedürü önceki çalışmalarımızdan ^{9 , 12'deki} modifiye edilmiş bir protokoldür. Bu yöntem% 90'ın üzerinde canlılığı olan ve yüzey kabarmaları veya şişmiş hücre hacmi olmayan tek hücreli bir karışım üretir. Heterojen hücre kanşımı, daha önce anlattığımız gibi esasen ana hücrelerden, berrak hücrelerden ve bazal hücrelerden oluşur

Tartışma

Bu protokolde sıçan kauda epididimidlerinin enzimatik dağılımı sürekli olarak sağlıklı epitel hücreleri vermiştir. Yama-kelepçe deneyleri için epididimal epitel hücrelerinin kalitesi protokolde birkaç kritik adıma bağlıdır. Örneğin, düşük bir santrifüj kuvveti (30 xg) ile hücre karışımının santrifüjlenmesi, spermatozoa ve epididimal luminal içeriğin giderilmesi için önemlidir; Epididimal epitel hücreleri, hücre kültüründe spermatozoa varlığında sağlıksız hale gelir. Ek olarak, birkaç saat süreyle bir Petri kabında ayrış...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
< güçlü > AXON sisteminin enstrümanı< / güçlü >
Bilgisayar kontrollü amplifikatör	Moleküler Cihazlar - Axon	Multiclamp 700B yama-kelepçe amplifikatörü
Dijital Toplama sistemi	Moleküler Cihazlar - Axon	Digidata 1550 dönüştürücü
Mikroskop	Olympus	BX-61WI
Mikromanipülatör	Sutter Instruments	MPC-325
Kayıt odası ve hat içi Isıtıcı	Warner Instruments	TC-324C
HEKA sisteminin aleti
Yama Kelepçesi amplifikatörü	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB çift
Mikroskop	Olympus	IX73
Mikromanipülatör	Sutter Instruments	MPC-325
Kayıt odası ve hat içi Isıtıcı	Warner Instruments	TC-324C
Diğer Alet
Mikropipet Çektirme	Sutter Aleti	P-1000
Kayıt Odası	Warner Instruments	RC-26G veya ev yapımı oda
Filamentli borosilikat kılcal cam	Sutter Enstrümanı / Harvard Aparatı	BF150-86-10
Titreşim izolasyon tablosu	TMC & nbsp;	63544
Dijital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
izolasyon için reaktifler< / güçlü >
RPMI 1640 orta	Gibco	22400089
Penisilin / Streptomisin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Kollajenaz I	Sigma	C0130
Kollajenaz II	Sigma	C6885
5-&alfa; -dihidrotestosteron	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal sığır serumu	oğlak	FBS-12A
Mikropipet iç çözeltileri (K+ bazlı çözelti) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/çeşitli	V900068
MgCl2 ve orta nokta; 6H2O, 2mM	Sigma/çeşitli	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/çeşitli	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/ çeşitli	V900477
K-glukonat, 100mM	Sigma / çeşitli	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma / Çeşitli	A9187
< güçlü > Standart harici kayıt fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) < / güçlü >
NaCl, 140mM	Sigma / çeşitli	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma / çeşitli	V900068
CaCl2,< / sub> 2.5mM	Sigma / çeşitli	V900266
MgCl 2< / sub> & middot; 6H < sub > 2 < / sub>O, 1.2mM	Sigma / çeşitli	M2393
NaH < sub > 2 < / sub>PO4, 1.2mM	Sigma / çeşitli	V900060
HEPES, 10mM	Sigma / çeşitli	V900477
Glikoz, 10mM	Sigma / çeşitli	V900392
pH ayarlaması için< / güçlü >
NaOH	Sigma / çeşitli	V900797	Saflık > =% 97
KOH	Sigma / çeşitli	60371	Saflık > =% 99.99