Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği

18.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55704

⸱

8 Haziran 2017

 ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.

Özet

Son birkaç on yılda yapılan işitme araştırmalarında dikkate değer ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, tipik olarak iç kulaktaki hassas mekano-algılama yapılarına hasar veren veya kaybedilen bir durum olan Sensorineural İşitme Kaybı (SNHL) için herhangi bir tedavi yoktur. Son yıllarda sofistike in vitro ve ex vivo testler ortaya çıkmış ve kaynakları azaltmak ve SNHL için iyileştirme çabalarını hızlandırırken potansiyel olarak terapötik bileşiklerin sayısının artmasını mümkün kılmıştır. Bazı hücre türlerinin homojen kültürleri günümüz araştırmalarında önemli rol oynamaya devam etse de, birçok bilim adamı şimdi koklear eksplant olarak da bilinen daha kompleks organometalik faregiller arası kulak kültürlerine güveniyor. Organik hücresel yapıların iç kulak içinde korunması, iç ve dış kıl hücreleri, spiral ganglion nöronları, sinir hücreleriItes ve destekleyici hücreler. Burada neonatal farelerde koklear eksplantların hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanması sunulmuştur. Bu eksplantların dikkatli bir şekilde hazırlanması, SNHL'ye katkıda bulunan mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır ve işitme araştırmaları topluluğu için değerli bir araç teşkil eder.

Giriş

Sensorinöral İşitme Kaybı (SNHL), iç kulakta veya artan işitme yolunda hasar olduğunu gösterir. İşitme kaybı, insanlardaki en yaygın duyusal eksiklik iken, küratif terapiler henüz mevcut değildir 2 . Koklear veya işitsel beyin sapı implantları ağır derecede derinlemesine SNHL olan hastalara bir dereceye kadar işitme becerisi kazandırabilmesine rağmen, özellikle de sesli konuşmayı anlamaya veya müzik dinlemeye çalışırken, bu cihazların sağladığı işitme "doğal" işitme durumundan çok farklıdır.

Saç hücresi dejenerasyonu, uzun süredir travmatik işitsel olayların ( örneğin, yüksek gürültüye maruz kalma) birincil sonuç olarak düşünülürken , bilginin saç hücrelerinden işitme sinirine iletildiği sinapsların en azından akustik travmaya karşı savunmasız olduğu yönünde artan bir kanıt vardır 3 , 4 , 5 > , 6 . İşitsel işlevi değerlendirmek için kullanılan altın standart olan insan odyometrik eşikleri, iç kulaktaki belirli hücresel hasarı öngörmemektedir, mümkün olduğunca çabuk hücresel dejenerasyonu saptamak ve uygun tedaviyi başlatmak için daha rafine edilmiş araçlar gerekmektedir.

İşitme kaybı için umut verici farmasötik tedaviler genellikle homojen hücre kültürleri üzerinde in vitro olarak denenir, ancak bu tür sistemler koklear mikro çevreyi doğru bir şekilde modellememektedir. Koklear hücrelerin Corti 10 , 11 ya da Spiral Ganglion Nöronları (SGNs) 12 organı izole edildiğinde ya da ne zaman ne de olsa, koklea 8 , 9 içindeki diğer hücre tiplerini etkileyen trofik faktörleri salgılarlar. Moleküler belirteçler analiz edilirEf "> 13. Bununla birlikte," hassas tıp "arayışında işitme kaybı için yeni ve kişiselleştirilmiş tedaviler oluşturmak için in vitro verilerin geçerliliği için gerekli olabilecek in vivo çalışmalar önemli kaynaklara ve zamana ihtiyaç duymaktadır. Işitme testleri ve müteakip koklear tüm montajların diseksiyonu ile orta kulak veya yuvarlak pencere membran enjeksiyonlarını mükemmelleştirmek ve gerçekleştirmek için ne kadar çaba gerekir? Koklear eksplant olarak bilinen organotipik ex vivo kültürlerde umut verici bileşiklerin verimli taranması, ekonomik ve güvenilir bir alternatif sağlar 14 , 15 , 16 , 17 .

Bu makalede, tedavi edilen koklear eksplantların üretilmesi, sürdürülmesi ve değerlendirilmesi için kullanılan bir protokol açıklanmaktadır. Taramada kullanımı da dahil olmak üzere, bu model için özel uygulamalar vurgulanmaktadırPotansiyel olarak terapötik bileşikler ve gen terapisi için viral vektörlerin karşılaştırmalı değerlendirmesi. Bir ex vivo eksplant yaklaşımı, araştırmacıların belirli bir tedavinin etkilerini , in situ olarak farklı hücre popülasyonları üzerinde görselleştirmesini ve hücre tipine özgü mekanizmaların tanımlanmasını ve daha sonra hedeflenen terapötiklerin arıtılmasını kolaylaştırır.

Genel olarak, bu teknik, kokleada bir arada bulunan çok çeşitli hücre tipleri arasındaki yaşamsal çapraz konuşmayı korurken, kokleayı ex vivo çalışmak için bir model sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma protokolü, Massachusetts Eye and Ear'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler, Dünya Tıp Birliği Etik Kurallarına göre gerçekleştirildi.

1. Diseksiyonun Hazırlanması

  1. Cerrahi masanın hazırlanması
    1. Cerrahi masayı dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın.
    2. Mikroskop yanında iki steril olmayan hazırlık yastıkları yerleştirin.
    3. Isı sterilize edilmiş ameliyat makası, bir bistüri sapı, bir mikro bıçak ve forseps (# 4 & # 55 her biri iki) de dahil olmak üzere alet tablasını hazırlayın. Alet tablasını ve 50 mm'lik, açık cidarlı, cam altı petri kabını steril olmayan bir pedin üzerine koyun.
    4. Steril # 15 neşter bıçağı elde edin; Mühürlenebilir bir plastik torba veya konteynır (karkaları kurumsal kurallara uygun olarak atmak için); Kova içinde buz; Ve soğuk, steril Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). Bu maddeleriDiğer steril olmayan ped.
    5. HBSS'yi 50 mL plastik bir laboratuar tüpüne aktarın ve buz üzerine koyun.
  2. Kültür hazırlama
    1. Tüm malzemeleri bir laminer akış davlumbazına hazırlayın. Her dört numune için, dört adet otoklavlanmış 10 mm yuvarlak cam kapak fişini 35 mm'lik 4 oyuklu petri kabının dört girintisine koyun.
    2. Her 4 numune için, mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakilerden oluşan toplam 300 μL'lik bir hacim karıştırın: 10 μL doku yapıştırıcısı, 285 μL NaHCO 3 ve 5 μL NaOH.
    3. Elde edilen çözeltinin 45 μL'sini her kaplama kağıdına koyun ve oda sıcaklığında en az 20 dakika bekletin; Bu çözüm birkaç saat boyunca lamel kalmış olabilir ancak O / N bırakılamaz.
    4. Kirlenmeye karşı iki bariyeri oluşturmak için bir veya iki 35 mm'lik 4 oyuklu petri tabağını 10 cm'lik bir Petri kabının içine yerleştirin.
    5. % 98 Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 1 N-2 ve% 1 ampisilin (bir (mikro) santrifüj tüpünde oyuk başına 65 uL) ilave edildi. Çözümü kullanımdan önce 25 ° C'ye ısıtın.

2. Murin Koklear Explant Diseksiyonu

  1. Yenidoğan faresinin kesilmesi
    1. 60 mm plastik petri kabını alın ve yüzeyi ıslak olacak şekilde kapağına% 70 etanol püskürtün.
    2. Soğuk HBSS'yi plastik laboratuar tüpünden 60 mm plastik ve 50 mm net duvarlı, cam tabanlı petri tabağının alt kısmına dökün. Doku ayrılmadığı zaman soğuk tutmak için plastik laboratuar tüpünü ve her iki petri tabağını da buz üzerinde saklayın.
    3. Bir lateks eldiveninin bir kesme parmağında buz üzerinde bir P3 - P5 yaşlı yenidoğan faresi yerleştirin ve hipotermi bilinç kaybına neden olana kadar bekleyin (yaklaşık 1-3 dakika).
    4. Çalıştırma makası ile fare hızla kesilir ve gövdeyi mühürlenebilir plastik torbaya atın. Ayrılan yenidoğan kafasını60 mm plastik petri kapağının kapağında% 70 etanol.
  2. Temporal kemiğin makroskobik diseksiyonu
    1. Bıçak bıçağını kullanarak arka ucun önünden (doğrudan sajital dikişin üstünde) yüzeysel bir kesim yaparak kafatasının derisini çıkarın.
    2. Her iki dış ses kanallarını bisturi bıçağıyla kesin ve craniumun tamamını ortaya çıkarmak için öne katlayın.
      NOT: Bu adım için genellikle bir diseksiyon mikroskopu gerekli olmasa da, gelişmiş görselleştirme için kullanılabilir.
    3. # 15 Bıçak bıçağını kullanarak sajital sütür boyunca kafatası açın. Kokleanın sıkıştırılmasını önlemek için, bacıyı anteriordan posteriora hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek kafatasını kesdiğinizden emin olun.
      NOT: Kafatası o yaşta kemikleşmemelidir ve kolaylıkla kesilmelidir.
    4. # 15 Dankel iğnesi kullanarak yörüngelere direkt olarak arka arkaya dikey keserek burun çıkarın ve atınBıçak.
      NOT: Kafatasının arka kısmı hala beyin ve kokleae içermelidir.
    5. Önbeyin, beyincik ve beyin sapını # 4 forseps ile künt diseksiyon yoluyla atın.
  3. Kochleae'nin mikroskobik ekstraksiyonu
    1. Mikroskopı (6.5X büyütme) ve ışık kaynağını, forsepsi kapsamın altına yerleştirerek ve aydınlatmayı ve odaklamayı optimize ederek ayarlayın.
    2. Kraniumun iki yarısını soğuk HBSS ile dolu 60 mm plastik petri kabına yerleştirin.
    3. Çevreleyen stapedial artere bitişik olarak bulunan kokleanın / e'nin (temporal kemiğin içinde dolambaçlı bir arter) komple olarak ortaya çıkmasını sağlayın ve organı temporal kemiğe # 4 forseps kullanarak açıkça ayırın.
    4. Kokleayı 50 mm, açık duvarlı, cam tabanlı petri kabına aktarın ve çanağı mikroskop altında konumlandırın.
    5. 60 mm plastik petri kabuğunun diğer yarısı buz üzerine yerleştirilir.
    6. Kokleayı vestibüler sistemden çıkarın ve koklear otik kapsülü (tipik olarak bu yaştaki kıkırdaklı) # 4 forsepsle dikkatlice parçalayın. Diğer tüm adımlar için # 55 forseps kullanın.
  4. Doku işleme son adımları
    1. İç kulak dokusunun işlenmesine devam etmek için, mikro bıçak veya iki forseps kullanarak, kokleanın geri kalanından ve modiyolustan Corti organına yapışmış spiral ligament dikkatlice ayrılmalıdır.
      1. Spiral bağ ve saç hücresi bölgesi arasındaki aralıktaki daha koyu, yarı saydam bölüme doğru kesin ve spiral bağın en temel kısmını kavrayarak ve apikal hareket ederken hafifçe çözerek ilerlemeye devam edin.
    2. Kokleanın uzunlamasına, sagital bir görünümünü elde etmek için numuneyi konumlandırın ve mikro bıçağı kullanarak kokleayı iki ila üç bölüme kesin, bu kısımları apikal (orta,) ve b olarak sınıflandırınAsal dönüyor. Petri kabında yatay olarak yerleşebilen bir koklear eksplant parçası elde etmek için, doku üstünü ve alttaki saç hücrelerinin ve nevrit tabakasını aşağı kaldırın.
      NOT: Kültür çanağına kararlı yapışma için uygun bir boyut, bir koklear dönüşün yaklaşık yarısı kadardır.
    3. Cortsi organının hemen üstündeki çok ince bir saydam katman olan ince doku zarını forsepsle hafifçe soyarak çıkarın.
    4. Reissner'ın membranını, SGN'lerin hemen üstünde, her iki yanında da forsepsle dokunup soyarak çıkarın.
      NOT: Yanal olarak bulunan hasarlı saç hücresi alanlarını mikro bıçakla keserek çıkarın.

3. Örneklerin Kültür Plakalarına Aktarılması

  1. Dört kapak fişinden 45 μL doku yapıştırıcı solüsyonu çıkarın. Her kapak kaymasını 50 μL steril H 2 O ile yıkayın. Suyu aspire edin.
  2. 1 mL'lik pipeti al. Numunenin içerisine yapışmasını önlemek için pipet ucunu yaklaşık 120 μL DMEM ile ıslatın.
  3. Numuneleri 1 mL pipet kullanarak ayrı ayrı aktarın. HBSS dolu, küçük, açık duvarlı, cam tabanlı petri kabından azami 70 mcL pipetleyin ve numuneyi, 4-kuyu petri kabında (kapak fişleri ile hazırlanmış) 4 kakmandan birinde sıvı ile birlikte yerleştirin .
  4. Mikroskop (50X büyütme) altında numunenin doğru yönde olduğunu kontrol edin. Tectorial membranın çıkarıldığı saç hücrelerinin alanının yukarı baktığından emin olun. Baziler membranın, modiyolüsün kesilmiş, bazal kısmı ile birlikte aşağı baktığından ve lameline yapıştığından emin olun.
    1. Muayene üzerine numune ters çevrilmişse, pipet ucunda kalmış olan HBSS'yi kılıfın içine yerleştirin ve doğru şekilde yönlendirilene kadar parçayı yeniden konumlandırın.
      YOK HAYIRTE: Bu, saç hücrelerinin, lamesten yapısal olarak destek almadan kültür ortamında yüzmesini önleyerek dejenerasyona neden olabilir.
  5. 1 mL'lik pipeti kullanarak fazla HBSS'yi aspire edin. 15 saniye bekleyin.
  6. Hazırlanan sıcak kültür ortamından (% 98 DMEM,% 1 N-2 ve% 1 ampisilin) ​​doğrudan doğruya örnek üzerine pipetleyin. Numuneye pipet ile dokunmamaya dikkat edin. İç ve dış petri kapaklarını değiştirin ve O / N'yi 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Stok çözümlerinin tümünü uygun yerlerine geri koyun, karkasları ve kalıntı atıkları imha edin, cerrahi masayı kurumsal talimatlara ( örn., Etanol veya hipoklorit) göre dezenfekte edin, aletleri temizleyin ve otoklavlayın ve kesikleri uygun kutuda atın .

4. Nihai Kültür Ortamı ve Çıkan Maddeleri Ekleme

NOT: Koklear eksplantlar 10-16 saat sonra kullanıma hazır hale gelecektir.

  1. Bir karışık hazırla% 1 DMEM,% 1 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 N-2 ve% 1 ampisilin (bir mikro santrifüj tüpünde oyuk başına 65 uL; kullanımdan önce çözeltiyi 25 ° C'ye ısıtın).
  2. İlgili tedavi gruplarının çözümlerine diğer ilgi maddelerini ekleyin. Floresan maddeler eklenirse ( örneğin, yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade eden virüsler; son yayında, 50 μL'de 48 saat boyunca 10 10 GC Adeno-İlişkili Virüsler (AAVs) konsantrasyonu kullanıldı. Işık.
  3. Kuluçkadan koklear eksplant içeren petri kaplarını aktarın ve bunları laminer akış kaputunun altına yerleştirin.
  4. Eski kültür ortamını (w / o FBS) pipetlerle kakmalara aspire edin.
  5. Hazırlanmış sıcak kültür (tedavi) ortamı (% 97 DMEM,% 1 FBS,% 1 N-2,% 1 ampisilin ve ilgi konusu maddeler) başına oyuk başına 60 mcL ekleyin.
  6. Petri kabını tekrar kuluçka makinesine yerleştirin (37 ° C).
  7. Görüntüle rHücresel göç veya koklear eksplantın ayrılması belirtilerini belirlemek ve en fazla 7 gün sonra boyama yapmak için mikroskop altında egularly kullanın.

5. İmmünofloresans - Gün 1

  1. Bloke edici çözelti hazırlayın (% 94 Fosfat Tamponlu Tuz (PBS),% 5 normal keçi veya at serumu (ikincil antikorlara bağlı olarak NGS / NHS) ve% 1 noniyonik sürfaktan (Malzeme Tablosuna bakın) ve stok Antikor çözeltisi (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve ilgili antikorlar ile% 0.4 non-iyonik yüzeyaktif madde).
    NOT: Antikorlar, 1: 400+ (iç ve dış saç hücreleri için miyozin 7A) ve fare anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulin, SGN'ler için) VEYA fare (IgG1) anti konsantrasyonunda tavşan anti-Myo7A'yı içerir 1: 50+ (postsinaps için postsinaptik yoğunluk) ve tavuk anti-NF-H1: 1000+ (nevrofilament, anti-PSD95 1: 200+ (presynap için c-terminal bağlama proteini), fare (IgG2a) SGN'ler ve sinir lifleri için). "+" MeaNs "veya daha yüksek."
  2. Bir pipet kullanarak kültür ortamı aspire. Numuneye dokunmamaya özen gösterin.
  3. Laminer akış kaputunun altında, koklear eksplantları steril PBS ile iki kez durulayın, her yıkamadan sonra 5 dakika boyunca çalkalayıcıya numuneler koyun.
  4. Çalkalayıcıda (kaputun altında) 20 dakika% 4 paraformaldehid (PFA - DİKKAT) içindeki dokuyu düzeltin. PFA'yı aspire edin.
  5. Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS'yi aspire. 3 kez tekrarlayın.
  6. Koklear eksplantları çalkalayıcıda 30 dakika boyunca hazırlanmış bloke etme çözeltisine (% 94 PBS,% 5 NHS ve% 1 noniyonik yüzeyaktif madde) yerleştirin.
  7. Koklear eksplantlar RT'de bir sayaçta O / N ilgili primer antikorlar (vorteks) kullanılmadan hazırlanmış bir stok antikor çözeltisine (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve% 0.4 noniyonik sürfaktan) yerleştirin.
    NOT: Petri kaplarını nemli kağıt havluyla plastik sargıyla sarın (veya eklenen çözelti alüminyum folyoya sarınIyon, bulaşıkları nemli tutmak ve O / N antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için, GFP ifade eden virüsler gibi floresan materyalleri içerir).

6. İmmünofloresan - 2. Gün

  1. Adım 5.1'de birincil antikorları tamamlayan doğru ikincil antikor karışımlarını elde etmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) leke (300 nM) hazırlayın ve stok antikor çözeltisini kullanın. (IgG1) 568 1: 1000+, keçi anti-fare (IgG2a) 488 1: 500+, keçi anti-fare (IgG1) 568 1: 200+ ve keçi anti- Ve keçi anti-tavuk 647 1: 200+ VEYA Phalloidin 568 1: 200+ (iç ve dış saç hücreleri için)).
  2. Birincil antikor çözeltisini aspire edin.
  3. Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS'yi aspire. 3 kez tekrarlayın.
  4. Koklear eksplantlar hazır stok antikor çözeltisine (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve% 0.4 non-iyonik yüzeyaktif madde) res ile yerleştirinSekonder antikorları (kullanımdan önce girdaplı) 1.5 saatlik bir sayaç üzerinde tutun ve ışığa karşı koruyun.
  5. İkincil antikor çözeltisini aspire edin ve koklear eksplantları DAPI lekesi ile durulayın (1 dakika çalkalayıcıya yerleştirin ve daha sonra aspire edin).
  6. Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS'yi aspire. 3 kez tekrarlayın.
  7. 4 yuvalı plakadan örneklerle lamelleri çıkarmak için forseps kullanın, damıtılmış H 2 O ile dolu bir alıcıya batırın ve lamelleri dikey olarak kağıt havluyla temas ettirerek kurutun.
  8. Mikroskop slayt üzerine antifade bir orta montaj bir damla yerleştirin ve orta aşağı doğru bakan doku batırın lamelleri ters çevirin.
  9. Kenarları çevresel olarak temizleyen (camın altındaki örneği ezmeden) temiz tırnak cilasını kullanarak lamelleri mühürle. Slaydları, ışıktan uzakta kapalı bir alanda düz durarak bırakın ve 15 ila 20 dakika kuruyana kadar bekleyin.Bunları bir kutuya yerleştirin veya konfokal mikroskop altında inceleyin.
    NOT: Floresan boyama, slaytları 4 veya -20 ° C'de saklayarak en iyi korunur.

7. Konfokal Görüntüleme

  1. Nöritleri ve SGN'leri içeren Corti bölgesinin organı için genel bir bakış ve yakınlaştırılmış resimler elde edin.
    NOT: Görüntüleme işlemi için standart ayarlar: 1,024 x 1,024 piksel, 400 Hz hızı, 3 çerçeve ortalaması,% 20 toplam lazer yoğunluğu ve genellikle 20X ve 63X'lık yağ daldırma lensi (potansiyel olarak 2X dijital zoom ile birlikte). DAPI, Myo7A ve TuJ1 boyama protokolü için kanal ayarları yukarıda özetlenmiştir: 405% 5 DAPI, "Akıllı Kazanç" 766,8V, "Akıllı Ofset"% 0,0 -% 488 15% floresan izotiyosiyanat (FITC), "Akıllı Kazanç" 622,2V , "Akıllı Ofset"% 0.0 -% 561 13 tetrametilhomadin izotiyosiyanat (TRITC), "Akıllı Kazanç" 562.4V, "Akıllı Ofset"% 0.0.
  2. Resimleri kullanarak z-yığınını birleştirin.Yazılımı kullanarak z-ekseni projeksiyonu elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Birçok protokol Corti eksplant organına odaklanırken, bu teknik SGN'ler de dahil olmak üzere tüm koklear dönüşün anatomisini korumaya çalışmaktadır. Bu, araştırmacılara belirli bir tedavinin Corti organına ek olarak SGN'lerin nöritleri ve somatları üzerindeki etkilerini analiz etme olanağı sağlar. Modülün bir bölümünü koruyan bir diseksiyon gerçekleştirmek, burada açıklandığı gibi, yalnızca Corti organını eksprese etmekten daha teknik açıdan zorlayıcıdır. Bununla birlikte, nörit ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Araştırmacılar, koklear eksplantları içeren deneyleri yapmadan önce diseksiyon tekniğini mükemmelleştirmelidirler. Saç hücreleri, öğrenme eğrisinin başlarında gerçekleştirilen diseksiyonlar sırasında sıklıkla hasar görürler ve bütünlüğü için özellikle sorunlu bir an, sabit eller, uygun araçlar ve deneyim gerektiren, tectorial membranın çıkarılmasıdır. Zamandan ve kaynaklardan kazanmak için diseksiyon mikroskopu altında görsel bir kontrol yapılmalı ve potansiyel olarak hasar gören alanlar belirtilmelidir. Pahalı primer v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) tarafından desteklenmiştir. Nancy Sayles Day Vakfı (KMS) ve Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS). Yazı hakkında anlayışlı yorumlar için BA'ya Jessica E. Sagers'e teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ampisilin, Sodyum TuzuInvitrogen11593-027
anti-CtBP2 antikoru, fare (IgG1)BD İletim Laboratuvarları612044
anti-Myo7A antikoru, tavşanProteus Biosciences25-6790
anti-NF-H antikoru, tavukEMD MilliporeAB5539
anti-PSD95 antikoru, fare (IgG2a)Antikorları Inc.75-028
anti-TuJ1 antikoru, fareBioLegend801202
Cell-Tak Hücre ve Doku Yapıştırıcısı, 5 mgCorning354241
CELLSTAR 15 mL Santrifüj Tüpleri, Konik tabanlı, Derecelendirmeli, SterilGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Hücre Kültürü Kabı, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Hücre Kültürü Çanağı, 35 x 10 mm, 4 iç halkaGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Hücre Kültürü Kabı, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Santrifüj Tüpleri, Konik tabanlı, Derecelendirmeli, SterilGreiner Bio-One227261
Şeffaf Oje ElektronMikroskobu Bilimleri72180
Şeffaf Duvar Cam Alt Tabakları (Cam 40mm), PELCO®, Kılıf/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Lamel, Yuvarlak, Cam, 10 mm çap, Kalınlık #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)Thermo Fisher ScientificD1306
Damıtılmış su, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), yüksek glikoz, piruvat, glutamin yok, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 ForsepsGüzel Bilim Araçları11241-30
Dumont #55 Forseps (Dumostar)Güzel Bilim Araçları11295-51
Etil alkol (EtOH), Saf, 200 kanıt, susuz vb; %99,5Sigma-Aldrich459836-1L
Fetal Sığır Serumu (FBS), nitelikli, USDA onaylı bölgeler, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028 50 mL'lik tüplerde alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın; C dondurucu
keçi anti-tavuk-647 ikincil antikorThermo Fisher ScientificA-21469
keçi anti-fare (IgG) -568 ikincil antikorThermo Fisher ScientificA-11004
keçi anti-fare (IgG1) -568 ikincil antikorThermo Fisher ScientificA-21124
keçi anti-fare (IgG2a) -488 ikincil antikorThermo Fisher ScientificA-21131
keçi anti-tavşan-488 ikincil antikorThermo Fisher ScientificR37116
H2O, steril, EmbryoMax Ultra Saf Su, 500 mLEMD KırlangıçTMS-006-B
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı yok, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Kapaklı Alet Tepsisi Paslanmaz ÇelikMountainside MedicalTechMed4255
Mikro (diseksiyon) bıçağı ve ndash; açılı 30 & derece;Güzel Bilim Araçları10056-12
Mikroskop slaytları, VistaVision, renk kodlu, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm kalınlık, beyaz, 72'lik paketVWR16004-382
N-2 Takviyesi (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, Sodyum Bikarbonat %7,5 çözelti, 100 mLThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, sodyum hidroksit çözeltisi, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Normal At Serumu (NHS)İnvitrojen16050130
Ameliyat makasıRoboz Cerrahi Aletler A.Ş.RS-6806
Paraformaldehit (PFA), Reaktif Sınıfı, KristalinSigma-AldrichP6148Kullanmadan önce: Çevrimiçi olarak sunulan protokollere dayalı Standart Çalışma Prosedürleri oluşturun
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Kullanmadan önce otoklav
Phalloidin, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
Hazırlık Pedi, Steril Olmayan Medline05136CS
Safe-Lock Mikrosantrifüj Tüpleri, Polipropilen, 0.5 mLEppendorf022363719Kullanmadan önce otoklav
Safe-Lock Mikrosantrifüj Tüpleri, Polipropilen, 1.5 mLEppendorf022363204Kullanmadan önce otoklav
Neşter Bıçakları - #15Güzel Bilim Araçları10015-00
Neşter Sapı - #4Güzel Bilim Araçları10004-13
Stemi 2000-C Stereo MikroskopZeiss 000000-1106-133
TCS SP5 konfokal mikroskopLeicaN/A
Triton-X (iyonik olmayan yüzey aktif madde)IntegraT756.30.30
Floresan için VectaShield antifade montaj ortamıVector Laboratories, Inc.H-1000
Fermuarlı Çanta, Tekrar Kapatılabilir, 4 x 6'' - 2 mm kalınlığındaZipline0609132541599
260368

Kaynaklar

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432(2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260(2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101(2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yenido an Fare KokleasT y H cresi AnaliziSpiral Ganglion N ronlarOrganotipik K lt rmm nboyama Prosed rTektoryal Membran Uzakla t rmaKoklear D neme KesitleriKonfokal G r nt leme Analizi
Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.