Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Nörodejeneratif hastalıklar genellikle etkilenenler üzerinde yıkıcı bir etkiye sahiptir. Retinal gangliyon hücresi (RGC) kaybı, normal yaşlanmaya ek olarak diyabetik retinopati ve glokom da dahil olmak üzere bir dizi hastalıkta rol oynar. RGC'lerin önemine rağmen, bugüne kadar, retina içindeki çok çeşitli hücrelerin yalnızca küçük bir yüzdesini oluşturmaları nedeniyle kısmen çalışmak son derece zor olmuştur. Buna ek olarak, mevcut izolasyon yöntemleri canlı olmayan hücreler üreten RGC'leri belirlemek için hücre içi işaretleyicileri kullanır. Bu teknikler aynı zamanda uzun izolasyon protokollerini de içerdiğinden, RGC'leri elde etmek ve izole etmek için pratik, standartlaştırılmış ve güvenilir yöntemlerin eksikliği vardır. Bu çalışma, hem pozitif hem de negatif seçim kriterlerine dayanan bir protokol kullanarak, farelerin retinasından birincil RGC'lerin izole edilmesi için etkili, kapsamlı ve güvenilir bir yöntem açıklamaktadır. Sunulan yöntemler, RGC'lerin ilerideki çalışmalarına olanak tanır;Nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel RGC kaybından kaynaklanan görme keskinliğinde azalma.
Giriş
RGC'ler terminal olarak diferansiye edilmiş nöronlardır ve bu nedenle deney için birincil hücreler gerekir. Birincil sıçangil retinal gangliyon hücrelerinin (RGC'lerin) izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol geliştirilmesi, RGC'nin sağlık ve dejenerasyon mekanizmalarını in vitro ortaya koymak için temel teşkil etmektedir. Bu, RGC işlevini desteklemek ve ölümlerini en aza indirmek için potansiyel terapiler üretmek isteyen araştırmalar için özellikle önemlidir. RGC'lerin dejenerasyonu, glokom, diyabetik retinopati ve normal yaşlanma gibi retinal dejeneratif hastalıklarla ilişkilidir. RGC kaybına neden olan spesifik hücresel mekanizm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokolde detaylandırılan bütün prosedürler, Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSC) Üniversitesinde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) gözden geçirme kurulu tarafından onaylanmış ve Kullanım İçin Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) Beyannamesini takip etmiştir (Laboratuar Hayvanları Enstitüsü Enstitüsü, Hayvan Bakımı ve Laboratuar Hayvanları Kullanımına Yönelik Kamu Sağlığı Hizmet Politikası) ek olarak, oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanlar Üzerine Etkileri.
1. Araçların, Çözümlerin ve Medyanın Hazırlanması
Not: Protokolde rapor edilen malzemele....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
RGC'lerin derinlemesine incelenmesi, düşük frekansları ve izolasyonları için sağlam ve standartlaştırılmış bir metodolojinin olmaması da dahil olmak üzere birçok faktör tarafından engellenmektedir. Şekil 1 , retina izolasyonu için kullanılan metodolojiyi göstermektedir. Enükleasyon prosedüründeki değişiklikler, enükleasyon in vivo deneyin bir parçası olup olmadığı gibi analiz türüne dayanır 27 . Bu protokoldeki enük.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
FACS, hücre popülasyonlarını saflaştırmak için tercih edilen bir tekniktir. Diğer izolasyon yöntemleri arasında bağışıklık kazandırma, manyetik boncuklar ve kompleman sabitleme tükenmesi bulunur. FACS'nin bu diğer metodolojilere göre avantajı, değişik derecelerde yoğunluk gösteren hücre yüzeyi markörlerinin eşzamanlı tanımlanmasına dayanır. Molekülün flüoresan yoğunluğu protein ifade miktarı ile orantılıdır. Şimdiye dek, RGC'lerin izolasyonu kullanılan izolasyon yöntemine bakılmaksızın sadece Thy1 (CD90) pozitif.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Teşekkürler
Yazarlar teknik video yardımı için Mikrobiyoloji, İmmünoloji ve Biyokimya Bölümü'nden Kıdemli Illustrator Sayın Tim Higgins'e teşekkür etmek istiyorlar; Matthew W. Wilson'la tartışmalar ve Jablonski ve Morales-Tirado laboratuvarlarının üyeleri, yararlı yorumları için teşekkür eder. Bu çalışma, Alcon Araştırma Enstitüsü Genç Araştırmacı Ödülü (VMM-T), Tennessee Araştırma Vakfı (VMM-T) Üniversitesi, Ulusal Göz Enstitüsü EY021200 (MMJ), Gerwin Kardeşliği (VMM-T) tarafından desteklendi; Gerwin Ön Doktora Arkadaş Grubu (ZKG), Savunma Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (VMM-T) ve Körlüğü Önleme Araştırması'ndan Sınırsız Hibe.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-fare CD15 PE | BioLegend | 125606 | Klon MC-480 |
| Anti-fare CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Klon HM48-1 |
| Anti-fare CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Klon VC1.1 |
| Anti-fare CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Klon 30-H12 |
| Parlak Menekşe 421 Keçi Anti-fare IgG BioLegend | 405317 | Klon Poly4053 | |
| Saflaştırılmış Anti-fare CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III bloğu, Klon 93 |
| Zombi Aqua | BioLegend | 423102 | Canlı hücre / Ölü hücre ayrımı |
| Fetal Sığır Serumu | Hyclone | SH30071.03 | ABD menşeli |
| AbC Toplam Antikor Kompanzasyon Boncuk Kiti | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Çok tür Ig |
| Nörobazal Orta | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Kültürden önce ortama serum ekleyin. |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Tuzlu su çözeltisi |
| Diseksiyon Mikroskobu | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Mikroskop |
| Sorvall Santrifüj | Thermo Scientific | ST 16R | RT Taban Plakasında gerçekleştirilen tüm santrifüjler |
| ndash; Diseksiyon | Tavası Fisher Scientific | SB15233FIM | Bir balmumu plakası da kullanılabilir |
| Forseps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inç |
| İris Makas, Düz | Aesculap | 1360 | 5 ½ inç |
| Falcon 15 mL konik tüpler | Fisher Scientific | 352097 | Polipropilen tüpler |
| Falcon 50 mL konik tüpler | Fisher Scientific | 352098 | Polipropilen tüpler |
| BD FACS Tüpler | Fisher Scientific | 352003 | Polipropilen tüpler |
| 40 mm tabaklar | MidSci | TP93040 | Doku kültürü tedavi 70 |
| & mu; m naylon süzgeç | MidSci | 70ICS | steril |
| 40 μ m naylon süzgeç | MidSci | 40ICS | steril |
| BD 10 mL şırınga | Fisher Scientific | 301604 | İğnesiz Tek Kullanımlık Şırınga |
| Havaneli | MidSci | PEST | steril |
| Buğday Şişeleri | Fisher Scientific | 986734 | Astarsız |
| BD 30 G iğne | Fisher Scientific | 305128 | 1 inç |
| Hausser Scientific Parlak Çizgi Cam Sayma Odası | Fisher Scientific | 0267151B | Hemositometre |
| Gibco Tripan mavisi% 0.4 Çözelti | Fisher Scientific | 15250061 | Canlılık |
| Boyası Eppendorf tüpleri | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Hücre Görüntüleme | Thermo Fisher Scientific | 447113 | 20X objektif ile Floresan Görüntüleme |
| %100 Etanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | %70 Etanol yapmak için kullanılır |
| Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipet |
| Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipet |
| Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipet |
| Rafı LTS 1000 mL > GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Mavi Raf Steril |
| Uç Rafı LTS 250 mL & ndash; GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Yeşil Raf Steril Uç |
| Rafı LTS 20 mL & GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Kırmızı Raf Steril Uçlar |
| FACSAria II Hücre Sıralayıcı | BD Biosciences | N/A | Özel sipariş |
| LSR II Sitometre | BD Biosciences | N/A | Özel sipariş |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Mü ller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Mü ller hücreleri |
| Aqp4 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00802131_m1 | Astrositler |
| Calb2 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00801461_m1 | Anakrin, Yatay |
| Cd68 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epitel |
| HücreleriGad2 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Bilimsel | Mm01545399_m1 | Ev bakımı gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm01297482_m1 | Yatay |
| Lim2 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00624623_m1 | Yatay |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Fotoreseptörler |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm01219406_m1 | Yatay |
| Pcp4< / em> | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amakrin |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Hücreleri |
| Prdx6 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00725435_s1 | Astrositler |
| Prkca | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00435969_m1 | Yatay |
| Pvalb | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00443100_m1 | Amakrin |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion |
| HücreleriRom1 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00436364_g1 | Fotoreseptörleri |
| Rpe65 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epitel |
| hücreleriSlc1a3 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00600697_m1 | Astrositler |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Hücreleri |
| Tubb3 | Thermo Fisher Bilimsel | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion |
| HücreleriVim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Mü ller hücreleri |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reaktifi |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA İzolasyonu |
| SuperScript VILO cDNA Sentez Kiti | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA sentezi |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Ön Amplifikasyon adımı |
| BD Cytofix / Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fiksasyon / Geçirgenleştirme Tamponu |
| BD Perm / Yıkama | BD Biosciences | 554723 | Geçirgenleştirme Çözeltisi |
| RBPMS | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-86815 | hücre içi antikor |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 hücre içi antikor | |
| BRN3A | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-8429 | hücre içi antikor |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | hücre içi antikor |
Kaynaklar
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
