Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Özet

Bu protokol için Kafesli protein kinaz A (PKA), hücresel sinyal iletim bioeffector bir nanopartikül yüzey üzerine immobilize sitozol microinjected ve upconverted UV yakın kızılötesi (Nur) ışınlama ışığı sayesinde inducing aşağı akım stres fiber dağılma sitozol içinde.

Özet

Upconversion nanopartikül (UCNP)-aracılı photoactivation için uzaktan kontrol bioeffectors derin doku penetrasyon ile çok daha az fototoksisite ile yeni bir yaklaşımdır. Ancak, piyasada mevcut araçları kolayca upconversion uygulama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, ticari araç değiştirerek bu araştırma için esastır. Bu yazıda, ilk geleneksel fluorimeter ve floresan mikroskop foton upconversion deneyler için uyumlu olmaları için değişiklikler göstermektedir. Biz o zaman bir yakın kızılötesi (Nur) sentezi tarif-UCNP kompleksi immobilize Kafesli protein kinaz A katalitik alt birimi (PKA) tetiklenir. Mikroenjeksiyon ve Nur photoactivation yordamlar için parametre de raporlanır. Kafesli PKA UCNP REF52 fibroblast hücreleri microinjected sonra geleneksel UV ışınlama için önemli ölçüde üstün olduğunu, NIR ışınlama PKA sinyal iletim yolu canlı hücreler içinde etkili bir şekilde tetikler. Buna ek olarak, pozitif ve negatif kontrol deneyleri stres lifleri dağılması için önde gelen PKA kaynaklı yolu özellikle NIR ışınlama tarafından tetiklenir onaylayın. Böylece, UCNP protein-modified kullanımı UV ışığı doğrudan maruz kaçınılmalıdır ışık modülasyonlu hücresel deneyler uzaktan denetlemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Photoactivated (Örneğin, Kafesli PKA proteinler) olabilir kimyasal olarak değiştirilmiş proteinlerin kimyasal Biyolojide invaziv olmayan hücreler arası biyokimyasal süreçler^{1,2 işlemek için gelişmekte olan bir alanı olarak geliştirilmiştir ,3}. Bunlar aktif hale getirildiğinde bir uyarıcı mükemmel kronolojik zamanmekansal çözünürlük sağlar gibi ışık kullanarak proteinler Kafesli. Ancak, UV ışığı istenmeyen morfolojik değişiklikler, Apoptozis ve DNA hasarı hücreleri^4,5' e neden olabilir. Bu nedenle, tasarım son gelişmeler photocaging gruplarının photocleavage fototoksisite, de derin doku penetrasyonu^6,7artırmak olarak azaltmak için dalga boyu daha uzun veya İki fotonlu uyarma üzerine etkinleştirme hakkında odaklan. Bioeffectors iki uzun dalgaboyu bize uygun uncaging dalga boylarında (Yani, kanalları) seçmek seçime bağlı olarak izin verdiği yanıt caging grupları etkinleştirmek veya mevcut⁷daha fazla caging gruplarıdır. Bu yararlı özellikleri göz önüne alındığında, yeni kırmızı ışık photocaging grupları ters yönde çalışmalarında çok önemli biyolojik araştırmalar reaksiyonlar hücresel aktiviteler⁸denetleme mekanizmalarının sondalama arasında değişen fotokimyasal yöntemleri geliştiriyor. Yine de, bir iki fotonlu caging normalde erimiş Aromatik halka yapısı nedeniyle çok hidrofobik grubudur ve görünür ışık caging ile aromatik ligandlar normalde Organometalik grubudur. Bu hidrofobik/aromatik özelliği etkinleştirme sitesi enzim/protein denatures ve fiil ve photolysis hala kimyasal düzeyde^{2 işe bile işlevi, kaybolmasına bioeffector bir protein veya enzim, ne zaman uygun değil ,9}.

UCNPs Nur uyarma ışık UV için dönüştürmek etkili dönüştürücüler vardır. UCNPs bu benzersiz ve ilginç özelliği sorunları ele almak üzere gerçekçi kararlar photoactivation ile ilişkili ve kontrollü serbest bırakmak-in küçük moleküller, sisplatin türevleri^{11 folik asit10, dahil tetiklenen teklif etti} , DNA/siRNA¹², kopolimer veziküller¹³ve içi boş parçacıklar¹⁴. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde, proteinler ve enzimler UCNP destekli photoactivation defa test edilmemiştir. Kırmızı ışık veya NIR fotoaktif için bir enzim kullanarak başarılı bir dava yok çünkü biz kimyasal olarak değiştirilmiş Kafesli enzim kompleksi silis kaplı ile oluşan bir protein/enzim yapısı NIR tetiklemeli aktivasyonu gerçekleştirmek için istemde, UCNP¹⁵lanthanide katkılı. Bu çalışmada, UCNP bir hızla tepki sinyal iletim kinaz Kafesli PKA şeklinde ile Birleşik. PKA glikojen sentez ve siklik adenozin fosfat (kampı) yönetmelik sitozol¹⁶üzerinden dış uyaranlara yanıt hücre iskeleti düzenlenme denetler. Biz NIR ışınlama sonra hücresel bir deneyde zamansal ve mekansal davranış enzim harekete geçirmek fizibilite okudu. Bu photoactivation UCNP destekli platform photoactivate için yeni bir yöntem NIR kullanarak bir enzimdir ve geleneksel UV ışınlama^2,4tarafından neden olduğu hücre istenmeyen sinyal iletim yanıtından önler.

Çok büyük bioeffectors translocate zordur (örneğin, proteinler) hücresel hareketlilik denetlemek için hücre zarı arasında. Parçacık immobilize protein endositoz ile sitozol translocate daha kolay olabilir, ancak endositoz bozulabilir veya endosomal tuzak ve bunun sonucunda lizozomal bozulması^2,4yolu ile bozulmuş. Kafesli protein membran translocation sonra hala işlevsel olsa bile, translocated tutarları hücresel yanıt^2,17tetiklemek için yeterli olmayabilir. Keskin aksine, mikroenjeksiyon büyük bioeffectors hücre sitoplazma için teslim etmek için bir doğrudan ve nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, UCNP etkisiz hale bioeffector upconverted ışık etkinleştirilmesini gerektirir. Bu nedenle, optik araçları daha fazla ölçmek, görselleştirmek ve upconversion ışık yararlanmak için değişiklik gerektirir. Bu çalışmada, kafese kapatılmış bir PKA-UCNP kompleksi teslim mikroenjeksiyon ve aşağıdaki temel spektroskopisi ve mikroskopi değişiklikleri için NIR photoactivation kullanarak bir hücreye ayrıntılı olarak açıklanır.

Protokol

Not: detaylı alt yapısı değiştirilmek üzere upconversion destekli photoactivation protokolünü açıklar, sentetik bir yordam oluşturmak için PKA-UCNP, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) silis kaplı UCNP Kafesli ve PKA-UCNP örnekleri, UV ve Nur photolysis Kur, hücre hazırlık, PKA-UCNP mikroenjeksiyon, photoactivation çalışma ve stres fiber REF52 hücreleri boyama Kafesli.

1. Fluorimeter Kur Upconversion spektrum ölçümü için

1. lazer küvet orta üzerinde odaklanmıştır Floresans Spektrometre küvet sahibinin yanında 4 X objektif lens yükleyin.
2. Yer tunable 0,5 - 8 W 980 nm lazer diyot karşı objektif lens 90°.
   Dikkat: Operatör lazer Emanet bilgiye sahip ve NIR lazer gözlük giymek gerekiyor.
3. Tam Yansıma ayna objektif lens ve lazer ışık yolu kavşak yükleyin. Bir siyah anodize metal plaka spektroskopisi uyarma pencerenin engellemek için ve iç parçaları korumak için yerleştirin.
4. Bir parlak upconversion ışın görüntülenmeyecektir ve ayna yükleme için en iyi ışık hizalamayı ayarlamak için kullanılabilecek şekilde yer silis kaplı UCNP çözüm (0.2 - 0.6 mg/mL) küvet küvet tutucu içinde.
5. Düşük Devresel_ödeme voltaj ayar moduyla ışıldama spektroskopisi geçin (sinyal çok zayıf ise bir daha yüksek ayarı ayarlayın). Aynaya burada ışın küvet orta ve Devresel ödeme en güçlü sinyali alır en iyi hizalama ayarlamak.
6. İstenen güç ayarı ile uyum sonra upconversion spektrum ölçmek. Bir termal kazık güç ölçüm kalibrasyon eğrisi üzerinde lazer güç kaynağı elektrik geçerli okumaya karşı lazer güç oluşturmak için kullanın. Sürekli lazer performans performans kalibre edilmiş Aralık içinde olduğundan emin olmak için kontrol edin.

2. Mikroskop kurulum

Not: aşağıdaki Kurulum mikroskoplar iki katmanlı optik yol ile donatılmış için çalışır. Kullanıcı bir uyarma ışık kaynağı anahtarı NIR lazer ve aynı bağlantı noktasını paylaşan halide lamba yapmak için geri limanda yüklemeye çalışırsa, örnek Isıtma azaltmak için tasarlandığından Kolimatör arka limanda önemli ölçüde NIR engeller. Kullanıcı zor bir seçim yapmak zorundadır: Kolimatör aklında bulunsun ve çok düşük upconversion verimlilik acı veya Kolimatör kaldırmak ve uyarma için epifluorescence ışık yoğunluğunu kurban.

Not: ışık yolunu düzeni değiştirilmiş spectrofluorometer mikroskobu upconversion ışıma ve Nur photolysis modu ve epifluorescence ve UV photolysis modu ve deneysel kurulum için gösteren bir kesit diyagram Bu deneme için kullanılan Şekil 2 ' de gösterilmiştir.

1. Equip Floresans mikroskobu ile metal halide ışık Kılavuzu, arkasına yönetmen limanda
   Not: Bu yoldaki üst katmanlı hafif olduğu yerde bir küp taret, bir küp konum alt katmanı ışık yolu gelen NIR için izin vermek için boş olması gerekir
2. Açık yan-port kolimatör ile sağdaki Port bir akort 8,0 0,5 W 980 nm lazer diyot yükleyin.
   Not: 10 X objektif lens kullanıldığında bu lazer ışık spot için yaklaşık 500 µm çapında büyütür. Bu Kolimatör kaldırma bir mikrometre menzilli hafif yerinde olur ve NIR hücre ışınlama pratik yapar. Bu Kolimatör NIR-saydamdır.
3. Dikroik ayna (850-nm kısa-pass) ve alt katmanı ışık yolunu bir uyarma filtresi (950 nm uzun-pass) yüklemek
4. Bir UCNP çözüm Nur ışık spot görselleştirmek için kullanın. Lazer NIR hizalama bitirmek için görüş alanı içinde ışık demeti ortalamak için konumunu ayarlamak.

3. Hazırlanması ve karakterizasyonu, Kafesli PKA-UCNP inşa

1. Incubate rekombinant PKA (9 µM) ile 0,5 mM 2-1-2 h 25 için arabellek (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl ve 10 mM MgCl ₂; pH 8,5) caging içinde nitrobenzylbromide (NBB) ° C. yavaşlaması 10 mM dthiothreitol (DTT) ile aşırı NBB ve sonra karşı 4-(2-hydroxyethyl) diyaliz piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) arabellek (10 mM, pH 7.5) aşırı reaktifler ve tuzları kaldırmak için.
   Not: Caging çözüm pH 8.5 için 7,5 HEPES pH 7.5 için sonraki immobilizasyon tepki ile diyaliz sırasında indirilir.
2. Mix lanthanide tuzları-Y(CH₃CO₂) ₃ hidrat (% 99.9, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH ₃ CO ₂) ₃ hidrat (% 99.9, 0.2533 g, 0.60 mmol) ve Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ hidrat (% 99.9, 0.0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) ve oleik asit (12 mL), 115 ° C 30 dk için karışım ısı ve onları 50 ° c için serin Daha sonra methanolic bir çözüm (20 mL) 0.2 g (5.0 mmol) tepki karışımı NaOH Pelet dağıtılması ve 0.2964 g (8 mmol) sonication 15 dakika süreyle tarafından amonyum florür artırmak reaksiyon ısısı UCNP çekirdeği (β-NaYF ₄ almak için 300 ° c : %1.0 Tm ^{3 +} / %30 Yb ^{3 +}) nano tanecikleri.
3. Çekirdek nano tanecikleri (25 mg) CO-520 (0.5 mL) ile Siklokekzan (10 mL) içinde çözülür. Amonyak (wt % 30 v/v, 0,08 mL) ve tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) ekleyin ve oda sıcaklığında silis kaplı β-NaYF ₄ 12 h için sürekli karıştırmaya uygulayın: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} çekirdek nano tanecikleri.
4. PKA kuluçkaya (6 nmol) veya PKA Kafesli (6 nmol) ile UCNP (1 mg) ¹⁵ PKA Elektrostatik etkileşimler yoluyla UCNP silika kaplı üzerinde hareketsiz 3 h için 4 ° C'de HEPES tampon (10 mM, pH 7.5).
5. PVDF filtre (0,45 µm), 4 ° C'de 10 dakika için 17.000 x g, santrifüj kullanarak karışımı filtre ve Pelet HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) kapsayan %0,1 protein sabitleyici arıtılmış PKA-UCNP kompleksi elde etmek için yapılan redisperse. Santrifüj kapasitesi 17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika ve süpernatant 1.5 mL tüp içinde Bradford tahlil için toplamak.
6. Analiz UCNP parçacıklar PKA ikame düzeyde geri hesaplamak için sınırsız PKA adım 3.5 Bradford tahlil ile kaydedilen süpernatant içinde hangi normalde sahip bir ikame düzeyde ~ PKA 4,5 nmol parçacık mg başına.
   Not: Bradford tahlil granül, yüksek düzey ve istikrarlı protein immobilizasyon desorpsiyon olmadan öneriyor bir güçlü mavi renk ortaya çıkarır, süpernatant kısmını Kafesli iken PKA-UCNP çözüm bir renk benzer HEPES tampon () gösterir şekil 4 c-4e).

4. Karakterizasyonu

Not: kinaz tahlil pyruvate kinaz belirli etkinliğini ölçmek için kullanılır. Kısacası, pyruvate kinaz ve laktat dehidrogenaz bağlandı, peptid, fosforilasyon NADH oksidasyon içinde sonuçlanır. İkinci oluşumu, NADH Absorbans 340 azalma ölçerek izlenir nm.

1. Belirleme etkinlik PKA ve PKA-UCNP 4-morpholinepropanesulfonic asit (BEZLERİ, 100 mM, pH 7.5), içeren tahlil karışımı 60 µL toplam birimindeki KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenozin trifosfat (ATP, 1 mM), β - Nikotinamid adenin dinükleotit, azaltılmış formu (NADH, 0.8 mM), magnezyum klorür (MgCl ₂, 1 mM), kemptide (0.4 mM) ve pyruvate kinaz/laktat dehidrogenaz karışımı (30/40 birim PK/karaciğer).
2. NADH Absorbans PKA çözüm (2 µL) tahlil karışıma ilavesi sonra zamanla azalma ölçmek. Doğrudan ölçülen kinaz etkinliği yansıtmak üzere çizgisinin eğimini hesaplayın.
3. PKA-UCNP ¹⁵ aktivite ve yerel PKA özel etkinlik ve hesaplanan PKA tutar kaplı yüzey çarpma ürün ile de uyumlu olması genel faaliyet ölçmek.

5. Photolysis kurulum

1. banaışığın tüm gücü termal kazık sensör kullanarak kaynakları ve güç yoğunluğunu hesaplamak ure (PD = güç (W) / alan (cm ²)) ¹⁸ dayalı ışık spot alan üzerine.
2. Bir 365 nm LED (200 mW/cm ²) ¹⁵ ile ticari bir sistemde vitro UV photolysis deneyler yapmak.
3. İçin UV photoactivation mikroskop sahnede aydınlatmak uyarma hafif ticari küp ¹⁵ tarafından filtre ile PKA-UCNP çözüm.
   Not: Güç yoğunluğu objektif lens odak olmadan ~ 15 mW/cm ² ' dir.
4. Mikroskop sahnede vitro NIR photoactivation için özelleştirilmiş upconversion filtre/ayna ayarları alt katmanı ışık yolu üzerinde dikroik ayna (850 nm kısa-pass), yüklü ile 980 nm lazer kullanarak PKA-UCNP çözüm aydınlatmak ve bir uyarma filtresi (950 nm uzun-pass).
   Not: 4 X objektif lens odaklanan önce 5 W/cm ² çıkış güç yoğunluğu azalır. Güç yoğunluğu olduğu tahmin edilmektedir ~ 68 W/cm ² 4 X objektif lens odak sonra.

6. Numune hazırlama ve mikroenjeksiyon PKA-UCNP kompleksi hücre

1. örnekler 0,45 µm filtreden PKA immobilizasyon (Adım 3.5) sonra ön filtre.
2. Kuluçkaya L-15 Orta kuluçka makinesi dışında istikrarlı pH denetimi için mikroenjeksiyon döneminde bulunduğu hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS).
   Not: mikroenjeksiyon tamamlama onaylamak için yerel PKA-UCNP, Kafesli PKA-UCNP veya pegile UCNP (7,5 mg/mL) ¹⁵ 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine ile (TAMRA) Co enjekte (10 µM) içinde hücrelere.
Mikroenjeksiyon sonra sitozolik konsantrasyonu 1-3 mikron PKA - fizyolojik konsantrasyon aralığı PKA enjeksiyon Cilt 1/10 hücresel birimin varsayım ile bir hücre için öyle ki, konsantrasyon PKA-UCNP parçacıkların
3. ayarlamak .
4. (Adım 6.2) hücreye mikroenjeksiyon gerçekleştirmek bir microinjector aygıtı kullanarak tek eksenli hidrolik micromanipulator ( şekil 3) ile birleştiğinde.
5. Kullanmak microinjector tarafından uygulanan basınç izlemek için dijital bir basınç göstergesi çalışma aralığı (~ 50-200 inç) ve mikroenjeksiyon için tazminat basınç sağlamak için özelleştirilmiş bir baskı odası dağıtıcı valf mühür. Geri bir çektirmenin kullanarak İğneyi çek.
6. 200-300 ms ve kültür orta geri tepme iğne kılcal eylem tarafından önlemek için 15 inç tazminat basınçta bir enjeksiyon süresi ile 50 ila 75 hPa arasında enjeksiyon basıncı korumak.
7. Bir dış çapı 40 x objektif lens ile fotoğraf çekmek tarafından onaylanabilir 1,3 ve 1,5 µm arasında olması için iğne ucu açıklıklar inceleyin.
8. Yıkama 2 mL % 10 içeren L-15 Orta hücrelerle FBS mikroenjeksiyon sonra. Hücresel Floresans görüntüleme mikroenjeksiyon tamamlama onaylamak için 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamine (TAMRA) üzerinden gözlemlemek.

7. Photoactivation, Kafesli PKA-UCNP kullanarak UV veya Nur ışık yaşayan hücrelerde

1. için UV photoactivation PKA-UCNP mikroenjeksiyon sonra 3,5 µm çanak üzerinde REF52 hücrelerin büyümesine, onları mikroskop sahnesinde yerini ve onlara göre filtre UV ışığıyla ışınlatayım küp için objektif lens odak olmadan 3 dak.
   Not: confluency 2-3 günde 90 %'e ulaştığımızda hücrelerin % 10 içeren DMEM muhafaza REF52 FBS %5 CO ₂ kuluçka ve hücreleri 37 ° C'de subcultured.
2. İçin NIR photoactivation PKA-UCNP mikroenjeksiyon sonra aydınlatmak 980 nm lazer alt katmanı filtre/ayna ayarlardan hücrelerdeyse 5,4 adımda anlatıldığı gibi.
   Not: Güç yoğunluğu çıkışı 10 X objektif lens odak 5 W/cm ² öncedir ve 10 x objektif lens odak sonra 300 W/cm ² olduğu tahmin edilmektedir. Upconversion yüksek foton yoğunluğu, özellikle büyük bir anti-Stoke kayma gerektiğinde gerektiren bir süreçtir. Bu nedenle, odaklanan photoactivation sırasında gereklidir.
Daha büyük bir ışık yer (650 µm x 520 µm) gerektiğinde,
3. Nur ile 15 dk. izin ver bir kolimatör ile 10 x objektif lens tarafından her 5 dk ışınlama sonra 5 dk karanlık aralığı için odaklı Isıtma önlemek için bu hücreleri ışınlatayım.
   Not: bir yüksek uzaysal çözünürlüklü (hücre altı ışık spot) gerektiğinde, 40 X objektif lens ışık Kılavuzu çıkış sonunda yüklü bir iğne deliği ile bir hücre altı boyut ışık yer (5 µm x 4 µm) oluşturmak için kullanın. Bu durumda, 1 s radyoterapi NIR photoactivation fotonlar yüksek akı nedeniyle yeter.
4. Sonra UV veya Nur photolysis, hücreleri 37 ° C'de kuluçka %5 CO ₂ hücresel yanıt-e doğru oluşturmak için tam orta 1 h için yeniden elde etmek için izin verir. Daha sonra 1 ml % 4 paraformaldehyde/fosfat-tamponlu tuz (PBS) 20 dk için daha fazla boyama önce düzeltmek.
   Dikkat: Paraformaldehyde çok zehirli olduğunu; Cilt, göz veya müköz membranlarda temasından kaçının. Ölçme ve hazırlık sırasında toz nefes kaçının.

8. Görselleştirme stres Fiber dağılmasına neden NIR Photoactivation yanında

1. sonra fiksasyon, Alexa 594-phalloidin kullanın (boyama için PBS 200 µL için 5 µL 6.6 µM hisse senedi çözüm Ekle; oda sıcaklığında 25 min için kuluçkaya) leke ve stres lifleri görselleştirin. Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) görüntülerini bir filtre seti kullanarak görselleştirmek.
2. 4 5 min için hücreleri kuluçkaya ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oda sıcaklığında. Boyama sonra PBS ile örnekleri yıkama ve stres lifleri ve çekirdekleri floresan görüntülerini de ayrı ayrı vurmak.

Sonuçlar

Kafesli enzim-UCNP yapı tasarım şekil 1' de gösterilmiştir. PKA enzim 2-nitrobenzyl bromür ile etkin olmayan bir kafese kapatılmış PKA oluşturmak için ilk tepki gösterdi ve sonra Elektrostatik UCNP yüzeyinde immobilize. UCNPs upconverted ışık yayarlar ve sonuç olarak photolytically o-nitrobenzyl grupları Cys 199 ve Cys 343, aktif PKA üreten ayırmak. TEM görüntüleri ve Bradford tahlil PKA ve Kafesli PKA UCNPs yüzey immobilize ve UV photoactivation sonra Kafesl...

Tartışma

Daha önce Hofmann ve iş arkadaşlarınızla dramatik morfolojik değişiklikler ücretsiz PKA¹⁹mikroenjeksiyon sonra REF52 hücrelerde gözlendi buldum. Başka bir çalışmada, Lawrence grup Kafesli PKA vivo içindeharekete geçirmek, morfolojik değişiklikler ve UV photolysis²⁰' ye tabi ne zaman stres lifleri dağılması olabilir gösterdi. Daha önce upconverted UV ışığı birkaç UCNP destekli, kafes, küçük moleküler bioeffectors^21,

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif< / güçlü >
Tris (hidroksimetil) aminometan	Sigma	154563
Magnezyum klorür hekzahidrat	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodyum klorür ve nbsp;	Sigma	31434
Potasyum klorür	Sigma	12636
İtriyum asetat  hidrat	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 ve orta nokta; xH2O
Tulyum(III) asetat hidrat	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 ve orta nokta; xH < alt > 2 < / alt > O
İterbiyum (III) asetat tetrahidrat	Sigma	326011	Yb (C < alt > 2 < / alt >H < alt >3< / alt > O < alt > 2 < / alt >) 3< / alt > ve orta nokta; 4H < alt > 2 < / alt >O
1-Oktadesen	Sigma	O806
Oleik asit	Sigma	364525
Metanol ve nbsp;	macron	304168
Sodyum hidroksit	Sigma	30620
Amonyum florür	J.T.Baker	69804
IGEPAL  CO-520	Sigma	238643
Sikloheksan	J.T.Baker	920601
Amonyum hidroksit (%28 - %30)	J.T.Baker	972101	Amonyak
Tetraetil ortosilikat (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hidroksimaleimid (NHM)	Sigma	226351	PKA aktivite bloke edici reaktif
Domuz kollajeninden Prionex protein stabilizatör çözeltisi	Sigma	81662	Protein stabilizatör çözeltisi
2-nitrobenzil bromür (NBB)	Sigma	107794	PKA kafes reaktifi
8- (4-Klorofeniltio) adenosin 3 & prime ;, 5 & prime ; -siklik monofosfat sodyum tuzu	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Piruvat Kinaz / Laktik Dehidrojenaz tavşan kasından elde edilen enzimler	Sigma	P0294	PK / LDH
Adenozin 5'-trifosfat disodyum	Sigma	A2387	ATP
ve beta; -NADH dipotasyumdan indirgenmiş	Sigma	N4505
Fosfoenolpiruvat	Sigma	P7127	PEP
Coomassie Protein Test Reaktifi, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford tahlil reaktifi
cAMP'ye bağımlı protein kinaz	Promega	V5161	PKA aktivite kontrolü
pET15b-PKACAT plazmid	Addgene	# 14921
pKaede-MC1 plazmid	CoralHue	-V0012
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, yüksek glikoz, piruvat	Gibco	12800-017	Hücresi kültür ortamı
Leibovitz L-15 Orta	Biyolojik Endüstriler	01-115-1A	Hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu	Biyolojik Endüstriler	04-001-1A
Paraformaldehit	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Çekirdek boyama boyası
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-aktin boyama boyası
5(6)-Karboksitetrametilrodamin &	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Test Kiti	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Borular / Nominal filtre derecesi MWCO 12.000 - 14.000 Da	Membran Filtrasyon Ürünleri, Inc.	1430-33	Diyaliz membranı
Millex-HV Şırınga Filtre Ünitesi, 0.45 & m, PVDF, 13 mm, gama sterilize	EMD Milipore	SLHVX13NL
Ekipman
Dinamik Işık Saçılımı/Zetapotansiyel Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmisyon Elektron Mikroskobu	JEOL	JEM-1400
Floresan Spektrofotometre	Agilent Technologies	10075200	Cary Tutulması
UV-Vis Spektrofotometre	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Floresan Mikroskobu	Olympus	IX-71
950 nm uzun geçiren filtre	Thorlabs	FEL0950
850 nm dikroik ayna kısa geçişli	Chroma	NC265609
RT3 renkli CCD sistemi	SPOT	RT2520
Floresan Aydınlatma	ÖNCEKİ	Lümen 200
980 nm Kızılötesi diyot lazer	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Spot Işık Kaynağı	UVATA	UVATA-UPS412	200 mW/cm'de UPH-056-365 nm LED ile2
Termal kazık sensörü	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Hücre İçi Mikroenjeksiyon Dağıtım Sistemleri
PC-10 İğne çektirme	Narishige	PC-10
MANOMETRE Dijital basınç göstergesi	Lutron	PM-9100
Tek eksenli Yağ Hidrolik Mikromanipülatör	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Santrifüj, Soğutmalı	Termo Bilimsel	75002421