Yöntem makalesi

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

6.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55711

⸱

4 Mayıs 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Bu makalede

Özet

Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.

Özet

Hem sağlıklı hem de habis dokudan heterojen hücre popülasyonları, DNA bağlama boyası Hoechst 33342'yi dışarı atma yeteneği ile karakterize bir hücre popülasyonu içerebilir. Hücrelerin bu "yan popülasyonu", Hoechst 33342'den sonra akış sitometrik yöntemleri kullanılarak tanımlanabilir Boya ultraviyole (UV) lazerle uyarılır. Birçok hücre tipinin yan popülasyonu stem veya progenitor benzeri hücreler içerir. Bununla birlikte, tüm hücre tiplerinin tanımlanabilir yan popülasyonu yoktur. Danio rerio , zebrafish, T hücreli akut lenfoblastik löseminin (T-ALL) sağlam bir in vivo modeline sahip ancak bu zebra bağı T-ALL'lerin bir yan popülasyonu olup olmadığı bilinmiyor. Burada açıklanan yöntem, zebra balığı T-ALL'deki yan popülasyon hücrelerinin nasıl izole edilebileceğini açıklamaktadır. Başlamak için, zebra balığı içindeki T-ALL, tol2 plazmidlerinin bir hücre evresi embriyolarına mikroenjeksiyonu yoluyla üretilir. Tümörler aniden yarısından fazlasına genişlediği bir aşamaya geldiğindeMalın vücudu, T-ALL hücreleri hasat edilebilir. Hücreler daha sonra Hoechst 33342 ile lekelenir ve yan popülasyon hücreleri için akış sitometrisi ile muayene edilir. Bu yöntem, zebra balığı T-ALL araştırmasında geniş uygulamalara sahiptir. Zebra balığı içinde bu yan popülasyon hücrelerinin kanserli kök hücre benzeri olup olmadığını teyit eden bilinen bir hücre yüzeyi belirteçleri bulunmamakla birlikte, in vivo fonksiyonel transplantasyon testleri mümkündür. Ayrıca, bu yan popülasyon hücrelerinin genetik özelliklerini tanımlamak için tek hücreli transkriptomikler uygulanabilir.

Giriş

Yan nüfus tahlili hücre zarı ATP bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı proteinler, yüksek düzeyde bir DNA bağlanma boya Hoechst 33342 akıttığı bir doku içinde belli hücrelerinin gelişmiş yetenek istifade. Hoechst 33342 boya dışa akımı, hücreler boya UV lazeri tarafından uyarılır sonra dual dalga boyu akış sitometrik analizi kullanılarak tespit edilebilir. Bu deney, ilk olarak fare hematopoietik kök hücreler (HSC), 1 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak güne kadar bir çok doku ve kanser kök / progenitör hücre popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılmıştır (referans 2 de incelenmiştir). Ancak, bütün hücre popülasyonları bir yan nüfusu ve tüm yan popülasyonları kök / progenitör hücreler açısından zenginleştirilmiş olan değil.

Zebra balığı, geleneksel fare mo üzerinde avantaj sayı ile insan kanseri 3, 4 çalışmak için güçlü bir omurgalı genetik model sistemKanserin DELS. Balığı embriyolar harici transgenesis ve kanser başlangıcında ve ilerlemesinde de dahil olmak üzere patolojik süreçlerin, in vivo gözlem kolaylaştıran döllenir ve optik açıdan berrak olan edilir. Bugüne kadar, yan nüfus tahlil potansiyel kök veya progenitör hücreler sadece HKH'lerin tespit etmek zebrabalıkları böbrek iliği uygulanır ve herhangi bir Zebra balığı kanser modelleri 5, 6 olmuştur algılamak için.

T-hücresi akut lenfoblastik lösemi zebra balığı modeli (T-ALL) morfolojik ve insan T-ALL 7, 8, 11 arasındaki genetik olarak benzer. T-ALL, insanlarda, pediatrik% 10-15'ini ve TÜM vakaların 9 yetişkin% 25'i oluşturuyor saldırgan kanseridir. T-ALL tedavisi geliştirilmiş olsa da, nüks hala yaygındır ve kötü prognoz ile ilişkilidir. T-ALL tümörler Heterojen olanLösemi başlatan hücreler (LIC'ler dahil olmak üzere birçok farklı tümör hücresi alt popülasyonu içerir. LIC'ler tek bir hücreden tüm tümörü yeniden başlatma kabiliyetleri ile tanımlanır ve bir tümör hücre popülasyonu içerisindeki LIC'lerin sıklığı, sınırlayıcı bir seyreltme transplantasyon testi (LDA) aracılığıyla çeşitli hücre dozlarını alıcılara naklederek hesaplanabilir. LICs 8 , 10 , 11 frekansını hesaplamak için zebrafish'de LDA deneyleri yapılırken, bu belirleme gezinme sırasında yapılır ve LIC'lerin prospektif izolasyonuna izin vermez. Bu nedenle, kanserli kök hücre aktivitesi için zenginleştirilmiş bir popülasyonu prospektif olarak izole etmek için bir yöntem bulunmamaktadır. Zebra balığı T-ALL'lerinden yan popülasyon hücrelerinin belirlenmesi ve izole edilmesi bu eksikliği gidermeye yönelik ilk adımdır.

Burada sunulan protokol, Zebr'de T-ALL tümörlerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini açıklamaktadırafish tol2 aracılı transgenesis kullanan T-ALL tümörler hücreleri hasat ve hücrelerin yan popülasyonu tespit Hoechst 33342 ile boyanır. Zebra balığı, T-ALL in vivo deney gelecek yan popülasyonu, hücrelerin Lics için zenginleştirilmiş ya da diğer stem- veya projenitör benzeri özelliklere sahip olup olmadığı içerebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Zebra balığı ile ilgili tüm prosedürler Chicago Üniversitesinde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Chicago Üniversitesi, Laboratuar Hayvan Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Birliği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir.

1. Floresanla Etiketli T-ALL Hücrelerini Zebra bağı ile Üretme ve İzole etme

  1. Eşzamanlı zebrabalık embriyolarına mikroenjeksiyon
    1. Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak, tol2 transposaz (plazmid DNA kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız) tarafından tanınan ters terminal tekrarlarını içeren plazmid DNA'yı izole edin ve DNA'yı elute edin Steril su içinde.
      NOT: Bu çalışmada GFP kullanılır, ancak herhangi bir flüoresan proteini işe yarayacaktır.
    2. PCS2-transposaz (tol2) RNA hazırlayın
      1. Ticari olarak temin edilebilir kitleri kullanarak tol2 plazmid DNA'yı izole edin (bakınız tPlazmid DNA kaynağı için Tablo Malzemesi) 12 ve steril suda DNA'yı elute edin.
      2. Plazmid doğrusallaştırmak için uygun tampon 5 birim NotI kısıtlama enzimi ile 1 saat 37 ° C'de 1 μg tol2 DNA inkübe edin. NotI'yi 65 ° C'de 20 dakika ısı ile inaktive edin.
      3. Ticari olarak mevcut bir RNA transkripsiyon kiti 13 kullanarak doğrusallaştırılmış DNA'dan tol2 RNA'sını SP6 RNA polimeraz ile kopyalayın 13 . RNA'yı -80 ° C'de tek kullanımlık bölümler halinde saklayın.
    3. 250 ng rag2 : c-myc plazmid DNA, 250 ng rag2 : GFP plazmid DNA, 150 ng tol2 RNA ve 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyerek buz üzerine enjeksiyon karışımını hazırlayın. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 μL'ye ayarlayın.
    4. ~ 1 nL enjeksiyon karışımını, tek hücreli bir evre syngeneic zebra balığı embriyonunun hücresine enjekte edin, daha önce kurulmuş bir cam kılcal borudan çekilen bir mikroenjektör ve iğne kullanarakBitmiş Yöntemler 8 , 14 .
      NOT: Transgenik süreç 15 ile üretilen sinsinik zebrafish, transplantasyondan sonra genetik heterojenliği ve bağışıklık reddini ortadan kaldırmak için kullanılır. Bununla birlikte, vahşi tip zebra bifiş veya herhangi bir istenen suş da kullanılabilir.
    5. Enjeksiyondan 24 saat 48 saat sonra ölü, az gelişmiş veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları çıkarın.
    6. Enjekte edilen balıkları enjeksiyondan 6 gün sonra balık sistemine yerleştirin ve standart protokole göre yükseltin 6 .
  2. Tarama enjekte edilen zebra balığı ve tümör büyümesinin izlenmesi
    1. Enjeksiyondan 21 gün sonra, bir epifluorescent mikroskop (uyarılma band pass: 470/40, emisyon bandpass: 525/50) kullanarak bir Petri kabı ve ekran GFP floresan embriyo orta bir damla tek bir enjekte larva yerleştirin.
      NOT: Zebra balığı larvaları oHem rag2 : c-myc hem de rag2'yi entegre etmiştir : GFP, yeşil bir flüoresan timusa (pozitif balık) sahip olacak ve timüsün ötesinde habis yeşil fluoresan hücrelerinin genişlemesi gösterebilir. Bir GFP + timüslü tüm balıklar, bir GFP + T-ALL geliştirmeye devam edecektir. Plazmitlerin entegrasyonunu göstermeyen larvalar, herhangi bir yeşil floresan hücresi (negatif balık) içermezler.
    2. Negatif balı (flüoresans eksikliğine bağlı olarak) ayrı bir tüp içine yerleştirin ve enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra balıkları tekrar izleyin. Enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra, balıkları taramadan önce balık sistemi suyunda% 0.02 tamponlu trikain (MS-222) ile anestezi altına alınız.
    3. Bir floresan etiketli timüs veya floresan etiketli bir tümör için pozitif olan her bir zebra balığı larva'yı, haftada üç kez tümör büyümesini izlemek için tek bir tanka yerleştirin.
  3. Primer tümör balıklarından floresan etiketli T-ALL hücrelerinin toplanması
    1. 0.9x fosfat tamponlu salin (FBS / PBS) içinde en az 20 mL% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetüs sığır serumu hazırlayın.
    2. Bir şişe heparin sodyum tuzu (300 ünite) 1 mL FBS / PBS ekleyin.
    3. Vücudun% 50'sinden fazlasındaki balık içeren tümörleri veya yeme veya yüzme konusunda zorluk çeken balıkları seçin. Balıkları tricaine ile aşırı dozda kurutun veya buzlu suyla daldırın. Solunum hareketleri ve kalp atışlarından yoksun olarak ölümü onaylayın.
    4. Balık başını çıkarmak için traş bıçağı kullanın.
    5. Aşırı kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için balık kavitesini heparin solüsyonu ile yıkayın.
      1. Bir pipet kullanarak, balıkların vücut boşluğuna 100 mcL heparin solüsyonu (adım 1.3.2'de hazırlanmıştır) enjekte edin. Dışa akan tüm sıvıları (kan hücreleri içerecektir) çıkarın ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
      2. Vücudunu tekrar yıkamak için yeni bir pipet kullanın. En az üç kez yıkayın ya da dökülen sıvı berrak hale gelinceye kadarood.
      3. Daha sonraki analizlerde kullanılmayacağı için, 1.3.5.1 ve 1.3.5.2 adımlarında yıkamalardaki tüm sıvıyı atın.
    6. Lösemi hücrelerini toplayın.
      1. Balıkların vücut boşluğuna 100 μL FBS / PBS enjekte edin.
      2. Tüm hücreleri sıkmak / itmek için pipetin ucuyla balık gövdesinin dışına nazik bir basınç uygulayın.
        NOT: Eğer bu adım bir diseksiyon mikroskopu kullanılarak gerçekleştirilirse, vücut boşluğundan dökülen tümör hücreleri belirgindir.
      3. Her bir yıkamadan 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne sıvı ve hücreler toplayın.
      4. Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar (genellikle 5-10 defa) adım 1.3.6.1-1.3.6.3'ü tekrarlayın. Tüm tümör hücrelerini aynı 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne alın. Hücreleri oda sıcaklığında tutun.
    7. Adım 1.3.6'daki toplanan tümör hücrelerini, hücrelerin yığınlarını ayırmak için hafifçe pipetleyerek karıştırın. Hücre süspansiyonunu 4'ten0 um gözenekli filtre. Filtre 1-2 kez 100 uL FBS / PBS ile yıkanır. Hücreleri oda sıcaklığında tutun.
    8. Yeni bir tüpte tripan mavisinin (0.4%, seyreltilmiş 1:10 ve filtrelenmiş) 18 μL'lik hücre süspansiyonunun 2 μL'sini karıştırın. Bir hemositometre üzerine 10 mcL yükleyin ve izole edilmiş tümör hücrelerinin sayısını hesaplamak için canlı (mavi olmayan) floresan hücrelerinin sayısını hesaplayın.
      NOT: Mavi olmayan GFP negatif hücreler büyük olasılıkla normal, kötü huylu olmayan T hücreleridir ve sayılmamalıdır. Hoechst 33342 ile hücrelerin lekelenmesi için en az 2 x 106 hücre gereklidir.

2. Florokimyasal olarak Etiketli T-ALL Hücrelerini, Hoechst 33342 ile Boyanarak Yan Populasyonu Belirleyin

  1. 1 mg / mL çalışma konsantrasyonunu oluşturmak için Hoechst 33342 1:10 'ı nükleaz içermeyen H20 ile seyreltin. Boya 4 ° C'de ve karanlıkta saklanmalıdır.
  2. 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 49.1 mg eriterek bir 100 mM verapamil solüsyonu hazırlayın.
    NOT: Verapamil, ABC taşıyıcılarının bir inhibitörüdür ve yan popülasyon deneyleri için önemli bir kontroltür. Numunelere verapamil ilavesi, ABC taşıyıcılarının Hoechst 33342 boyasını atma kabiliyetini engelleyecektir. Dolayısıyla, verapamil numuneye eklendiğinde doğru bir yan nüfus kaybolur.
  3. 28 ° C'ye kadar su banyosu yapın.
  4. Floresansla aktive hücre ayırıcı (FACS) tüplerine hücre ve solüsyon ekleyerek örnekleri ve kontrolleri karanlıkta hazırlayın.
    1. Numuneleri, bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 μL DMSO ilave ederek hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
    2. Bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 uL 100 mM verapamil ilave ederek kontrolleri hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL'ye ayarlayın.
      NOT: Minimum 10 6 hücre / numune önerilir, ancak özellikle yan populatİyon hücreleri daha ileri analiz için sıralanacaktır. 10 6 hücre / mL'yi aşmayın ve Hoechst 33342 konsantrasyonunu 15 μg / mL'de tutun. 10 x 10 6 hücre lekelenirse, toplam reaksiyon hacmi 10 mL'dir.
  5. Karanlıkta 120 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda inkübe edin.
  6. İnkübasyondan sonra, hücreleri hemen buz üzerine koyun ve karanlıkta tutun.
  7. Hücreleri 4 ° C'de 6 dakika 300 x g'de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS ile yıkayın.
  8. Hücreleri 4 ° C'de 6 dakika 300 x g'de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS'de hücreleri tekrar süspanse edin.
  9. Hücrenin sınıflandırılıncaya kadar 4 ° C'de tutun.
  10. Hücre ayırmadan 15 dakika önce, her bir 1 mL FBS / PBS (son konsantrasyon: 2 ug / mL) 2 μL propidyum iyodür (PI) stokunu (1 mg / mL) ekleyin. İyice karıştırın.

3. Floresanla Etiketlenmiş T-ALL Hücre Popülasyonunda Yan Popülasyonu Bulmak için FACS kullanın

  1. Hoechst 33342 boya uyarma için bir UV lazer ve PI uyarma için bir 488-nm lazeri ile ve GFP + T-ALL hücrelerinin saptanması için donatılmış bir hücre sıralayıcı lekeli zebra balığı, T-ALL hücresi süspansiyonları analiz edin.
  2. canlı için bir kapı belirleyin, GFP + T-ALL hücreleri.
    1. kapı üzerinden çöp Kullanım İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) alan.
      NOT: FSC hücre boyutunu ayırt etmek için kullanılır ve SSC hücresinin ayrıntı düzeyini ayırt etmek için kullanılır.
    2. çiftleri ayırt FSC ve SSC genişliği kullanım.
      NOT: Alan, boy ve genişlik: detektörleri akış sitometresi ile tanımlanan üç bileşeni vardır. Konum tipik olarak hücrenin floresan ölçmek için kullanılır. Genişliği uçuş süresini ölçen ve iki hücre yığılmaz ve sanki iki kat geniştir.
    3. Canlı tümör hücreleri için uygun dedektörleri kullanarak PI için GFP için pozitif ve negatif hücrelerin etrafındaki bir kapı çizin (örneğin GFP ve PI için PerCP Cy5-5 için FITC).
  3. Canlı hücre kapısı olarak, (sırasıyla 450/50 ve 670/30), Hoechst Mavi ve Hoechst kırmızı bant geçiş filtreleri içinden Hoechst 33342 floresan ölçer.
    NOT: Bu kurulduktan sonra yan nüfus varsa, belirgin olacaktır. gerçek bir yan nüfus düşünülmesi için önemlisi, yan nüfus sırayla verapamil kontrolünde kaybolur gerekir.
  4. başka deneyler için yan nüfus hücreleri sıralama durumunda, büyük meme ucu (100 um) kullanmak ve% 100 FBS 3 mL içeren bir FACS tüpü içine hücreleri toplamak. sıralama sonra hücre canlılığı artırmak için daha büyük bir meme ucu (100 um) yerine daha küçük bir uç (70 um) kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Zebra balığı içinde fluoresan myc kaynaklı T-ALL tümörleri verimli bir şekilde üretmek için, tol2 transposaz bölgeleri ile çevrili dairesel DNA yapıları tol2 RNA ile birlikte enjekte edilebilir. Doğrusallaştırılmış DNA'nın zebrafish embriyolarına enjeksiyonundan önceki çalışmalar,% 5 transgenesis oranı 8 bildirmektedir. Protokol, tol2 aracılıklı transgenezi içerecek şekilde ayarlandığında,% 10-44 arasında değişen transgenez oranları gözlemlenebilir ( T...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yan popülasyon tahlili oldukça duyarlıdır; Bu nedenle, protokoldeki küçük değişiklikler, yan popülasyon hücrelerinin saptanmasında zorluklara neden olabilir. İlk olarak, boyama aşamasındaki sıcaklık, her bir hayvan / hücre sistemine özeldir. Memeli sistemleri için yan popülasyon tahlili tipik olarak 37 ° C'de yapılır. Zebra balığı T-ALL hücreleri 37 ° C'de inkübe edildiğinde, çoğu hücre öldü ve bu inkübasyon sıcaklığını kabul edilemez duruma getirdi (veriler gösterilmedi). Kobayashi ve meslektaşları (2008), yan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Chicago Kadın Kurulu Üniversitesi Wendy Will Vaka Fonu ve Şikago Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibe Üniversitesi (P30 CA014599) tarafından desteklenmiştir. Bu deneme oluşturmayla katkılarından dolayı Chicago Üniversitesi'nde Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum ve iyi de Jong laboratuarında diğer üyeleri, özellikle Leslie Pedraza ve Sean McConnell olarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sinjeneik zebra balığı (CG2)Bkz. Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc plazmidiLangenau
Laboratoryrag2:Langenau Laboratuvarı'ndan>><inşa edilen GFP plazmidi
pCS2-transpozaz plazmidiChien'den promotör Laboratuvar
NotI -HF kısıtlama enzimiNew England Bio-Labs Inc.R3189S500 adet 25 ve mikro; L
mMessage Machine SP6 Transkripsiyon KitiAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reaksiyon
QIAGEN Plazmid Midi KitiQiagen, Inc.12643
SteREO Discovery V8 MikroskopCarl Zeiss Mikroskobu495015-0008-000
Dijital mikroenjektörTritech ResearchMINJ-D
Pirinç düz kollu iğne tutucuTritech ResearchMINJ-4
Manyetik taban ve standTritech ResearchMINJ-HBMB
MikromanipülatörNarishige UluslararasıMN153
Cam kılcal damarlarSutter Instrument Co.B100-50-1010 cm filamentsiz
Alevli/Kahverengi mikropipet çektirmeSutter Instrument Co.P-97
Mikro yükleyici pipet uçlarıEppendorf North America Inc.
Fenol Kırmızısı çözeltisiSigma Life ScienceP0290%0,5 konsantrasyon 100 mL
Plastik Transfer pipetleriFisherbrand137119Ddereceli 7,5 mL ampul
Trikain metansülfonat (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
Fetal sığır serumu (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco by Life Technologies1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
Heparin sodyum tuzuSigma-Aldrich210615 - 300 birim şişe
40 ve mikro; m örgü filtreFalcon Corning Marka35234050
Tripan mavisiSigma Life ScienceT815420 mL - Çözelti (% 0.4)
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH357010 mL
VerapamilSigma Yaşam BilimleriV46291 g
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma Yaşam BilimleriD8418100 mL
Propidyum İyodürYaşam TeknolojileriP356610 mL
FACSAria Füzyon hücre sıralayıcıBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
930001007

Kaynaklar

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
  3. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  4. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  5. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
  6. Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
  7. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
  8. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790(2011).
  9. Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
  10. Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
  11. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
  12. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
  14. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
  17. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  18. Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
  19. Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiHoechst 33342Zebrafish T ALLKanser K k H creleriH cre zolasyonuFloresan Aktive H cre Ay klamaVerapamil nhibisyonuPropidyum yod rT h cre L kemisi

İlgili makaleler