Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri
Bu makalede
Özet
Özet
Fare kardiyomiyositleri , in vitro kardiyak fizyoloji çalışmaları ve yeni tedavi stratejileri için yoğun şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ayrışmış kardiyomiyositlerin çok hücreli preparatları, kalbin hem mekanik hem de elektrofizyolojik özelliklerini etkileyen kardiyomiyositlerin, miyositlerin ve hücre dışı matrisin in vivo yapısının kompleksini temsil etmez. Burada, korunmuş in vivo doku yapısı ile yetişkin fare kalplerindeki canlı ventriküler dilimleri hazırlamak için bir teknik ve elektrofizyolojik kayıtlara uygunluğunu göstermek için bir teknik açıklanmaktadır. Kalbin eksizyonundan sonra, ventriküller atriyumdan ayrılır, 2,3-butandion monoksim içeren Ca2 + içermeyen çözelti ile perfüzyonlanır ve% 4'lük düşük eriyikli agaroz blok içine gömülür. Blok titreşen bir bıçakla mikrotom üzerine yerleştirilir ve 150-400 μm kalınlığa sahip doku dilimleri titreşimi serbest bırakarak hazırlanır60 Hz'de bıçak sıklığı ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirerek. Dilimlerin kalınlığı diğer uygulamalara bağlıdır. Dilimler buz soğukluğundaki Tyrode çözeltisinde 0.9 mM Ca 2+ ve 2,3-butandion monoksim (BDM) ile 30 dakika süreyle saklanır. Ardından, BDM'yi yıkamak için dilimler 37 ° C DMEM'ye 30 dakika boyunca aktarılır. Dilimler, kesici elektrodlar veya mikro elektrot dizileri ile elektrofizyolojik çalışmalar için, kontraktil fonksiyonu analiz etmek için güç ölçümleri için veya nakledilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin ve konakçı doku arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir. Keskin elektrot kayıtları için, bir dilim, ters çevrilmiş mikroskopun ısıtma plakasındaki 3 cm'lik hücre kültürü çanağına yerleştirilir. Dilim bir tek kutuplu elektrot ile uyarılır ve dilim içindeki kardiyomiyositlerin hücre içi eylem potansiyelleri keskin bir cam elektrot ile kaydedilir.
Giriş
Yamamot ve Mcllwain 1966'da beyin dilimlerinin elektriksel aktivitesinin in vitro muhafaza edildiğini gösterdiklerinden beri temel bilimde ince doku dilimleri sıklıkla kullanılmıştır. O zamandan beri, beyin 2 , karaciğer 3 , akciğer 4 ve miyokard dokusu 5 , 6 , 7 dilimleri üzerinde elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar yürütülmüştür. Yenidoğan sıçan kalplerindeki ventriküler dilimlerde ilk yama-kelepçe kayıtları 1990'da 8'de tanımlanmıştır, ancak bu teknik bir süre unutulmaya uğradı. Birkaç yıl sonra grubumuz, fare embriyonik 9 , neonatal 10 ve erişkin 11 kalp dilimlerini hazırlamak için yeni bir yöntem geliştirdi. Bu canlı doku dilimleri akut deneyler için kullanılabilir (erişkin dilimS birkaç saat ekilebilir) veya kısa vadeli kültür deneyleri (embriyonik ve yenidoğan dilimleri birkaç gün boyunca yetiştirilebilir). Kesitler elektrofizyolojik özelliklere benzer şekilde in vivo olarak gösterirler ve keskin elektrot aksiyon potansiyeli ve mikro elektrot dizisi kayıtları ile değerlendirildiğinde homojen bir uyarılma yayılır 11 . "İki boyutlu" morfolojilerinden dolayı kayıt elektrotlarının ventrikülün tüm bölgelerine doğrudan erişmelerine izin veriyorlar, bu da elektrofizyolojik araştırmalar için ilginç bir araç haline getiriyor ve Langendorff tarafından perfüze edilmiş kalpler ile karşılaştırıldığında yeni deneysel seçenekler getiriyor. Dilimlerin verapamil (L-tipi Ca2 + -kanal bloke edicisi), lidokain (Na + -kanal bloke edicisi), 4-aminopiridin (seçici olmayan voltaja bağımlı K + -kanal bloke edici) ve linopirdin (KCNQ K) gibi ilaçların iyon tutucu etkisi + -kanal bloke edici) 9 , 11 ayrışmış kardiyomiyositlerde bilinen etkilere karşılık gelmektedir. İzometrik kuvvet ölçümleri pozitif bir kuvvet frekansı ilişkisi ortaya koydu ve güçlü kasılma fonksiyonu önerdi10. Bu bulgular, sıçanın ventriküler dilimlerinin fizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için in vitro bir doku modeli olarak uygun olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kesici elektrot kayıtları ile birlikte alıcı kalplerin ventriküler dilimleri, transplanted fetal 12 , 13 , 14 ve kök hücre kaynaklı 15 kardiyomiyositlerin olgunlaşması yanı sıra elektriksel ve mekanik entegrasyonu karakterize etmek için çok yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
Özetle, ventriküler dilimler değerli ve iyi kurulmuş bir çok hücreli doku modeli olup ayrışmış kardiyomiyositleri ve Langendorff perfüze edilen kalpler için tamamlayıcı olarak düşünülmelidir(Dissociated hücrelere karşıt olarak) bir in vivo benzeri doku yapısı sağlamanın yanı sıra keskin elektrot kayıtları gibi (kalp preparatlarının aksine) kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişim sağlayan en büyük avantajı olan kardiyovasküler araştırmalardır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanların taşınması, yerel hayvan refahı komitesinin ve Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63 / AB sayılı Direktifinin kurallarına uymalıdır.
1. Çözümleri Hazırlama
- Tyrode'nin solüsyonunu Ca 2+ olmadan (mM'de kompozisyon) hazırlayın: NaCI 136, KCl 5.4, NaH2PO4.33, MgCl2, glikoz 10, HEPES 5, 2,3-butandion monoksim (BDM) 30. pH'ı 7.4'e ayarlayın NaOH ile 4 ° C'de.
- Tyrode çözeltisini Ca 2+ (bileşim mM cinsinden) ile hazırlayın: NaCl 136, KCl 5.4, NaH2PO4.33, MgCl2, glikoz 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9. 4 ° C'de NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- % 4 düşük eriyikli agaroz hazırlayın: Ca 2+ içermeyen 0.6 mL düşük eriyikli agaroz 15 mL Tyrode çözeltisine koyun. Karışımı, bir mikrodalga fırında iki kez 750 W'de 10-15 saniye boyunca, agaroz çözünene kadar ısıtın. Çözeltiyi 37 ° C'de sabit bir sıcaklıkta tutun.# 176; C ve sürekli karıştırın.
- Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamını (DMEM) 37 ° C'de serum olmadan carbogen (% 5 CO 2 ,% 95 O 2 ) ile kabarcıklarken muhafaza edin.
2. Microtome'u hazırlayın
- Mikrogramı açın.
- Dış mikrotom hücresini buzla doldurun.
- İç mikrotom bölmesini, Ca 2+ içermeyen soğuk Tyrode çözeltisi ile doldurun ve çözeltiyi% 100 O 2 ile sürekli olarak oksijene koyun.
- Mikro topuzun bıçak tutucusuna bir çelik bıçak takın.
3. Fare Kalp İzolasyonu
- 2,500 U Heparin'i subkütan enjekte edin. 15 dakika bekleyin.
- Hayvanı servikal dislokasyon ile kurban edin.
- Sternotomi ile göğsünü açın.
- Küçük makas ve bir forseps # 5 kullanarak perikardı dikkatle inceleyin.
- Artan aortaya bir kanül yerleştirin ve koroner arterleri buz gibi soğuk Tyrode'lerle in situ olarak perfüze edinKalan kan alınana kadar Ca 2+ içermeyen bir solüsyon.
- Kalbi bir forseps ve makasla hafifçe kesip kalbi buz soğukluğunda transfer edin Tyrode'nin çözümü Ca 2+ olmadan sürdü.
- Atriyumu ventriküllerden bir neşter veya makasla ayırın.
4. Ventriküllerin% 4 Düşük Erime Agaroza Katılması
- Ventrikülleri, tepe kısmı yukarı bakacak şekilde agaroz kalıbına yerleştirin ( Şekil 1 ). Pimi sol ventriküler bölmedeki kalıbın ortasına yerleştirin.
- Kalıbı, kalp tamamen kaplanıncaya kadar 37 ° C'de% 4 düşük eriyikli agaroz ile doldurun.
- Agarozun daha hızlı sertleşmesi için kalıbı buz üzerinde bırakın, dokunun yüzmesini önleyin.
- Ventrikül içeren agaroz bloğu bir bistül ile kalıptan çıkarın.
- Bloğu ters çevirin ve ventriküler odaları ve agaroz bloğun arkasındaki boşluğu doldurun;20 G'lik bir iğneli bir şırınga kullanarak% 4 düşük eriyikli agaroz ile moltun iğnesi bıraktı.
- Blok düz bir alt ve kalp apeksinin dik pozisyonunu elde etmek için agaroz bloğu bir neşter ile kesin.
5. Ventriküler Doku Dilimleme
- Bir damla cyanoacrylate tutkalı ile mikrotomun numune tutucusundaki bloğu sabitleyin. Kardiyak üstü yukarı bakacak şekilde tasarlayın.
- Örnek tutucuyu, Ca 2+ içermeyen buz gibi soğuk Tyrode ile dolu mikrotomun iç numune bölmesine yerleştirin. Tyrode'nin çözeltisiyle agaroz bloğu tamamen örtün.
- Diğer uygulamalara (keskin elektrot kayıtları 150-200 μm için) bağlı olarak 150-400 μm kalınlığında kısa eksen dilimleri hazırlayın, bıçağın titreşim frekansı 60-70 Hz'de tutun ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirin .
- Kalan agarozu dilimlerden dikkatlice çıkarmak için ince bir fırça kullanın.
- Nazikçe gönderR dilimleri,% 0.9 O 2 ile havalandırılan 0.9 mM Ca 2 + ile Tyrode solüsyonuna bir Pasteur pipet ile dilimleme prosedüründen kurtulmak için buz üzerinde en az 30 dakika saklayın.
- Ardından, daha fazla kullanılmadan önce BDM'yi yıkamak için 30 dakika süreyle DMEM'de 37 ° C'de dilimler bırakın, karbogenle havalandırın.
6. Keskin Elektrot Kurulumunun Hazırlanması
- Ön ısıtma için, kayıtların başlamasından 30 dakika önce tüm elektrikli cihazları açın.
- Ters çevrilmiş mikroskopta yer alan ısıtma plakasına 3 cm'lik hücre kültürü kabı koyun.
- Özel yapım halka elektrotunu ( Şekil 2 ) çanağa yerleştirin ve ön amplifikatörün ve stimülasyon elektrodunun topraklama kablolarını bağlayın.
- Perfüzyon sisteminin esnek borularını çanağa bağlayın.
- Perfüzyon sisteminin rezervuarını karbogen ile havalandırılmış DMEM ile doldurun.
- Perfüzyon pompasını açın ve perfüzyon rafini ayarlayın2-3 mL / dk'ya kadar ısıtıldı.
- Akış ısıtıcısını ve ısıtma plakasını düzenleyerek çanak içindeki DMEM sıcaklığını 37 ° C'ye ayarlayın.
7. İşlem Potansiyel Kayıtları
- DMEM dolu tabağa bir ventriküler dilim yerleştirin.
- Ters çevrilmiş mikroskop ile yapının yapısal bütünlüğünü ve yaşayabilirliğini kontrol edin (kontraktil fonksiyona dayanmaktadır).
- Bir kayıt cam elektrodu 3 M KCL ile doldurun.
- Bir uyarılma elektrotunu DMEM ile doldurun.
- Kayıt elektrodunu ve stimülasyon elektrodunu elektrot tutucularının üzerine yerleştirin.
- Uyarı elektrodunu dilim üzerine dikkatle yerleştirin ve elektrik stimülatörünü açın. 1-2 Hz'lik bir stimülasyon frekansı ile başlayın.
- Kayıt elektrodunu mikromanipülatör ile istenen kayıt pozisyonunun üzerine getirin.
- İpucu dokuya dokunana kadar kayıt elektrodunu yavaşça indirin.
- Şebekeden kısa dikdörtgen elektrik darbesi uygulayın.Kayıt elektrotu hücre zarı içine nüfuz eder.
- Kayıt elektrodunu kararlı bir sinyal gelene kadar dikkatlice yeniden konumlandırın.
- Aksiyon potansiyellerinin kaydını başlatın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Miyokard enfarktüsü kardiyomiyositlerin neredeyse geri döndürülemez bir kaybına yol açar. Eksojen kardiyak rejenerasyon için kök hücre kaynaklı kardiyomiyositleri kullanarak hücre replasman tedavisi umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Transplante hücrelerin elektriksel entegrasyonu ve olgunlaşması, hücre replasman tedavisinin güvenilirliği ve etkinliği için çok önemlidir.
Entegrasyon ve olgunlaşmayı değerlendirmek için yetişk...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ventriküler dilimler, korunmuş bir in vivo doku yapısı ve ölçme teknolojisinin kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişimi ile elektrofizyolojik, farmakolojik ve mekanik çalışmalara olanak tanır. Fizyolojik aksiyon potansiyel özellikleri embriyonik, neonatal ve erişkin dilimlerde gösterilmiştir 9,10,11. Dilimleme işlemi ile doğrudan hasar gören yüzey tabakaları haricindeki dilimlerin canlılığı, canlılık boyaması ile teyit edilmiştir 9 . Burada açıklandığı gibi transplanted kardiyomiyositleri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Çalıştaylar ve Nörofizyoloji Enstitüsünün hayvan tesisi tarafından sağlanan desteği onaylıyoruz. Bu çalışma Walter und Marga Boll Stiftung, Köln Fortune ve Deutsche Stiftung für Herzforschung tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya | Titreşimli bıçaklı mikrotom. | |
| Paslanmaz Çelik Bıçaklar | Campden Instruments, Loughborough, İngiltere | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipetleri | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | Z627992 | |
| İnce fırça, e. boyut 6 (4/32") | VWR, Uluslararası, Radnor, ABD | 149-2125 | |
| Hazırlık masası | |||
| ventrikülleri gömmek için kendi kendine yapılan Molt agaroz | kendi kendine yapılan | ||
| 1 mL Şırınga | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, ABD | 300013 | |
| 27 G x 3/4'' İğneler | Braun, Melsungen, Almanya | 4657705 | |
| 20 G 11/2'' İğneler | 4657519 | ||
| Küçük makas | WPI, Sarasota, ABD | 501263 | |
| Cımbız #5, 0,1 x 0,06 mm uç | WPI, Sarasota, ABD | 500342 | |
| Oksijen gazı (tıbbi sınıf O2) | Linde, Münih, Almanya | ||
| Karbojen gazı (%95 O2, %5 CO2) | Linde, Münih, Almanya | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | 51558 | |
| NaHCO3 | >Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | S5761 | |
| D (+)- Glikoz | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | G8270 | |
| MgSO4< / sub> | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, ABD | S8045 | |
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | Henkel, Dü Sseldorf, Almanya | ||
| Düşük eriyik Agarozu | Roth, Karlsruhe, Almanya | 6351.2 | |
| Heparin-sodyum-25000 IE/5 mL | Ratiopharm, Ulm, Almanya | ||
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, ABD | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifikatör | npi electronic GmbH, Tamm, Almanya | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Almanya | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Almanya | ||
| Düşük büyütmeli Mikromanipülatör | Narashige, Tokyo, Japonya | Nm-3 | |
| Yüksek büyütmeli, üç eksenli mikromanipülatör | Narashige, Tokyo, Japonya | MHW-3 | |
| Peristaltik perfüzyon pompası | Çok Kanallı Sistemler, Reutlingen, Almanya | PPS2 | |
| 2 kanallı sıcaklık kontrol cihazı | Çok Kanallı Sistemler, Reutlingen, Almanya | TCO02 | |
| Kare nabız stimülatörü | Natus Europe GmbH, Planegg, Almanya | Grass SD9 | |
| Cam kılcal damarlar | WPI, Sarasota, ABD | 1B150F-1 |
Kaynaklar
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
