Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.
Bu makalede
Özet
Özet
Canlı görüntüleme sürekli gerçek zamanlı olarak dinamik hücresel ve gelişimsel süreçleri izleme olanağı sağlar. Drosophila larva hayali diskler böyle hücre çoğalması, farklılaşması, büyümesi, göç, apoptoz, rekabet, hücreler arası iletimde, ve kompartıman sınır oluşumu gibi birçok biyolojik süreçleri, çalışma kullanılmıştır. Ancak, uzun süreli ex vivo kültür ve hayali diskler canlı görüntüleme yöntemleri birçok çabalara rağmen, tatmin edici olmamıştır. Son zamanlarda, uzun vadeli ex vivo kültür ve en fazla 18 saat hayali diskler canlı görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Kültür ortamı içinde, yüksek insülin konsantrasyonu kullanılarak ek olarak, bir düşük erime noktalı agaroz ayrıca, görüntüleme süresi boyunca kaymasını önlemek için disk gömmek için kullanılmıştır. Bu rapor örnek olarak göz anten diskleri kullanır. Fotoreseptör R3 / 4 spesifik mδ0.5-GA4 ekspresyon ayırıcı bu fotoreseptör göstermek için izlenmiştirdüzene sokan ve ommatidial rotasyon 10 saat canlı görüntüleme süresi boyunca görülebilir. Bu, bu basit bir yöntem açıklayan ayrıntılı bir protokoldür.
Giriş
Drosophila larva hayali diskler biyolojik mekanizmaları çok çeşitli çalışma için tercih deneysel sistem olmuştur. Bu diskler, iki epitel tabakaları ile inşa kesesi benzeri yapılar embriyonik epitelden invagine haline, Peripodial Epitel (PE) ve uygun Disk (DP) 1, 2. hayali disk hücreleri çoğalır ve giderek larva ve pupa aşamalarında farklılaştırmak ve sonuçta erişkin vücut yapılarına gelişir. Nedeniyle hayali diskler düz ve basit iki katmanlı yapısı, onlar larva disseke zaman gözlemlemek kolaydır. Ancak, birçok gruplar tarafından çeşitli çabalara rağmen, hayali diskler uzun vadeli kültürü için mevcut yöntemler tatminkar olmamıştır. Geçenlerde en fazla 18 saat çoklu hayali diskler normal gelişimini devam edebilir bir kültür yöntemi geliştirdik ve bu canlı görüntüleme 3 tanır Yukarı. kültür yöntemi, hücre farklılaşması ve taşıma destekleyebilir, ancak yalnızca 7-12 saat boyunca hücre çoğalmasını destekleyebilir ve disk büyümesini desteklemez. Kültür ortamında önemli fark insülin 3 yüksek konsantrasyondur. yöntem basittir ve hiçbir özel havalandırma veya orta dolaşım gereklidir.
en çok çalışılan hayali diskler biri göz anten disktir. Drosophila göz yaklaşık 800 ommatidia inşa edilmiştir. Her ommatidium sekiz fotoreseptör hücrelerinin (R1-R8) oluşur. Larva göz disk, fotoreseptör hücreleri 4, 5 anterior posterior göz diski süpürür Morfojenetik Furrow (MF), geçişi izleyen farklılaştığı. Bir ommatidium fotoreseptörlerin R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 ve R7 6 ardından R8 ile başlayan, sırayla ayırt. dorsal ommatidia'lar ve ettikGöz diskin ntral yarımları zıt kiraliteye 7, 8 ile sonuçlanan, ters yönde 90 ° 'lik dönme tabi tutulur. dönme işlemi iki aşamada gerçekleşir: İlk olarak, 45 ° 'lik dönme başlar ve MF arkasında altıncı ommatidia'lar satırdaki tamamlanır; ikinci 45 ° 'lik dönüş satır 16 9, yaklaşık 10 tamamlanır. R3 / 4 spesifik mδ0.5-GA4 11 ile işaretlenmiş ommatidial dönme kullanılan bu çalışma, kültüre bu yöntem sayesinde gözlemlenebilir normal hücresel farklılaşma ve dinamikleri göstermek ve göz diski imajını canlı.
Protokol
1. Ön deneysel Kur
- 5 gün boyunca 25 ° C'de bir sinek mδ0.5-Gal4 altında nükleer yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden yumurta ve kültürünü toplayın.
- Mikrodalga agaroz 1x Fosfat tamponlu tuzlu su, 10 mL agaroz tamamen eriyene kadar (PBS) içinde, düşük erime 0.7 g. 37 ° C kuluçka makinesi içinde kullanıma kadar% 0.7 düşük erime sıcaklıklı jel tutun.
- Birden fazla 12 saat boyunca% 70 etanol ile forseps, makas 42 mm x 0.17 mm lamelleri, 9 oyuklu cam nokta plaka ve bir manyetik kültür odası dahil olmak üzere tüm ekipman, sterilize edin.
- % 2 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 0.5 penisilin-streptomisin ve 1.25 mg / ml insülin ile takviye Schneider Drosophila ortamı: kültür ortamı 3 hazırlayın. kirlenmesini önlemek için, bir hücre kültürü kaputu ortamı hazırlar. 4 ° C 'de hazırlanan kültür ortamı Mağaza ve bir ay içinde kullanılır.
- Diseksiyon platform ve deneyci' temizleyindiseksiyon başlamadan önce ler% 70 etanol ile el.
2. Disk Diseksiyon
- Hava% 70 etanol gelen tüm ekipman kurutun.
- Bir sinek şişesinden bir üçüncü evre larva seçin. sinek Flakondan kirlenmesini önlemek için, atık kaldırmak için 1x PBS 3x larva yıkayın.
- bir diseksiyon mikroskobu altında 9 gözlü cam nokta plakada (oda sıcaklığında) kültür ortamının 1 mL temizlenmiş larva teşrih.
- Yaklaşık bir arka ucundan bir şekilde üçüncü ve ağız kanca başka forseps ile bir çift forseps ile larva tutun. Iç doku serbest bırakmak için zıt yönlerde iki forseps çekin.
- Ağız kanca takılı göz-beyin kompleksinden tükürük bezleri, vücut yağ ve manikür çıkarın. ventral sinir kordonu hala bağlı ise, makasla onu kesip.
- co doku parçası kaldırmak için ağız kanca ve forseps bir çift kavrama forseps bir çift kullanındorsal bölümünde beyinleri ve göz diskleri nnects.
NOT: Bu doku kaldırılmazsa, iki göz anten diskler birbirleriyle ve beyne yakın olacaktır. Bu doku, beyin ve göz anten disk, üçgen şekli çünkü göz Diskler daha sonra lamel üzerinde düz olarak durmaktadır olmaz. - Ventral-yukarı konuma bütün kompleks döndürün. Beyne kanca veya diski bağlayan filamanın çıkartın.
NOT: filaman kaldırılmazsa ağız kanca kaldırıldığında, göz anten disk iki parça bölünecek.- Ağız kanca çıkarın. sürecinde göz diski zarar vermemeye özen gösterin.
NOT: Göz disk şimdi ortamdaki serbest ve tek optik sap ile beyne bağlı olduğunu.
- Ağız kanca çıkarın. sürecinde göz diski zarar vermemeye özen gösterin.
3. Montaj
- Hava ve kuru bir 42 mm x 0.17 mm örtücü kısım haznenin bileşenleri bir araya getirin. th tutmak için kapak kayma merkezine O-halkalarının bir çift katmanlı takınE agaroz.
- lamel ile bölme bir araya getirin. aşama alıcı 42 mm x 0.17 mm lamel koyun. kapak üzerinde bulunan silikon bir O-halkası yerleştirin. tabanını yerleştirin. Sızdırmazlık dolap Kilit kapağı (Şekil 1) koyun.
- Dikkatli bir şekilde 10-200 uL ucu olan bir 20 uL mikropipet kullanılarak O-ring merkezine parçalara göz-beyin kompleksi aktarın.
- Sıvı ortamı en iyi çıkarın ve örnek (37 ° C'de),% 0.7 düşük erime noktalı agaroz 12 uL ekleyin.
NOT: Göz diskin pozisyon agaroz sertleşmesinden önce forseps ile değiştirilebilir. Agaroz 5 dakika içinde katılaşacaktır.- O-ring merkezine oda sıcaklığında 1 ml kültür ortamı ilave et; her biri O-halka 4 örneğe kadar yükleyebilir. Agaroz numunenin sürüklenmesini önlemek için O-ring yapıştırılmış olduğundan emin olun.
NOT: ortamın hiçbir havalandırma veya dolaşım gereklidir.
- O-ring merkezine oda sıcaklığında 1 ml kültür ortamı ilave et; her biri O-halka 4 örneğe kadar yükleyebilir. Agaroz numunenin sürüklenmesini önlemek için O-ring yapıştırılmış olduğundan emin olun.
4. Konfokal mikroskopi
- sıcaklığı eşitlemek için 30 dakika boyunca bir ters konfokal mikroskop aşamasında odasına yerleştirin. Bu görüntüleme sırasında Z ekseni sürüklenme önleyebilir.
- Uzun süreli canlı görüntüleme önce, doku diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile bozulmamış olup olmadığını kontrol edin.
- fototoksisite önlemek için, 2 mW altındaki bir lazer gücü kullanacak. görüntüleme için 40X objektif kullanın.
- 1 um bir optik aralıklarla 12 dakika içinde 62 um, Z-yığın görüntüler elde. 10 saatlik bir toplam üzerinden taramasından 40 döngü elde edin. her döngü görüntüleme 12 dk ve dinlenme 3 dakika içerdiğinden emin olun.
Sonuçlar
Bu örnekte, R3 / R4 fotoreseptör fotoreseptör farklılaşmasını izlemek için mδ0.5-GA4 ile etiketlenmiştir. mδ0.5-GA4 olarak ommatidial dönme işlemi için, bu, R3 ve R4 için mükemmel bir patron yapım, R3 11'de R4 güçlü ekspresyonu ve zayıf ekspresyonu sağlayan. Film 1, R3 ve R4, GFP ile etiketlenmiştir. 10 saat canlı görüntüleme oturumunun başında, ommatidial kümeler (Şekil 2A ve Film 1) ve sonunda (Şekil 2B) ommatidial kümelerinin 14 satır 8 satır vardı. Ommatidial farklılaşma oranı, in vivo olarak diskleri 7, 8, 9, 10, 11 1.5-2 saat / sıranın oranına yakın olan, sıra başına 1.67 saat olmuşturs = "xref"> 12, 13, 14. R3 ve R4 nispi konumlarına bağlı olarak, ommatidial dönme canlı görüntüleme (Şekil 2A 'A', B' ve B '') sırasında, ex vivo kültürlenmiş disk meydana geldi. Tek bir R3 / R4 küme film 2'nin birinci çerçevedeki bir beyaz küre ile etiketlenmiştir. Başlangıçta, R3 / R4 ekseni ekvator (Şekil 2C ve Film 2) dik olacak şekilde görünür. Daha sonra, sırasıyla, (Şekil 2C '' ') h 3 (Şekil 2C'), 6 (Şekil 2C '') 15 °, 30 ° ve 45 ° döndürmek için görüntülenir ve 9. Bu veriler, bu yöntem 10 saat canlı görüntüleme sırasında fotoreseptör farklılaşmayı sürdürmek ileri sürmektedir.
Figu1 re: Oda Meclisinin Şematik. Hazne düzeneğinin şematik diyagramı: (1) aşama alıcı çift katmanlı O-ring bağlı lamel koyun. (2) bir kapak üzerinde silikon O-halka yerleştirin. (3), taban. (4) sızdırmazlık dolap kilitler. (5) O-ring merkezinde örnek yükleyin ve kapağını kapatın. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2, R3 / R4, türev ve Rotasyon Canlı Görüntüleme. R3 / R4 canlı görüntüleme 10 saat boyunca nükleer bir şekilde GFP ifade mδ0.5-Gal4 ile etiketlenmiş. Tüm rakamlar Film 1'den ele geçirildi. Başında alınan (A) görüntüsü. ( > A 'A") sola (A') ve sağ (A kutulu alandan genişlemiş Resmi"). (B), resim 10 saatlik bir süre sonunda alınmıştır. "((P'-B) sola (B') ve sağdaki B) kutulu alandan genişlemiş Görüntü". (CC ' '), (A bir ok ile gösterilen bir tek, R3 / R4 çift'), R3 / R4 çiftinin rotasyon sergilemektedir için zaman içinde takip edilir. Ölçek çubukları = 15 um, sırasıyla 10 um, ve A, B, ve C de 5 um. Tüm şekiller maksimum yoğunluğu z tahminleridir. zaman ölçeği saat gösterilmektedir: min. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi" target = '_ blank'> Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu çalışmada, Drosophila hayali diskler üzerinde uzun süreli canlı görüntüleme deney için ayrıntılı bir protokol sağlar. Dikkatli diseksiyon disk zarar görmemesi için ve lamelleri yakın diskin yapışmasını sağlamak üzere pratik çok zaman geçirdi. Bu doku tutmak için Poli-L-lisin (PLL) ve agaroz düşük erime çalıştı; Sonunda, düşük erime noktalı agaroz doku tutmak için daha iyi bir yeteneği gösterdi. sadece göz diski 10 saat canlı görüntüleme döneminde fotoreseptör farklılaşması ve ommatidial normal dönme oluşumunu göstermek için bu yazıda kullanılmış olmasına rağmen, bir de gösterildiği gibi, bu yöntem de en az bir başka disk, kanat disk uygulanabilir Bir önceki çalışmada 3. Dahası, kültür ortamı hazırlama ve canlı görüntüleme kurulumu basittir ve havalandırma veya orta dolaşımını gerektirmez.
Sürekli canlı görüntüleme biyolojik arifesinde net bir zamansal dizisi sağlayabilirnts. Göz diskin glia farklılaşma ve göç eden önceki raporda, sarma çlia göz pulunun 3 ön göç sonrasında mevcut glia ayırt o direkt kanıt sağladı. Uzun süreli ex vivo kültür davranışlarını 3 takip etmek böyle KAEDE floresan proteininin fotoğraf dönüşümü olarak hücrelerin, spesifik lazer aktive etiketleme sağlar. Aynı zamanda, kültür ortamı doğrudan ilave kimyasal maddelerin test barındırabilir; Bu şekilde, bir ilaç tarama platformu olarak kullanılabilir. Bazı dinamik süreç dakika veya saniye içinde cereyan ettiği için, yüksek zamansal çözünürlük gereklidir. Zamansal çözünürlük, ışık levha mikroskopisi 15, 16 veya eğirme disk mikroskopisi 17 arttırmak için iyi bir seçenek olabilir.
Geçerli kültür koşulu mükemmel değildir. Bu disk büyümesini desteklemez. Hücre proliferation sadece yukarı 12 saat 3 için desteklenir. Ex vivo kültür içinde 12 saat sonra, fotoreseptör farklılaşma oranı 3 azalmaya başlar. Bu, belirli besinlerin veya hormonların eksikliği nedeniyle olabilir. Bu kültür ortamında önemli fark, yüksek insülin konsantrasyonu için, memeli insülin endojen insülin-benzeri peptidlerin fonksiyonunu taklit eden kısmen olabilir. Uçucu özü, böcek kan şekeri trehaloz ve deri değiştirme hormonu 20-hidroksiekdison çeşitli konsantrasyonlarının eklenmesi, 3 yararlı değildi. Ancak, 12-18 saat kültür dönemi birçok gelişim süreçlerini incelemek için yeterlidir. Larva hayali diskler kültürleme için alternatif kültürleme metotları 3 karşılaştırılmıştır ve bizim kültür ve görüntüleme koşulu canlı görüntüleme için en uzun zamanı penceresi ve en netlik sağlar. canlı larva ve pupa içinde diskleri doğrudan görüntülü olabilir rağmen18, 19, 20, 21, 22, gözlemler için çözünürlük ve zaman penceresi sınırlıdır. Geç larva ve pupa diskler uzun süre 23, 24 için kültüre, ancak diskler önemli morfonogenezi tabi tutulabilir. düz ve 2B larva disklerin yararlanmak için lütfen kültürü ve görüntüleme yöntemi şimdiye kadar en iyi çözümdür.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Biz sinek stoklarının sinek yiyecek hazırlama ve bakımı için Chun-lan Hsu ve Yu-Chi Yang minnettarız ve Su-Ping Lee ve konfokal mikroskobu ile yardım için IMB Görüntüleme Core. Bu çalışma, 101-2321-B-001 -004 NSC 100-2321-B-001 -012 NSC 102-2321-B-001 -002, EN 103-2311-B-001 YHS (MGK hibe ile desteklenmiştir Ulusal Bilim Konseyi ve Çin Cumhuriyeti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan -035 -MY3).
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Düşük erime noktalı agaroz | AMRESCO | 0815-25G | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0,17 mm kapak astarları | PST | G401-42 | |
| Schneider' s Drosophila orta | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penisilin-streptomisin ve nbsp; | GIBCO | 759 | |
| İnsülin | Sigma | I9278 | |
| Kültür odası | PECON | POC-R2 Hücre Yetiştirme Sistemi | |
| 40X objektif | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objektif | ||
| Sinek suşu: nls. GFP | Çiçek Açmagton | 4775 |
Kaynaklar
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744(2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
Yeniden basım ve izinler
