Yöntem makalesi

Fields Tedavisi Tümör kullanma Kanserli Hücreleri için optimum inhibitör Frekans (TTFields) Belirlenmesi

DOI:

10.3791/55820

⸱

4 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Preclinical Research Department, Novocure Ltd., Haifa, Israel, 2Novocure Ltd., Haifa, Israel, 3Novocure GmbH, Lucerne, Switzerland

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör Muamele Alanları (TTFields), düşük yoğunluklu, ara frekanslı, alternasyonlu elektrik alanlarının kesintisiz, noninvaziv uygulamasıyla verilen etkili bir anti-tümör tedavi modudur. TT, bir TTFields in vitro uygulama sistemi kullanarak hücre dizilerine uygulama yapmayı, hücre sayımlarında en fazla düşüşe yol açan en uygun frekansın saptanmasına izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör alanları (TTFields) tedavisi, birkaç yüz kHz arasındaki bir frekans aralığında elektrik alanları sırayla değişen düşük yoğunluğunun sürekli, invazif olmayan bir uygulama (1-3 V / cm) ile teslim etkili bir tedavi şekli vardır. Doku kültüründe TTFields çalışma yüksek bir dielektrik sabiti (ɛ> 5.000) ile seramik Petri kapları frekansları ve yoğunlukları değişen elektrik alanlarının uygulama sağlar nitro uygulama sistemi, TTFields kullanılarak gerçekleştirilir. Seramik Petri kapları altındaki lamelleri kaplama Kanserli hücre hatları, hücre sayımı ve klonojenik tahlilleri gibi tedavi sonuç testleri, kolaylaştırmak için çeşitli frekanslarda iki ortogonal yönde teslim TTFields tabi tutulur. Bu raporda sunulan sonuçlar hücre sayımı ve klonojenik tahlilleri ile ilgili olarak TTFields optimal frekans bilgilerini yumurtalık ve glioma hücreleri için, 200 kHz olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör tedavisi Sahası (TTFields) glioblastoma multiforme ve potansiyel olarak diğer kanser türlerinin tedavisi için bir anti-mitotik yöntemidir. Alanları tümör, 1, 2 bölgeye elektrik alanları sırayla değişen, düşük yoğunlukta sürekli uygulanması (1-3 V / cm), ara frekans (100-500 kHz) ile teslim edilmiştir. In vitro ve in vivo olarak TTFields uygulaması çeşitli kanser hücre kuşaklarının büyümesini ve çeşitli hayvan tümör modellerinde, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tümör ilerlemesini önleyen gösterilmiştir. glioblastoma ve küçük hücreli olmayan akciğer kanseri dahil olmak üzere katı tümörler, hastalarda pilot klinik çalışmalarda ve daha büyük randomize çalışmalar, demonst sahipSürekli TTFields uygulamasının emniyetini ve etkinliğini 8 , 9 , 10 olarak derecelendirdi. TTFields'in etkinliği şu şekilde bulundu: (1) frekansa bağlı, spesifik optimal frekanslar, farklı kökenden 1 , 2 , 4 , 5 , 6 , 7 kaynaklı hücre hatlarının hücre sayımlarında en fazla azalmaya neden olur; (2) yaklaşık 1 V / cm'de aktivite için minimum bir eşik ve 1 , 2 , 7 , 11 daha güçlü yüksek yoğunluklarla , elektrik alan yoğunluğuna bağlı; (3) tedavi süresi daha uzun olduğunda artmış 5 ; Ve (4) 2 yönlü TTFields her otonom için dikey olarak uygulandığında daha yüksekTek bir yönden uygulanan elektrik alanlarına kıyasla 1 . Yukarıdaki bulgulara dayanarak, TTFields, tümör yatağındaki elektrik alan şiddetini en üst düzeye çıkarmak için hastanın cildinde lokalize olan 2 set dönüştürücü diziyi kullanarak uzun süreler boyunca hastalara uygulanabilir 12,13.

TTField'lerin kanserli hücreler üzerindeki etkilerini in vitro olarak incelemek şu anda belirli bir tümör türüne uygulanacak en uygun frekansı belirlemenin tek yolunu sağlamaktadır. Optimum frekansı test etmek için, 100-500 kHz aralığında farklı frekansların ve hücre kültürüne 3 V / cm karekök kareye (RMS) kadar şiddet uygulamanın yapılmasına izin veren bir cihaz gerekir. TTFields uygulaması ısı üretirken, uygulama sistemi sıcaklık üzerindeki sıkı kontrolü sürdürürken aşırı sıcaklığı dağıtma yeteneğini gerektirir.

Birkaç cihaz dahaE, hücre kültürlerine 1 , 2 , 5 , 14 , 15 , 16 TTFields uygulamasına izin vermek için yıllar boyunca geliştirildi. Bütün bu cihazlarda, elektrot yüzeyinde elektron değişimi ve zehirli metal iyonlarının ortam 1 içine salınması gibi iletken elektrotların kullanılmasına ilişkin uyarıları önlemek için kullanılan elektrotlar izole edildi. Test edilen çeşitli TTFields uygulama sistemleri arasındaki temel fark, 2 , 14 , 15 , 16 nolu izolatör ince bir film ile yalıtılmış metal tellerden yapılmış ya da yüksek dielektrik sabitli bir materyal ile ( örn. Kurşun magnezyum niobat-kurşun titanatE (PMN-PT)) 6 . İzoleli tel elektrotlar, TTFields uygulaması için nispeten basit ve uygun maliyetli bir çözüm sunarken, genellikle 1 V / cm eşiğin üzerindeki efektif elektrik alan şiddetlerini elde etmek için gerekli olan yüksek voltaj ve hücre kaplaması için mevcut olan yüzey ile sınırlıdır, Çünkü elektrotlar arasındaki mesafe nispeten azdır. Yüksek dielektrik sabit bir malzeme kullanılarak izole edilmiş elektrotlara dayanan sistemler özel tasarım ve imalat kabiliyetleri gerektirir, ancak yüksek voltaj gerektirmezler ve elektrotlar arasında hücre büyümesi için daha büyük bir alan sunabilirler.

Bu çalışmada kullanılan TTFields in vitro uygulama sistemi, yüksek dielektrik sabit seramikten ( yani, PMN-PT) oluşan bir Petri kabı (TTFields çanak, bkz. Şekil 1 ) olan çekirdek birimi olan ikinci sistem sınıfına aittir. İki çift elektrod, dış duvar üzerinde dikey olarak basılmaktadır2 doğrultudan elektrik alanlarının uygulanmasına izin vermek için bir TTFields tabakının ls'si. Elektrotlar, 50-500 kHz frekans aralığında TTField uygulamasına izin veren bir sinüzoidal dalga formu üreteci ve bir yükselticiye bağlanır. Aşırı ısıyı dağıtmak için, TTFields bulaşıkları bir buzdolabında inkübatöre konur; orta sıcaklık kontrolü, çanak sıcaklığının sabit izlenmesi ve sistem tarafından uygulanan voltaja yapılan ayarlamalar kullanılarak gerçekleştirilir. Uygulamada, kuluçka makinesini daha düşük bir sıcaklığa ayarlamak, çanak içindeki hedef sıcaklığa ulaşılana kadar sistem voltajı arttırdığı için daha yüksek elektrik alan şiddetine yol açacaktır. Çanak içindeki sıcaklık ile inkübatör sıcaklığı arasındaki fark, sıcaklık gradyanlarına bağlı olarak biraz buharlaşmaya neden olabilir; Dolayısıyla, yeterli büyüme koşullarını korumak için kültür ortamının her 24 saatte değiştirilmesi gerekiyor.

Aşağıdaki protokolTTField frekanslarının kanserli hücrelere uygulanmasını optimize etmek için deneysel prosedürü açıklar, böylece hücre sayımında azami bir azalma ve hayatta kalan hücrelerin koloni oluşturmak için potansiyelinde bir azalma sağlanır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Vitro Uygulama Sistemi 1. TTFields - Taban Plakası ve Bulaşık Bakım

  1. musluk suyu altında yemekleri ve bulaşık kapaklarını durulayın. Daha sonra, iyonu giderilmiş su ve hava kuru yüzü aşağı ile yıkayın.
  2. bir kemoterapötik ajan / madde, önceki deneyde tabaklara eklenmiş ise,% 5 açık bir deterjan çözeltisi ile her bir çanak dolgu ve bir gece bekletin.
    1. İyice çanak içindeki deterjan izlerini önlemek için akan musluk suyu altında bulaşıkları yıkayın. bulaşıkları yıkayın ve bulaşık aşağı deiyonize su ve hava kuru yüzüyle kapsar.
  3. sterilizasyon torbaları içine kendi kapakları ile temiz ve kuru yemekleri yerleştirin. Yemekler yüz aşağı ile kapatın ve bir otoklavda çanta yerleştirin. 121 ° C'den daha yüksek bir sıcaklıkta, 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır.
  4. kısmen otoklav kapağını açın, bir kurutma programı ile otoklav ayarlayın ve 30 dakika boyunca yemekler kurutun.
  5. Hafif% 70 etanol ile ıslatılmış bir bezle taban plakası silin.

    6. 2. Deney Kurulumu

    NOT: Bu protokolde kullanılan tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Listesinde açıklanmıştır. Steril koşullar muhafaza ederken tüm adımlar aşağıda bir laminar akış kabini içinde yapılmalıdır.

    1. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi, temiz ve steril TTFields yemekleri ve kapakları hazırlayın hafifçe% 70 etanol ile ıslatılmış bir bez ile taban plakası silin.
    2. tabağına hafifçe bastırarak ve taban plakası üzerinde üç pimin üzerine bulaşık kilitleri ağız kadar yaklaşık 5 mm saat yönünde çevirerek taban plakası üzerine kapaklı TTFields yemekler takın. Her bir tabağın tabanına steril bir 22 mm lamel (işlenmiş plastik veya cam) yerleştirin.
    3. tam büyüme ortamında hücre süspansiyonu (U-87 MG ve F98 için Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı hazırlamak; RPMI A2780 ve OVCAR-3, tarif edildiği gibi ilave Malzemeler Listesi).
      NOT: ceII konsantrasyonu% 80-% 90 birleşen hücre büyümesi, deneyin sonuna kadar aşılmamalıdır, hücre tipleri ve deney süresine bağlıdır.
      DİKKAT: İnsan hücre hatları biyolojik bir tehlike temsil edebilir ve uygun güvenlik önlemleri ele alınmalıdır.
    4. Her lamel merkezi bir damla olarak hücre süspansiyonu (iki katına çıkma süresi ile ilgili olarak, bir 72-st bir deney için 200 uL genellikle 5,000-20,000 hücre), 200 uL yerleştirin ve bulaşık kapaklı kapsamaktadır.
    5. Hücreler uygun kadar bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edilir; Bir gece boyunca inkübasyon bu aşamada mümkündür.
    6. Bir 200- veya 1000-mcL pipet kullanarak menüden sıvıları aspire.
    7. Yavaşça her yemeğin doldurmak için, tam büyüme ortamında 2 mL pipetle. pipet steril ucu kullanın ve usulca bazen slayt altında yakalandı hava kabarcıklarını çıkarmak için lamel kenarları hafifçe vurun.
    8. Onların kapaklı yemekleri örtün ve onlara ins yerleştirmekTTFields Tedavinin başlangıcında kadar 37 ° C'de bir CO2 inkübatör ide.

    3. TTFields Başvurusu

    1. Bir soğutma CO2 inkübatöründe bağlı TTFields yemekler ile taban plakaları aktarın.
      Not: nitro TTFields uygulama ısı üretecek olarak; Dolayısıyla, bir buzdolabında inkübatör yemeklerin ısınma telafi etmek gereklidir. Daha yüksek TTFields yoğunluklar daha fazla ısı üretecek ve daha düşük inkübatör ortam sıcaklıkları (Tablo 1 e bakınız) gerektirecektir. TTFields uygulama için kuluçka sıcaklığı 18-30 ° C aralığında olduğu zaman klinik olarak önemli TTFields yoğunlukları elde edilir.
    2. taban plakasına düz kablo, dişi konektör bağlayın. üzerinde TTFields jeneratör açın.
    3. In vitro uygulama sistemi yazılımında TTFields başlatın ve deney ayarlarını seçin.
      1. Yeni bir deneme tanımlayın. exp adını yazıneriment ve bilgisayar ekranında yazılım kullanıcı arayüzünde deney sahibi. Her bir tabak ya da taban plakası için olan frekans ve hedef sıcaklığa ayarlayın.
    4. yazılımını kullanarak TTFields uygulamasını başlatın.
    5. Tüm yemekler düzgün bağlandığından emin olun ve monitörde açık mavi görüntülenir. Bir tabak kırmızı çerçeve ile çember ise (düzgün bağlı olmadığı anlamına gelir), hafifçe bastırın ve kontakları tamir edilinceye kadar ileri geri yavaşça döndürün ve çanak açık mavi görünür.
    6. En fazla 24 saat çalışan vitro uygulama sisteminde TTFields bırakın.
    7. Deney son noktaya ulaşırsa, yazılımda SON DENEY düğmesine tıklayarak denemeyi durdurup, 5. Değilse adım PAUSE deney tıklayın geçin.
    8. taban plakasından düz kablo konnektörü ayırın. Laminer akış kabinine inkübatör yemekleri ile taban plakasını sökün.
    9. Tüm çanak orta değiştirinHer 24 saatte bir yıkayın ve taban plakasını buzdolabında bulunan inkübatöre geri gönderin. Yassı kabloyu kullanarak taban plakasını jeneratöre bağlayın. CONTINUE düğmesine tıklayarak denemeye devam edin.

    4. Kontrol Örnekleri

    Not: TTFields uygulaması hariç, kontrol hücrelerini TTFields ile işlem gören hücrelere benzer koşullarda büyütün.

    1. Aynı süspansiyonlu ve TTFields ile muamele edilmiş numunelerin kaplanması için kullanılan benzer bir yüzey üzerindeki plaka kontrol numuneleri.
    2. Kontrol kaplarını 37 ° C'de CO 2 inkübatörüne yerleştirin.
    3. Ortamı, her 24 saatte bir TTFields ile işlenmiş çanak ortam koşullarıyla eşleştirmek için bulaşıkları değiştirin.

    5. Deney Bitir

    1. DENEME SONU'ya tıkladıktan sonra, yazılımın sistemdeki tüm kayıtları almasını ve kayıtları bilgisayara kaydetmesini bekleyin.
    2. Sıcaklık, akım ve direnç günlüğünü görmek için RAPORLAR düğmesini kullanın fher bir taban plakasının Iles yemekler deney planına göre tedavi edildi doğrulamak için.
      NOT: Tüm raporlar ve günlükleri deney bittikten sonra bilgisayara kaydedilir ve herhangi bir zamanda gözden geçirilebilir.
    3. TTFields jeneratör kapatın.
    4. taban plakasından düz kablosunu ve inkübatör çıkarın.
    5. aşağı bir seramik tabak çıkarmak için, Altlığından kilidini saat yönünün yemeğin açmak için.
    6. Laminer akış kabinine bulaşıkları alın ve aseptik lamelleri çıkarın. Daha fazla kontrol ve değerlendirme için taze ortam ya da fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren Petri kapları steril aktarın.

    TTFields Etkisinin Değerlendirilmesi 6.

    NOT: TTFields' etkileri çeşitli şekillerde belirlenebilir. muamele edilmemiş kontrol hücrelerine muamele edilmiştir karşılaştırmak için aşağıdaki yöntemlerden bir veya daha fazlası kullanılır:

    1. Hücre sayımı
      1. Her bir lamel içeren çanak orta / PBS çıkarın.
      2. Bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de (hücre lamel yüzeyinden ayırmak başlayana dek, yani) her bir tabağa, 0.5 mL% 0.25 tripsin / EDTA ilave ve 10 dakika inkübe edilir.
      3. tripsin nötralize yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme hücrelerin yeniden askıya almak için, tam büyüme ortamında 0.5 mL ekleyin.
      4. Düşük hücre konsantrasyonları sayma ile uyumlu olan herhangi bir standart hücre sayımı tekniği kullanarak hücreleri sayın (yani, yaklaşık 20,000 hücre / mL) eklenmiştir.
    2. kolojenık incelemesi
      1. yeni, steril Petri kutularına ya da taze tam büyüme ortamında 2 mL içeren 6 oyuklu plakalar üzerine Her bir tabaktan alınan hücre benzer sayıda (tabak başına 100-500 hücre) Plate.
      2. ~ 50 hücre oluşur müteşekkil kolonilerinin (her bir hücre hattı özelliklerine bağlı olarak) 1-3 hafta boyunca 37 ° C'de bir CO2 inkübatör içinde inkübe edin. hücreyi değerlendirinIşık mikroskobu ile koloni başına sayısı.
      3. Ortamı çıkarın ve PBS ile yıkayın.
      4. PBS çıkarın ve buz soğukluğunda metanol (1 mL) ilave edilir. 10 dakika veya daha uzun bir süre -20 ° C'de inkübe edin.
      5. metanol çıkarın.
      6. Kristal viyole çözeltisi (% 0.1 a / su içinde% 25 h / h metanol içerisinde v) ilave edilir ve 20 dakika inkübe edilir.
        DİKKAT: Kristal viyole potansiyel bir kanserojen olduğu; kristal mor ile çalışırken eldiven kullanın.
      7. , Kristal viyole kaldırma deiyonize su ile 3 kez yıkanır ve hava ile kurutulur.
      8. Her bir tabağın içinde oluşturulmuş kolonileri sayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı frekanslar tararken TTFields uygulamasının sonuçlan, hücre sayımları, kolorimetrik deneyler, klonojenik testler ve özel bir yüksek duvar TTFields içine yerleştirilmiş bir Boyden odasını kullanarak istilacı hücrelerin sayısındaki değişiklikler üzerine yapılan incelemeler gibi farklı tahlillere dayanılarak nicelendirilebilir Hücre kültürü çanağı. Önceden belirlenmiş hücre çoğaltma sürelerine dayanan dikkatli deney planlaması, hücrelerin tedavi süresi boyunca maksimum sayıda mitotik olaya ulaşmasına ve dolayısıyla tedavi sonuçlarının en üst düzeye çıkarılmasına olanak tanır.

Şekil 2, A2780'in ( yani insan yumurtalık kanseri hücreleri; Şekil 2A ) 7 ve F-98'in ( yani, sıçan glioma hücreleri; örn., Sıçan glioma hücreleri) ortalama bir hücre sayımı ( yani hücre sayısı) ve klonojenik tahlil için tipik bir frekans tarama sonucu göstermektedir."> Şekil 2B) 1 (iki yönlü TTFields ile muamele frekans aralığı: 100-500 kHz, RMS: 1.7 V / cm ve kuluçka ısısı:. 18 ° C), sonuçlar, tüm hücre sayılarında belirgin bir azalma frekansları uygulanan (çoklu karşılaştırma ile tek yönlü ANOVA) test edilen tüm hücre hatları için 200 kHz maksimum azalma. klonojenik potansiyeli yüksek azalmasına yol açan uygun frekans hem A2780 ve F98 hücreleri (Şekil 2B ve C) için aynıydı ., hücre sayısı ve her bir frekansta klonojenik etkisi arasında Pearson korelasyon katsayısı 0.967 (p = 0.002) ve sırasıyla A2780 ve F98 için 0.755 (p = 0.083) idi.

Şekil 3, OVCAR-3 için ortalama hücre sayımı için bir frekans tarama sonucu gösterir (diğer bir deyişle, insan yumurtalık kanser hücrelerinin, Şekil 3A) ve U-87 MG (yani insan glioma hücreleri, Şekil 3B) hücreleri, farklı yoğunluklarda TTFields iki yön ile muamele edilmiş (RMS: 1.7, 1.3 ve 1.0 U / cm aralıklarında ve kuluçka ısısı: 18 ° C, 24 ° C ve 28 ° C) göstermektedir. , Hücrelere etki eden tedavi zaman elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, nispeten küçük: sonuç yine 1.3 V / cm 'TTFields ile muamele (24 ° C inkübatör sıcaklığı) sonra OVCAR-3 hücre sayımında önemli bir azalma ise olduğunu göstermektedir 1.7 V / cm (kuluçka sıcaklığı: 18 ° C). U 87 mg, hücreler, 1.0 V / cm 'TTFields ile muamele (kuluçka sıcaklığı: 28 ° C) de 1.7 V / cm ile tedavi edildiğinde hücre sayısının azaltılmasında da benzer bir eğilim gösteren, ama etkisi daha düşük yoğunluklarda anlamlı değildi .

figure-results-1
Figüre, 1. TTFields yemekler taban plakası ünitesi üzerine yüklenmiş ve düz TTFields kontrol kablosuna bağlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. (A), A2780 ve (B) F98 hücreleri için uygun TTFields önleyici frekansının belirlenmesi için frekans tarar. Hücreler, farklı frekanslar TTFields (1.7 V / cm ve 100-500 kHz) ile 72 saat boyunca muamele edilmiştir. TTFields tedavisinin etkisi hücre sayısını ve clonogenic testler kullanılarak tahmin edilmiştir. Ok uygun sıklığını gösterir. Sonuçlar, test edilen her bir frekans için en az 6 tekrar göre ± SD ortalamasını temsil etmektedir. (C) clonogenic s temsili görüntüleri Çeşitli frekanslarda TTFields tedaviden sonra A2780 hücreleri urvival. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. (A), OVCAR-3 ve (B) için en uygun TTFields önleyici frekansının belirlenmesi için frekans taraması U 87 mg hücreleri. Hücreler, farklı frekanslarda (100-500 kHz) ve yoğunluk TTFields ile 72 saat süre ile muamele edilmiştir (OVCAR-3: 1.3 ve 1.7 V / cm; U-87 MG: 1.0 ve 1.7 V / cm). TTFields tedavisinin etkisi, hücre sayımı kullanılarak tahmin edilmiştir. Ok uygun sıklığını gösterir. Sonuçlar, test edilen her bir frekansta en az 6 tekrar göre ± SD ortalamasını temsil etmektedir.Pg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

İnkübatör ortam sıcaklığı Beklenen TTFields yoğunlukları
(° C) (V / cm RMS)
18 1.62
19 1.55
20 1.48
21 1.41
22 1.33
23 1.26
24 1.19
25 1.12
26 1.04
27 0.97
28 0.9
29 0,83
30 0.76

Tablo 1. İnkübatör ortam sıcaklığı ve beklenen TTFields TTFields kabındaki yoğunlukları.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TTFields düzgün ayarlanmış alternatif elektrik alanları, 1, 2, 8, 9, 10, 17 sürekli bir uygulamaya dayalı yükselen bir anti-tümör yöntemidir. Anti-tümör etkinliğini maksimize tedavi yöntemleri için istenen bir sonuçtur. Böylece, kanserli hücre büyümesi inhibisyonu her ek yüzde "mücadele" hastalar için uzun süreli klinik sonuç üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu, TTFields uygulamanın gerekli olan sürekli doğası ve elde edilen toplam etki göstermektedir. Maksimize TTFields uygulama çeşitli yollarla elde edilebilir: (1) elektrik alan yoğunluğu 1, 7, artan (2) uzatma tedavi süresi 5, (3) en etkili combinati bulma18 , 19 ve (4) en iyi frekansı tanımlayan diğer tedavi modaliteleri ile birlikte 1 , 2 , 4 , 6 , 7 . Tümör sahasında elektrik alan şiddetinin en üst düzeye çıkarılması, dizilerin konumunu hasta cildi üzerinde optimize etmek suretiyle sağlanır; Bu, hastanın 20 bireysel anatomisine dayanılarak maksimal alan yoğunluğunun tümöre verilmesini sağlar. Uzun süreli tedavi süresi çoğunlukla hastanın tedaviye uyumluluğuna (günde en az 18 saat) dayanıyor. Diğer terapilerle doğru kombinasyonun bulunması ve optimal frekansın belirlenmesi, TTFields tedavi sonuçlan için geçerli bir belirteç bulunmadığından şu anda in vitro sonuçlar üzerine kuruludur. Bu çalışmada, deneysel pTTFields in vitro uygulama sistemini kullanarak kanserli hücre çizgileri için optimal TTField frekansını belirlemek için gereken rolü. Burada açıklanan yöntemler, diğer kanser tedavi yöntemlerinin ( örn., Kemoterapi ajanları veya ışınlama) TTField'larla kombinasyonunun taranması ve her bir spesifik kombine tedavi için TTFields uygulaması için en uygun frekansı belirlemek için potansiyel olarak kullanılabilir.

Daha önceki yayınlar doğrultusunda, burada gösterilen sonuçlar, hem gliom hücreleri hem de yumurtalık kanseri hücrelerinin tedavisinde en uygun sıklığın 200 kHz 1 , 7 olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, klonojenik potensiyeli azaltmak için en uygun TTFields frekansının, maksimum sitotoksik etkiye yol açan frekansla ilişkili olduğunu ilk kez gösterdik. Bu çalışmada TTField'lerin ( yani sitotoksik ve klonojenik) etkilerini ölçmek için kullanılan yöntemlerTedavi sonuçlarını değerlendirmek için olası birçok standart son nokta testinden sadece iki tanesidir. İlave tedavi sonuç testleri şunları içerir: (1) hücre içi yapıların görüntülenmesi için hücrelerin üzerine mikroskop uygulanan lamelleri sabitleme, lekelenme ve monte etme; (2) TTFields bulaşıklarının kendisinden veya lamelin yeni bir atılabilir tabak içine aktarılmasından sonra, protein ve RNA özütlerinin deneylerini gerçekleştirmek; Ve (3) akış sitometrisi analizi için lekelenmiş hücrelerin tripsinizasyonunu içerir.

Dikkatli bir deney planlaması, TTFields'in verilmesinden sonraki tedavi sonuçlarını etkiler. Kilit adımlar arasında, deney boyunca hücre çoğalmasının, hassas hücre hatlarına uygulandığında çok yüksek yoğunluklar gerekli testler için çok az sayıda hücre belirleyecek şekilde aşırı büyüme ve uygun elektrik alan yoğunluğuna yol açmamasını sağlamayı içerir. En uygun frekans. Tersine, TTFields çok düşük yoğunluklarda uygulanırDaha az duyarlı hücre çizgileri üzerinde, doğal değişimler tarafından maskelenebilen küçük etkilere yol açacaktır. İşlem kayıtları, sıcaklık kararlılığı, elektrik akımları ve deney boyunca her yemeğin direnci ile ilgili değerli bilgiler için incelenmelidir. Tedavi başlangıcındaki hatalı tabakların değiştirilmesi ve arzu edilen tedavi parametrelerini karşılamayan bir tabaktan alınan verilerin hariç tutulması, tekrarlar arasındaki değişkenliği en aza indirecektir.

Özetle, TTFields, 8,9,10 klinik ortamlarda etkinlik ve güvenlik gösterdiği ortaya çıkan bir antikanser tedavi modalitesidir. Burada açıklanan protokolleri kullanarak bir in vitro ortamda TTField'ları test etmek, klinik ortamda TTFields tedavi parametrelerinin optimizasyonuna izin verebilir ve alttaki etki mekanizması konusundaki anlayışımızı genişletebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna Zeevi einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa Tal Orna ve Kirson D. Eilon D Novocure Ltd, İsrail de çalışanların ödenir. Weinberg Uri Novocure GmbH, Luzern ücretli çalışanın. Yoram Palti Novocure Ltd, NY bir ortağıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir onayları var.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
inovitro sistem ve yazılımNovocureITG1000 ve IBP1000Her ünitede 1 adet TTFields jeneratör, 1 adet taban plakası, 8 adet kapaklı TTFields kabı ve 1 adet düz kablo bulunmaktadır.
Sterilizasyon torbalarıWestfield medical24882
Plastik kapak kızaklarıThermo Scientific (NUNC)174977Ön işlem görmüş ve sterilize edilmiş
Cam kapak kızaklarıThermo Scientific (Menzel-Glä ser)CB00220RA1Gerekirse sterilize edin
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s ortaBiyolojik Endüstriler (İsrail)01-055-1A37 °C'de sıcak Kullanmadan önce C su banyosu
RPMI 1640Gibco21875-03437 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Fetal Sığır Serumu (FBS)Biyolojik Endüstriler (İsrail)04-007-1A37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-029
Pen/Strep (10.000 U/mL Penisilin, 10.000 & mikro; g / mL Streptomisin)Gibco15140-122
Sodyum Piruvat çözeltisi 100 mM Biyolojik Endüstriler (İsrail)03-042-1B
Hepes tamponu 1 MBiyolojik Endüstriler (İsrail)03-025-1B
Sığır pankreasından insülin çözeltisiSigma-Aldrich10516-5ML
%0.25 Tripsin/EDTABiyolojik Endüstriler (İsrail)03-050-1B37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
MethanolMerck1.06009.2511-20 ° C'ye soğutun; C kullanmadan önce dondurucuda
Kristal viyoleSigma-Aldrich120M1445Zararlı. % 25 Metanol% 75 su içinde% 0.1 w / v kristal viyole çözeltisi hazırlayın.
Hafif deterjanAlcononx242985Suda% 5'lik çözeltiyi veya üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
PBSBiyolojik Endüstriler (İsrail)02-023-1AKalsiyum ve magnezyum
olmadan A2780ECACC93112519FBS (% 10), kalem / strep (100 & U / mL / 100  &mikro; g / mL), sodyum piruvat (1  mM) ve Hepes tamponu (12  mM).
F98ATCCCRL-2397Dulbecco'da Büyüyor s değiştirilmiş Kartal' FBS (% 10), kalem / strep (100  U / mL / 100  &mikro; g / mL), sodyum piruvat (1  mM) ve glutamin (2  mM).
Ovcar-3ATCCHTB-161FBS (% 20), kalem / strep (100 & U / mL / 100  &mikro; g / mL), sodyum piruvat (1  mM), Hepes tamponu (12  mM) ve insülin (10  &mikro; g/mL).
U-87 MGATCCHTB-14Dulbecco'da Büyüyor s değiştirilmiş Kartal' FBS (% 10), kalem / strep (100  U / mL / 100  &mikro; g / mL), sodyum piruvat (1 mM) ve glutamin (2  mM).
soğutmalı CO2 inkübatörüCARON7404-10-3
Laminer akış kabiniADS LaminairBio12 ve VSM12

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirson, E. D., et al. Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).
  2. Kirson, E. D., et al. Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields. Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).
  3. Gera, N., et al. Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit. PLoS One. 10 (5), (2015).
  4. Giladi, M., et al. Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields. Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).
  5. Giladi, M., et al. Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells. Sci Rep. 5, 18046(2015).
  6. Giladi, M., et al. Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo. Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).
  7. Voloshin, T., et al. Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).
  8. Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &, D. A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).
  9. Stupp, R., et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).
  10. Stupp, R., et al. NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality. Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).
  11. Kanner, A. A., et al. Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy. Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).
  12. Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &, J. P. Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma. Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).
  13. Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas. Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).
  14. Kim, E. H., et al. Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation. Oncotarget. , (2016).
  15. Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &, M. Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis. Oncotarget. , (2016).
  16. Pavesi, A., et al. Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application. Sci Rep. 6, 26584(2016).
  17. Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation. Cancer Med. , (2015).
  18. Kirson, E. D., et al. Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields). BMC Med Phys. 9, (2009).
  19. Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &, Y. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters. BMC Cancer. 10, 229(2010).
  20. Connelly, J., et al. Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement. BMC Cancer. 16 (1), (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

TTFields In VitroOptimal FrekansKanser H cre HatlarElektrik Alan UygulamasAk SitometrisiKlonojenik DeneylerSeramik Petri KaplarFrekans TaramasTedavi Sonucu

İlgili makaleler