Bu el yazması, klinik ve çevresel V arasındaki hızlı ve güvenilir diferansiyasyon için topluca kullanılan bir dizi biyokimyasal tahlilin yanı sıra, uygun Vibrio kolera bakımı tekniklerini tanımlamaktadır. Bir laboratuar ortamında kolera biyotipleri.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Biyotiplerin Bakımında ve Türevinde Kullanılan Laboratuvar Teknikleri
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Sucul Gram-negatif bakteri Vibrio cholerae , bulaşıcı gastrointestinal hastalık kolera'sının etyolojik ajanıdır. Bu hastalığın yaygınlığı ve şiddeti nedeniyle, V. Kolera, uygun bakım ve kültür teknikleri gerektiren çevresel ve laboratuvar ortamlarında kapsamlı olarak incelenmiştir. Klasik ve El Tor, V'yi oluşturan iki ana biyotiptir. Kolera O1 serogrup, her biri biyotip karakterizasyonu için güvenilir mekanizmalar sağlayan benzersiz genotipik ve fenotipik özellikler gösterir ve kültürel koşulları uyandıran virülans gerektirir. Herhangi bir enfeksiyon ya da salgın için nedensel suşun biyotipinden bağımsız olarak, hastalık için standart tedavi rehidrasyon terapisini antibiyotik rejimi ile takviye edilmesini içerir. Bununla birlikte, biyotip sınıflandırması laboratuar çalışmaları için gerekebilir ve biyomedikal alanda daha geniş etkilere sahip olabilir.2000'lerin başında hem klasik hem de El Tor biyotiplerinden genotipik ve fenotipik özellikler sergileyen klinik izolatlar tespit edildi. El Tor varyantları olarak adlandırılan yeni tanımlanan melezler, klinik ve çevresel izolat biyotip tanımlamasının önceki geleneksel tek deney tanımlama protokollerinden daha karmaşık hale gelmesine neden oldu. V'yi tanımlamanın yanı sıra. Kolera genel bakım ve kültür teknikleriyle, bu el yazması PCR temelli genetik ekranlar ve fenotipik tahliller (polimiksin B direnci, sitrat metabolizması, proteolitik aktivite, hemolitik aktivite, motilite ve glikoz metabolizması ile Voges- Proskauer tahlili), klasik ve El Tor biyotiplerini tanımlamak ve / veya ayırmak için topluca kullanılır. Bu analizler birlikte, alternatif olarak veya buna ek olarak pahalı, yoğun emek yoğun deneyler için etkili bir sistematik yaklaşım sağlamaktadır.V. Kolera klinik (ve çevresel) izolatlar.
Giriş
Kolera kirlenmiş yiyeceklerin veya sudaki Gram-negatif bakteri Vibrio cholerae'nin bulunduğu suyun tüketiminden kaynaklanan distal ince bağırsağın bir hastalığıdır. Kolera semptomları, kusma ve kontrol edilemeyen sulanmış ishale neden olur ve ciddi şekilde dehidrasyona yol açar ve düzgün tedavi edilmezse ölümle sonuçlanacaktır. V. Kolera, hücre yüzeyi lipopolisakarid O-antijeninin yapısına dayanan 200'den fazla serogrupa bölünebilir. Bununla birlikte, sadece 2 serogrup, O1 ve O139, epidemik veya pandemik potansiyel 1 , 2 göstermiştir. Dahası, serogrup O139, öncelikle Güney....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Her tahlil için zaman faktörleri ayrı ortam hazırlıkları için farklı zaman gerektirdiğinden yapılmalıdır. Örneğin, katı agar plakası ortamının yeterince soğumasına ve kurumasına (1-2 gün) izin verilmelidir. Ek zaman faktörleri ( yani, tek koloni ve gece boyunca kültür büyümesi) her protokol altında belirtilmiş ve Tablo 2'de bulunmuştur.
1. Medyanın Hazırlanması
- 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS)
- 4.0 g NaCI, 0.1 g KCI, 0.72 g Na2HP04 ve 0.12 g KH2PO4 tartın. Bileşenleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi deiyonize su ile 500 mL'ye ayarlayın, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Herhangi bir bakteri suşunun uygun şekilde bakım ve kullanımı için, ilgili suşların katlanma zamanını bilmek tavsiye edilir. Burada, yaygın olarak kullanılan V'nin değişen büyüme oranları. Kolera suşları bir büyüme eğrisi vasıtasıyla gösterildi ve yaklaşık çiftleme süreleri doğrusal regresyon kullanılarak hesaplandı. WT El Tor N16961 ve El Tor varyantı MQ1795, WT klasik O395'e (~ 2 saat) kıyasla daha kısa katlanma süreleri (sırasıyla ~ 1 saat ve ~ 1 saat) göstermiştir ( .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Belirlenen 200'den fazla V. Kolera serogrupları, sadece O1 ve O139 epidemik potansiyele sahiptir. O1 serogrup iki biyotipe ayrılabilir: klasik ve El Tor. Bununla birlikte, El Tor'un 13 ve 17 tipi olarak adlandırılan melez soyları, El Tor'un biyotip arka planına sahip ve 8 , 9 , 10 , 11 ,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
NIH Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsünden bir Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA), P20GM103506 aracılığıyla New Hampshire-INBRE tarafından desteklenen araştırma.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 kb DNA Merdiveni | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| %60 Gliserol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Ağar beyin-kalp infüzyonu ile | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Susuz K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Kan Agar Plakaları | Remel | R01200 | 4 & derecede saklayın; C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Borik Asit | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromotimol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Sirtrik asit ve orta nokta; H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti Kiti | New England Biolabs | N0446S | -20 &°C'de saklayın; C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Disodyum EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı ve ticaret; -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nükleik Asit Lekesi | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spektrofotometre | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Maya/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Aşındırıcı; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH< alt>2PO4 | Fisher Bilimsel | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Bilimsel | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Laboratuvarları A.Ş. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Laboratuvarları A.Ş. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4 ve orta nokta; 7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Hücre GT Yatay Elektroforez Sistemi | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Et Suyu | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4· 4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Yağsız kuru süt | Nestle Karanfil | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petri Kabı (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petri Kapları (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polimiksin B sülfat tuzu | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | 2-4 ° C'de saklayın; C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polimeraz | New England Biolabs | M0273S | -20 °C'de saklayın; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaksiyon Tamponu | New England Biolabs | M0273S | -20 ° C'de saklayın; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Termal Döngüleyici Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Trifeniltetrazolyum klorür | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Tripton | Becto, Dickinson ve Ve Tic. Ltd. Ş | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Maya Özü | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| &alfa;-naftol | MP Biyomedikal | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
Kaynaklar
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
