Yöntem makalesi

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

DOI:

10.3791/55781

⸱

22 Haziran 2017

 ,  ,  , 
1Inserm U 1227, CNRS UMR 7225, 2Sorbonne Universités, UPMC, University of Paris, 3Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 4AP-HP, Hôpital de la Pitié Salpêtrière;

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok çalışma, merkezi sinir sistemi (CNS) patolojilerinde bağışıklık hücrelerinin, özellikle makrofajların rolünü göstermiştir. CNS'de iki ana makrofaj popülasyonu vardır: (i) MSS'nin yerleşik makrofajları olan ve embriyogenez sırasında sarı kese öncülerinden türetilen mikroglia ve (ii) sızıntı yapabilen monosit türevi makrofajlar (MDM) Hastalık sırasında MSS'dir ve kemik iliği progenitörlerinden türemiştir. Her makrofaj alt popülasyonunun rolü, incelenen patolojiye göre değişir. Dahası, histolojik belirteçler veya bu makrofaj alt popülasyonları için kullanılan ayırt edici kriterler üzerinde fikir birliği bulunmamaktadır. Bununla birlikte, akış sitometrisi ile CD11b ve CD45 markörlerinin ekspresyon profillerinin analizi, mikrogliayı (CD11b + CD45 med ) MDM'den (CD11b + CD45 yüksek ) ayırmamızı sağlar. Bu protokolde, yoğunluk gradyanı santrifüjününVe akış sitometri analizi bu CNS makrofaj alt popülasyonlarını karakterize etmek için ve yakınlarda yayınladığımız gibi bu hücreler tarafından ifade edilen birkaç ilgi işaretçisini incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle bu teknik, nörolojik hastalıkların fare modellerinde makrofajların rolünü daha iyi anlayabilir ve ayrıca bu hücreler üzerindeki ilaç etkilerini değerlendirmek için de kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrogram, merkezi sinir sisteminin (MSS) parenkimal dokuya ait makrofajlarıdır. İki önemli fonksiyonel rol oynuyorlar: Bağışıklık savunması ve SSS homeostazisinin korunması. Kemik iliğindeki hematopoietik kök hücrelerden sürekli olarak yenilenen MDM'den farklı olarak, mikroglial hücreler embriyonik gelişme sırasında beyinde koloni oluşturan yolk kesesinden (YS) kaynaklanan ilkel hematopoietik progenitör hücrelerden ayırırlar 1 , 2 , 3 . Kemirgenlerde, transkripsiyon faktörü Myb, tüm kemik iliği kaynaklı monositlerin ve makrofajların gelişiminde çok önemli bir rol oynamaktadır, ancak YS türevi mikroglia için bu faktör gerekli değildir ve farklılaşma, transkripsiyon faktörü PU.14'e bağımlıdır.

Sağlıklı CNS'de, mikroglia, çevrede sürekli olarak örnek olan dinamik hücrelerdir, scaPatojenleri veya doku hasarını işlemek için nning ve survey 5 . Bu tür sinyaller algılanması, yaralanmanın çözüm yolunu başlatır. Mikroglia, hızlıca ayrılmış bir morfolojiden amoeboid bir fogositoza ve ardından pro-veya anti-inflamatuar sitokinler gibi çeşitli mediatörlerin salınmasını izler. Böylece, mikro çevreye bağlı olarak aktive edilmiş mikroglia farklı priming durumlarından 6 oluşan bir spektrum kazanabilir.

Mikroglia, birçok nörolojik rahatsızlığın gelişimini ve ilerlemesini derinden etkilemektedir. Alzheimer hastalığının (AD) 7 , Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 8 , Multipl Skleroz (MS) 9 veya Parkinson hastalığının (PD) 10 kemirgen modellerinde mikroglia'nın zararlı nörotoksisite indükleyen ya da etki eden iki rol oynadığı gösterilmiştir Nöroprotektif bir tarzda, bağımlı olanSpesifik hastalık, hastalık evresi ve hastalığın sistemik bağışıklık bölmesinden 7 , 8 , 9 , 10 , 11 etkilenip etkilenmediği. Yukarıda belirtilen hastalıklarda gözlenen CNS lezyonlarının çoğunda sadece parankimal mikrogram değil aynı zamanda perivasküler ve meningeal makrofajların yanı sıra CNS-sızıntılı MDM de dahil olmak üzere heterojen bir myeloid hücre popülasyonu bulunur. Bu hücre tipleri, yaralanma ve onarım ile ilişkili patofizyolojik mekanizmalara farklı şekilde katkıda bulunabilir 7,12,13,14,15. Bu hastalık modellerini inceleyen araştırmacılar için mevcut zorluk, periferik monositlerin ve makrofajların MSS'ye sızdığını ve eğer öyleyse distBu hücrelerden ikamet eden mikrogliaları kucaklayın. Aslında mikroglial hücreler çok plastiktir; Aktive edildiğinde, mikrogram genellikle periferik monositler ve makrofajlar tarafından eksprese edilen belirteçleri yeniden ifade eder. Bu nedenle, konu, yerleşik mikroglianın sızma monositleri ve makrofajları ayırt edebilen belirteçlerin belirlenmesine dayanır.

Bu popülasyonların beyin dilimleri üzerindeki immünohistolojik uygulamaları ile ayrımcılık spesifik antikorların olmaması nedeniyle sınırlıdır. Bununla birlikte, akış sitometrisi analizi, çeşitli belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirmek ve hücre popülasyonlarını (örneğin, lenfositler, makrofajlar / MDM CD11b + CD45 yüksekleri ve mikroglia CD11b + CD45 med ) ayırmak için etkili bir teknik yanı sıra hücre alt popülasyonları 16 , 17 , 18 . Bu protokol,Optimize edilmiş, enzimatik bir doku ayrışması ve bir yoğunluk gradiyentli santrifüjleme kullanarak nörolojik hastalık modellerinde fare CNS'den alınan mononükleer hücreler; Hem de flow sitometri kullanarak CNS'de mikroglia ve MDM popülasyonlarını ayırt etmek için bir yöntem.

Bir diğer yaklaşım, miyelin'i yok etmek ve spesifik antikorlara 19 , 20 , 21 konjuge edilmiş manyetik boncuklar kullanarak hücreleri saflaştırmaktır. Anti-miyelin manyetik boncuklar kullanan miyelin giderimi daha pahalıdır ve canlılığı ve izole edilmiş hücrelerin verimi 22'yi etkiler. Bu adım ve mikroglianın izleyen immünomanyetik ayrımı, spesifik bağışıklık hücre popülasyonları 21 , 22 için ileri araştırmaları sınırlandırır.

Bu prosedürler, hastalık gelişiminde makrofaj alt popülasyonlarının incelenmesi için kolay bir yol sağlar veMakrofaj fenotipleri ve aktivasyon durumlarındaki ilaç etkilerini veya gen modifikasyonlarını belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemler, ICM Enstitüsünde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından ve Darwin Fransız Etik Hayvan Komitesi tarafından onaylanmıştır ve 01407.02 protokolüyle kapsanmıştır.

1. Hazırlık

  1. Sindirim kokteylini her fare için aşağıdakileri birleştirerek 1.5 mL'lik bir tüp içerisinde hazırlayın: 1 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS); 13 wunsch / mL'de (stok çözeltisi) 123 uL sindirim enzimi (materyal tablosuna bakınız), son konsantrasyon: 1.6 w / sn; Ve 100 mg / mL'de (stok çözeltisi) 5 uL DNaz I (bakınız tablo), nihai konsantrasyon 0.5 mg / mL.

2. Perfüzyon ve Diseksiyon

  1. Fareleri ölümcül bir pentobarbital dozu (400 mg / mL'de 100 μL) ile euthanize edin.
  2. Hayvanı yatırın ve vücudu% 70 etanol ile ıslatın.
  3. Göğüs boşluğunu açığa çıkarmak için ventral cildi, xyphoid prosesin hemen altındaki ince makaslarla kesin.y.
  4. Diyaframa bir kesi yapın ve kalbi ortaya çıkarmak için (ve diğer organları kesmekten kaçınmak için) rostral yönde kaudal bir şekilde ince makasla göğüs kafesinin yanal yönlerini kesin. Sol ventrikül (LV) ve sağ atriyumun (RA) tanımlanması.
  5. LV'nin içine 25 G iğne ile bir kelebek kateteri takın. İnce makaslarla RA'ya bir kesi yapın ve kan akışının başlangıcında, damarlardan hücreleri ve kanları çıkarmak için 20 mL PBS ile LV boyunca 10 mL / dakika akış oranında perfüzyona başlayın; Başarılı bir perfüzyon akciğerlerin ve karaciğerin kanlanması nedeniyle göğüs gerilmesi ile belirtilir.
  6. Hayvanı orta makasla dekapatlayın. Omurga sütununu ince makaslarla parçalara ayırın ve omuriliğin ventral tarafındaki karın duvar kaslarını çıkararak ve kuyruk tabanındaki vertebral kolonu keserek vücudundan ayırın.
  7. PBS içeren bir 10 mL'lik şırınga yerleştirin ve bel desteğine 200 ml'lik bir pipet yerleştirin.Omurga kolu ve omurili servikal taraftan boşaltın.
    NOT: 200 mcL pipet ucu en geniş ucunda (yaklaşık 1 cm) makasla kesilir ve daha önce PBS ile dolu 10 mL şırıngaya sıkıca yerleştirilir.
  8. Kafatasının üstündeki cildi çıkarın ve beyni ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Kafatasının tabanına bir makas bıçağı takın ve sagital sütürü takiben kafatayı kesin. Kesime küçük forseps yerleştirin ve kafatasını hafifçe kaldırın. Fare kafasından beyni ayırın ve koku ampulünü ve serebellumu çıkarın.
  9. Sindirim kokteyli (1. adımdan itibaren) 1.128 mL PBS içeren 1.5 mL'lik bir tüp içerisinde beyin ve omurilik toplayın.

3. Hücre Ayrışımı

  1. Küçük makasla 1-2 mm 3 parçaya ( Şekil 1. ) 1,5 mL tüpün (adım 2.9) beyin ve omurili ince şekilde kesin.
  2. Öğütülmüş dokuları içeren 1.5 mL tübü bir incuba'da 30 dakika inkübe edin37 ° C'de% 5 CO 2 ile yıkayın.
    NOT: Bu adımda yoğunluk derecesini hazırlayın.
  3. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 20 ml 0.5 M EDTA (stok solüsyonu), nihai konsantrasyon 10 mM, 1.5 mL tüp ekleyin.
  4. 5 mL pipetle aşağı yukarı pipetle hafifçe hücre süspansiyonu yapın.
  5. 10 mL şırınganın pistonu kullanarak 50 mL'lik bir tüpteki hücre süspansiyonunu bir naylon ağ (70 um gözenek boyutu) üzerinden geçirin.
  6. Naylon örgüyü 20 mL% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS) -PBS ile yıkayın.
  7. Oda sıcaklığında (18 ° C) 7 dakika boyunca (300 xg) santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyon ile atın ve sonraki adıma geçin. Süpernatantı çıkartırken son derece dikkatli olun; Pelet rahatsız etmeyin, pellet, aspirasyon pipetiyle kolaylıkla aspire edilebilir.

4. Yoğunluk Dereceli

  1. Yoğunluk gradyan ortamına uygun miktarda 10x PBS ekleyerek yoğunluk gradyanı ortam stok solüsyonu hazırlayın.
    NOT: Dokuz parçalı yoğunluk gradyanı ortamına bir parça 10X PBS ekleyin.
  2. Stok yoğunluğu gradyan ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi farklı yüzdeler için 1x PBS ile seyreltin.
  3. 4 mL% 30 yoğunluk gradyan ortamı ile pelletini (adım 3.7'den) tekrar süspansiyon haline getirin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. 15 mL'lik tüpün altına bir Pasteur pipeti yerleştirin ve yavaşça% 37'lik yoğunluk derecesi ortamının 4 mL'sini altına yerleştirin.
  5. Yukarıda tarif edildiği gibi 4 mL% 70 yoğunluk dereceli ortam ekleyin.
  6. Degrade oda sıcaklığında (18 ° C) 40 dakika boyunca (800 xg) santrifüjleyin. Santrifüjün az veya hiç frenle durduğundan emin olun, böylece ara faz rahatsız edilmez.
    NOT: Boru katmanlı görünecektir. % 70 -% 37 yoğunluk gradyan arayüzünde tabakalanmış hücreler, mononükleize edilen immün hücrelerdir (mikroglia ve makrofaj alt popülasyonları); Üst düzeyler sırasıyla hücre döküntüsü ve miyelindir ( Şekil 2 ).
  7. Bir transfer pipeti kullanarak hafifçe miyelin tabakasını çıkarın.
  8. Temiz bir 15 mL tüp içine makrofaj alt popülasyon hücreleri içeren 3-4 mL% 70-37 yoğunluk gradiyent ara fazı toplayın.
  9. PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın, toplam hacmi 15 mL. Hücrelerin bulunduğu yoğunluk gradyan ortamının PBS ile en az üç kez seyreltildiğinden ve fren "açık" konumdayken 7 dakika (500 xg, 4 ° C) santrifüje tabi tutulduğundan emin olun.
  10. Hücre etiketleme veya diğer fonksiyonel testler için hücre pelletini 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin.

5. Akış Sitometrisi için Hücre Etiketleme

  1. Hücreleri (adım 4.10) bir akış sitometri tüpüne aktarın.
  2. Adım 4.10'da elde edilen her bir hücre örneğine 1 μL sabitlenebilir ölü hücre lekesi reaktifi ekleyin. Işıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri bir kez 2 mL PBS ve 5 dakika boyunca santrifüjle yıkayın (300 xg, 4 ° C).
  4. Süpernatıtıyı çıkarın ve hücre peletini400 uL PBS% 1 BSA,% 0.1 azid.
  5. Fc reseptörlerini bloke etmek için 100 uL hücreye 1 μg CD16 / CD32 antikoru ekleyin. Buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin, ışığa karşı korunun.
  6. İntraselüler boyama için hücre permeabilization için birincil antikor karışımı PBS% 1 BSA,% 0.1 azid veya PBS% 1 BSA,% 0.1 azid,% 0.25 saponin hazırlayın.
  7. Birincil antikor karışımı (2x) 100 uL ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun.
    NOT: Optimum sonuçların elde edilmesi için deney yapılmadan önce tüm antikorlar titrasyona tabi tutulmalıdır.
  8. 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 5 dakika boyunca santrifüjleyin (300 xg, 4 ° C). Bu adımı üç kez tekrarlayın.
  9. Birincil antikorlar doğrudan bir floroforla konjuge edilmediyse 100 uL ikincil bir antikor ekleyin ve ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  10. 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ° C'de 300 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
  11. Tamir etOda sıcaklığında 15 dakika oda sıcaklığında 100 μL% 1 PFA ile yıkanır.
    NOT: Dikkat: PFA toksiktir. Duman kabininde kullanın ve kişisel koruyucu ekipman giyin.
  12. 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ° C'de 300 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
  13. 200 uL PBS ile hücre topağı tekrar süspansiyon ve akış sitometri edinimi ve analizi devam edin. Şekil 3'deki geçiş stratejisini izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve antikor boyama işleminden sonra hücreler bir akış sitometresinde tutuldu ve aşağıdaki gibi bir morfolojik geçiş stratejisi kullanılarak analiz edildi. Tek hücrelerin çiftleşmelerden ayırt edilmesi için, İleri-Dağılmış-Alan (FSC-A) ve İleri-Dağılmış Yükseklik (FSC-H) karşılaştırması için bir ilk kapı tanımlanmıştır ( Şekil 3A ). Tek hücreler daha sonra göreceli hücre büyüklüğü ve hücre parçacıklığına (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia ve MDM'nin MSS'de farklı işlevlere ve fenotiplere sahip oldukları gösterildi ve bu nedenle bu makrofaj alt popülasyonlarının tanımlanması ve analizi, nörolojik hastalıkları daha iyi anlamak için gereklidir 9 , 18 , 25 . İki belirteç (CD11b ve CD45) kullanılarak yapılan akış sitometrisi analizi, her alt popülasyon arasındaki ayrımı mümkün kılar ( Şekil 3C ). Bu strateji daha önce M...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecekleri bir şeyleri yok

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer ve Bpifrance'in hibeleriyle desteklendi. Laboratuarımızda ayrıca Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie ve "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) programı desteklenmektedir. CELIS hücre kültürü çekirdeğinin desteğine teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5 aylık FarelerJanvierC57BL / 6J
Liberaz TL Araştırma SınıfıSigma-Aldrich5401020001
Sığır pankreasından sindirim enzimi Deoksiribonükleaz ISigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Yaşam Bilimleri17-0891-01Yoğunluk gradyan orta
Hücre Süzgeci boyutu 70 ve mikro; m NaylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Pistonlu şırınga 10 mLTerumoSS+10ES1
Pasteur pipeti 230 mmDustcher20420
1,5 mL tüpEppendorf0030 123.328
15 mL tüpTPP91015
50 mL tüpTPP91050
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı boruBD Falcon352054
D-PBS (1x) Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Fetal sığır serumuThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Sığır Serumu Albümin çözeltisi %30Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehit %32 ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri15714-SDikkat -Toksik
SaponinSigma-AldrichS2002
Sodyum AzidSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Sıçan anti-fare CD11b (klon M1 / 70)eBioscience45-0112
Sıçan IgG2b K İzotip Kontrolü PerCP-Siyanin5.5eBioscience45-4031
BV421 Sıçan anti-fare CD45 (klon 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Sıçan IgG2b, κ İzotip Kontrolü RUOBD Biosciences562603
Tavşan anti-fare TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Eşek anti-tavşan IgGYaşam TeknolojileriA31573
Anti-Fare CD16 / CD32 SaflaştırılmışeBioscience14-0161Fare Fc
Blok Sabitlenebilir Ölü Hücre Leke KitleriInvitrogenL34969
Fare CCR2 APC konjuge AntikorR& DFAB5538A
Sıçan IgG2B APC-konjuge İzotip KontrolüR& DIC013A
Fare CX3CR1 PE konjuge AntikorR& DFAB5825P
Keçi IgG PE konjuge AntikorR& DIC108P
SantrifüjEppendorf5804R
Hücre analizörüBD BiosciencesBD FACSVERSE
Veri Analiz YazılımıFlowJo LLCFlowJo
İnce makasFST14090-11
Standart Model ForsepsFST11000-13
Mayo MakasFST14010-15
Dumont #5 ForsepsFST11251-20

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  3. Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
  4. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  5. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).
  6. Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
  7. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  8. Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  9. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  10. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
  11. Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
  14. Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
  15. Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
  16. Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
  17. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  18. Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
  19. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  20. Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
  21. Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
  22. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  24. Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
  25. Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
  26. Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroglia MakrofajlarMSS MakrofajlarYo unluk Gradyan Santrif jlemeCD11b CD45 Mark rleriH cre zolasyonuAk Sitometrisi AnaliziMSS mm n H creleriMark r Ekspresyonu

İlgili makaleler