Yöntem makalesi

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi 2+ Sensör Catcher +

DOI:

10.3791/55822

⸱

19 Mayıs 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dıĢı uyaranlar tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum (Ca2 + ) geçicileri canlılarda çok sayıda biyolojik proses başlatır. Hücre içi kalsiyum salınımının merkezinde, kas hücrelerinde büyük hücreiçi kalsiyum depolama organelleri, endoplazmik retikulum (ER) ve daha özelleşmiş sarkoplazmik retikulum (SR) bulunur. Bu organellerden kalsiyumun dinamik olarak salınması, sarko / endoplasmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası vasıtasıyla yeniden doldurma ile birlikte riyano-nodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R) aracılığı ile sağlanır. ER / SR'den hızlı kalsiyum salımını izlemek için, Catcher adı verilen, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum sensörü (GECI) oluşturuldu. Burada, HEK293 ve C2C12 hücrelerinde gelişmiş ER / SR hedef GECI Catcher + 'ın transfeksiyonu ve ekspresyonu için ayrıntılı protokoller ve IP 3 R, RyR ve SERCA pompa aracılıklı kalsiyum geçiciHEK293 hücrelerinde floresan mikroskobu kullanılarak özetlenmiştir. Seçilen reseptör agonisti veya inhibitörü oda çözeltisine dağıtılır ve yoğunluk değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Bu yöntemle, ER kalsiyumunda bir azalma, 4-kloro-m-kresol (4-cmc), adenosin trifosfat (ATP) ile dolaylı olarak IP 3 R'yi aktive eden RyR aktivasyonu ve siklopiazonik SERCA pompasının inhibisyonu ile görülür Asit (CPA). Ayrıca in situ K d' yi belirlemek ve C2C12 hücrelerinde bazal [Ca 2+ ] miktarını belirlemek için protokolleri tartışıyoruz. Özetle, Catcher + ile birlikte kullanılan bu protokoller ER / SR kalsiyum ile ilgili patolojilerin incelenmesinde gelecekte uygulanacak olan ER'den reseptör aracılı kalsiyum salımını ortaya çıkarabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi kalsiyum (Ca 2+ ) geçici maddelerinin uzay-zamansal özellikleri, çeşitli biyolojik fonksiyonları aktive eder 1 . Bu Ca 2+ sinyal olayları hücre dışı olarak farklı uyarılarla tetiklenir ve hücre içi olarak büyük Ca 2+ depolama organelleri ve sayısız Ca 2+ pompalar, kanallar ve Ca 2+ bağlayıcı proteinler tarafından kontrol edilir. Ca 2+ transientleri, sinyal modülasyonlu kusurların bir sonucu olarak farklı hastalıklara yol açarak önemli ölçüde değişebilir 2 . Merkezde endo (ER) ve sarkoplazmik retikül (SR) bulunan Ca 2+ sinyal sisteminin hızı ve karmaşıklığı nedeniyle, hızlı kinetik ile memelilerin ekspresyonu için optimize edilmiş genetik olarak kodlanmış Ca 2+ probları gereklidir Farklı hücrelerdeki küresel ve yerel Ca 2+ değişimlerini gözlemlemek 3 .

ER ve SR, Kas hücrelerindeki muadili, büyük intraselüler Ca 2+ depolama organelleri olup Ca 2+ sinyallerinin amplifiye edilmesine yardımcı olan Ca 2+ lavabo gibi hareket eder. ER / SR, Ca 2+ sinyallerinin ayrılmaz bir parçasıdır ve sinyaller 5 vericisi ve alıcısı olarak ikili rolleri vardır. Riyanodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R), Ca 2+ 6 ile regüle edilen ER / SR membranlarında bulunan Ca 2+ serbest reseptörleridir. Diğer ajanlar doğrudan veya dolaylı olarak bu reseptörlerin işlevini uyarır. 4-kloro-m-kresol (4-cmc), her ikisi de düzenli olarak RyR aracılı Ca 2+ salınımını incelemek için kullanıldığında, SR Ca 2+ salınımını tetiklemek için kafeinden 10 kat daha yüksek bir hassasiyete sahip olan, RyR'nin güçlü bir agonistidir Sağlıklı ve hastalıklı hücreler 7 . ATP, IP 3 aracılı Ca 2+ reIP 3 R 8 üzerinden kiralayın . ATP, bir G-proteine ​​bağlı reseptör (GPCR) olan purinergik reseptör P2YR'ye bağlanır ve IP 3 R'ye bağlanan IP 3 üretimini tetikleyerek Ca 2+ 'yı ER 9 , 10'dan salınır. Sarkoz endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası, aynı zamanda ER / SR zarında bulunan ve sitosolik Ca 2+ miktarını azaltan ve iyonu ER / SR lümenine aktif olarak pompalayarak ER / SR'yi tekrar dolduran bir P tipi ATPaz pompasıdır 11 . SERCA pompasının spesifik önleyicileri, Thapsia garganica'ndan thapsigargin ve Aspergillus ve Penicillium'dan siklopiazonik asit (CPA) içerir . CPA, pompa için düşük afiniteye sahiptir ve Ca 2+ erişim noktasını 12 tersine çevrilebilir şekilde bloke eder. Thapsigargin, diğer yandan, nanomol ile M3 helezonunda F256 kalıntısında Ca 2+ serbest pompaya geri döndürülemez şekilde bağlanırAf affinity 11 . Ca 2+ uyarılmış olaylarla ilgili değişiklikleri analiz etmek ve nicelleştirmek bir sorun olmuştur ve halen bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. ER / SR, Ca 2+ sinyalinin yayılımında merkez işlevli ana hücre içi Ca 2+ ihtiva eden kompartıman olduğundan, ER / SR Ca 2+ sinyalizasyonunu anlama konusunda çok çalışılmıştır.

Sentetik Ca 2 + boyalarının oluşturulması, Ca 2+ görüntülemenin tarla ve uygulamasına yardımcı olmuştur. Mag-Fura-2 gibi boyalar, farklı hücrelerdeki bölümlü Ca 2+ miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 13 , 14 , 15 düzensiz boya yüklemesi, foto-ağartma ve belirli organelleri hedef alamama gibi sınırlamaları vardır . Yeşil floresan protein (GFP) keşfi ve floresan protein-Tabanlı Ca 2+ sondaları Ca 2+ görüntüleme alanını ilerletti 16 . Mevcut GECI'lerin bazıları sarı floresan protein (YFP), camgöbeği flüoresan proteini (CFP), kalmodulin ve M13 bağlayıcı peptid 17 , 18 içeren Förster rezonans enerji transferi (FRET) çiftleri. Troponin C tabanlı GECI'ler, FRET'in CFP ve Sitrin çiftleri olarak ve tekli florofor probları 19 , 20 , 21 olarak da mevcuttur. GCaMP2 ve R-GECO gibi diğerleri, kalmodulin 22 , 23 içeren tekli florofor sensörleridir. Ca2 + bağlanma alanlarında 24 bulunan çoklu Ca2 + bağlanma yerleri ile ilişkili Kd ve kooperatif bağlamanın dar ayarlamanın sınırlamalarını aşmak için yeni bir kalsiyum sınıfı sınıfıSors, ​​gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) 25 , 26'nın kromofor duyarlı bir konumunda beta varilin yüzeyinde Ca2 + bağlama sitesi tasarlanarak oluşturuldu. CatchER olarak adlandırılan bu yüksek duyarlıklı sensör, ~ 0,18 mM'lik bir Kd'ye, difüzyon sınırının yakınında ak'a ve 700 s'lik bir ak'a sahiptir. Catcher, HeLa, HEK293 ve C2C12 25 gibi farklı memeli hücre dizilerinde reseptör aracılı ER / SR kalsiyum salımını izlemek için kullanılmıştır. Hızlı kinetiklerinden dolayı Catcher, genç ve yaşlı Friend Virüs B NIH Jackson (FVB) farelerinin flexor digitorum brevis (FDB) kas liflerinde FDB'de 2 s depolarizasyon sonrasında SR'de daha fazla Ca 2+ kalmış olduğunu göstermek için kullanıldı Eski farelerin elyafları genç farelerinkine kıyasla 27 . Memelinin kalsiyum görüntülemedeki uygulamalarını engelleyen, 37 ° C'de düşük flüoresansının üstesinden gelmek içinCatcher + denilen Catcher'ın geliştirilmiş bir versiyonunu geliştirdik. Catcher + , memeli hücrelerinde daha iyi uygulama için 37 ° C'de gelişmiş floresan sergilemektedir. 37 ° C'de 28 , 29 ° C'de termostabilite ve flüoresanı iyileştirmek için Catcher + ' e ek mutasyon eklendi. Catcher + , Sinyal-gürültü oranına (SNR) Catcher 30'a göre altı kat arttı.

Burada, Catcher + ile HEK293 ve C2C12 hücrelerinin kültürlenmesi ve transfeksiyonu için protokoller ve ER / SR reseptör aracılı kalsiyum geçişlerini izlemek için uygulanması sunulmuştur. Temsilci sonuçlar, 4 cmc, CPA ve ATP ile muamele edilmiş HEK293 hücrelerinde ifade edilen Catcher + için gösterilmiştir. C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d' sini belirlemek için bir protokol de sunuyoruzBazal [Ca 2+ ] ntifikasyonu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Slayt Hazırlama

  1. 6 cm'lik hücre kültürü kaplarında 22 mm x 40 mm'lik cam mikroskop lamı koyun, tabağa 1 slayt yerleştirin.
  2. Steril bir kaputta sterilize etmek için her slaydın her yanını ve 6 cm çanağı ultraviyole (UV) ışığa 15-20 dakika maruz bırakın.
  3. Parafilm ile içinde slaytlar bulunan bulguları kapatın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

2. Medyanın Hazırlanması, Tamponlar, Çözümler ve Reaktifler

  1. Deiyonize suda 1 L Hank dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın ve 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 ve 1 mM EGTA ekleyin. NaOH ile pH 7.2-7.3'e ayarlayın. Otoklavlanmış bir şişeye 0.22 μm'lik bir filtre ile tampon filtre edin.
  2. Deiyonize suda 900 mL yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hazırlayın. 44 mM NaHC03 ilave edin ve pH'ı HC1 ile 7.2-7.3'e ayarlayın. Medyayı 0,22 μm'lik bir filtre ile otoklavlanmış bir şişeye süzün. 100 mL fetal boviNe serum (FBS) ortamına% 10 FBS konsantrasyonu yapmak için. 4 ° C'de saklayın.
  3. Deiyonize suda 1 L intraselüler tampon (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM EGTA, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH'ı 7.25'e ayarlayın. Son [Ca 2+ ] ~ 100 nM olacaktır. Kullanmadan önce 0.5 mM ATP ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
  4. Deiyonize suda 1 L Ringer tamponu (121 mM NaCl, 2.4 mM K2HPO4, 0.4 mM KH2PO4, 10 mM HEPES ve 1.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Kullanmak için, 50 mL'lik bir alikot 50 mL tüp içine yerleştirin ve 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ekleyin.
  5. Deiyonize suda 1 L KCl durulama solüsyonu (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH'ı 7.25'e ayarlayın.
  6. 5 mg iyonomisin 1 mL dimetil sülfoksid (DMSO) içinde eritilir. Mikrotüpler içine 30 uL'lik kısım ayırın ve -20'de saklayın6 ° C.
  7. CPA'yı DMSO'ya eriterek siklopiazonik asit (CPA) stokunu hazırlayın. Apoptozu önlemek için hücrelere eklenen CPA için DMSO'nun son yüzdesinin ≤% 1 olduğundan emin olun. Filtrelenmiş H20 içine eritilerek ve bir gece boyunca 37 ° C'de çalkalanarak bırakılarak 20 mM 4-kloro-m-kresol (4 cmc) hazırlayın. Filtrelenmiş H20 içerisinde 100 mM'ye eriterek ATP stokunu hazırlayın.
  8. İn situ Kd'yi belirlemek için , 100 uL'lik bir KCl tamponu içinde 15 mM'lik 1 mM EGTA, 0.2 mM, 0.6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM ve 100 mM Ca2 + MM EGTA stok ve deiyonize su içerisinde çözündürülmüş bir 1 M CaCl 2 stokunu içermektedir.

3. Hücre Kültürü

  1. Kültür C2C12 miyoblast ve HEK293 hücreleri, steril bir UV kaputunda her biri 10 cm'lik hücre kültürü kapları kullanan ATCC protokollerine göre.
    NOT: C2C12 hücrelerinin ~ 70% konfluansa oranla daha fazla büyümesine izin verilmemelidir, çünkü miyoblastlar farklılaşmaya başlarMiyotüpler içine te. Hem HEK293 hem de C2C12 hücreleri kolayca büyür ve hücre bütünlüğünü korumak için% 100 konfluenasyondan sonra büyümesine izin verilmemelidir. Buna ek olarak, hücrelerin sağlığını korumak için bir denemede kullanmadan önce hücreler, 10 kereden fazla pasajlanmamalıdır.

4. HEK293 Hücrelerinin Transfeksiyon Edilmesi

  1. Tohumlanmış HEK293 hücreleri 6 cm'lik tabaklardaki sterilize edilmiş 22 mm x 40 mm cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilir, böylece transfeksiyon gününde ~% 70 konfluent olurlar.
  2. Ertesi gün, indirgenmiş serum ortamında ( örn. Opti-MEM) 2 μg Catcher + cDNA ve 1: 3 (ağırlık / hacim) DNA: transfeksiyon reaktif oranı kullanarak transfekte reaktifinin üreticinin protokolünü takip edin.
  3. DMEM ortamını çanaktan boşaltın ve 3 mL düşürülmüş serum ortamı ekleyin. DNA ekleyin: transfeksiyon reaktif karışımı çanak ve 4-6 saat 37 ° C'de inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra hücreleri 5-6 mL HBSS ile yıkayın. HBSS'yi atın fÇanak ve yerine 3 ml taze DMEM ile değiştirin ve GECI ekspresyonuna izin vermek için 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. C2C12 miyoblast hücrelerinin transfeksiyonu
    1. C2C12 miyoblast hücreleri için, çanak (1-2 mL) altını örtecek kadar tripsin ekleyerek hücreleri tripsinleştirin. Tripsinin tabağın altındaki hücrelerin gevşetilmesine izin vermek için 2-6 dakika 37 ° C inkübatörde çanağı yerleştirin.
    2. Kuluçka tamamlandıktan sonra tripsin çıkarın ve hücreleri 8 mL DMEM içinde aspire edin. DMEM ile hücreleri iyice pipetleyin ve te hücrelerini tekrar süspanse edin ve yeniden süspanse edin ve 3 cm'lik DMEM içeren 6 cm'lik hücre kültürü kaplarında steril lamellerin üzerine tohumlayın böylece böylece nihai konfluenasyon% 60 olacaktır.
    3. Adım 4.2-4.3'te özetlendiği gibi hücreleri aynı güne nakledin. 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Adım 4.4'ü tekrarlayın.

5. Slayt ve Floresan Mikroskop Hazırlama

  1. M açınMikroskop ve ışık kaynağına bağlayın, ardından Basit PCI programını açın. Mikroskopun 15-20 dakika boyunca veya şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamerası -65 ° C'ye soğuyana kadar ısınmasına izin verin. Odayı hazırlayın ve beklerken hücrelerle birlikte sürün.
  2. Düşük profilli açık elmas banyosu görüntüleme bölmesinin tabanını, pamuklu çubukla ince bir tabaka yapıştırın.
  3. İnkübatörden transfekte edilmiş hücreler içeren slayt alın ve 1 mL Ringer tamponu ile 10 mM glikoz ve 1.8 mM Ca 2+ 37 ° C'de önceden ısıtılmış üç kez yavaşça durulayın.
  4. Hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL Ringer tamponunu çanakta bırakın ve çanağın dışına çıkarmak için forseps kullanın. Aşırı solüsyonun bir laboratuar dokusunda slaytun kenarına dokunarak bir laboratuar dokusunda emilmesine izin verin. Ardından, gres içeren bölmenin yanındaki hücrelerin yağa doğru bakmasını sağlayın ve bir tornavida kullanarak sahne montajına sabitleyin.
  5. 1 ekleML Ringer tamponu hücrenin sahne üzerine monte edilmesi ve mikroskop kurulumunun geri kalan kısmının tamamlanması sırasında kurutulmasını önlemek için hazneye gelmektedir. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan sonra hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL'dir.
  6. 40X yağ daldırma objektif mikroskop objektif geçin.
  7. Amacı temizlemek ve kurutmak için lens kağıdı ve lens temizleme solüsyonunu kullanın. Amacı ovmayın. Yüzey temiz olana kadar yavaşça dikkatle dokundurun.
  8. Amaçya daldırma yağının bir damla ekleyin.
  9. Mount mikroskop sahneye yerleştirin ve odasına vakum ucu ekleyin. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan ve açıldığında, hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL'dir. Bu nihai hacim, odanın kenarlarıyla aynı seviyededir. Deney sırasında, aşırı doldurma nedeniyle çözeltinin objektifin içine dökülmesini önlemek için oda çözeltisinin düz olması zorunludur.
  10. Nesneyi yükseltin ve objektifteki yağ yansıtılıncaya kadar kaba ayarı kullanın.
  11. Parlak alan modunu kullanarak kazançları 175'e, pozlama süresini hücreleri odaklamak için 0,03 saniyeye ayarlayın.
  12. Hücreler odaklandığında, 488 nm uyarılmayı kullanarak floresans moduna geçin. Pozlama süresini 0,07 saniyeye değiştirin. Görüntü için yeterli flüoresan ile sağlıklı olan yeterli hücrelere sahip bir görüş alanını bulun.
  13. Bir görüş alanı seçildikten sonra, flüoresan ve parlak alan modunda fotoğraf çekin.
  14. Hücrelerde bir ilgi alanını (ROI) daire içine yerleştirin veya seçilen bölgedeki yoğunluğu kaydetmek için tüm hücrenin etrafını sarın.

6. İlaca bağlı Ca 2+ Geçici ve Yerinde K d Kalibrasyonunun Görüntülenmesi

  1. Her 5 saniyede bir ayarlanan kare hızıyla yoğunluk ölçümünü başlatın.
  2. Baz yoğunluğunun 20-30 çerçeve (100-150 s) boyunca sabit kalmasına izin verin. Gerekirse fr azaltınAmes / s, bu aşamada fotokopelliğin önlenmesi için.
  3. 200 uM'lik bir nihai konsantrasyon sağlamak için ~ 450 mcL'lik son bölme hacmine dayanan 20 mM'lik bir stoktan gerekli 4 cmc'lik miktarı hesaplayın. Stokların dilüsyonlarını gerektiği gibi yapın.
  4. Dikkatle bölmeden 60 μL Ringer tamponunu alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hesaplanan miktarı 4 cmc'ye bu çözeltiyle seyreltin ve görüntülenecek hücrelerden istenen tepkiyi uyandırmak için bölmeye geri ekleyin.
  5. Hesaplanan miktarı 4 cmc'lik mikrosantrifüj tüpüne ilave edin ve pipetleme ile karıştırın.
  6. Eşzamanlı olarak yoğunluk ölçüsünde etkinlik işaretleyicisini eklerken, görüş alanına solüsyonu hafifçe ekleyin.
  7. İlaç reseptöre bağlanma ve ardından sinyal azalması için zaman tanıyın, ardından etkinlik işaretleyicisini eklerken 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ile 3-6 mL Ringer tamponu ile yıkayın. Oda hacmi 450 &# 181; L ve bir vakuma bağlı, 3-6 mL tampon eklenerek ilacın bulunduğu eski solüsyonun yıkanması ve yerine yeni eklenen solüsyon ile değiştirilmesi sağlanır.
  8. Her tahlil için transfekte edilmiş hücrelerin yeni bir slaydı kullanılarak 100 uM ATP ve 15 uM CPA için 6.1-6.7 tekrarlayın.
  9. Ölçüm tamamlandıktan sonra yoğunluk ölçüm penceresindeki Veri toplama işlemini Basit PCI programında sonlandırın.
  10. Hücrelerin floresan ve parlak görüntülerini alın.
  11. Deney için veri dosyasını açın. Burada, gerekirse yoğunluk değerlerini yeniden hesaplamak için ilgili hücreleri veya bölgeleri tekrar daire haline getirin.
  12. C2C12 miyoblast hücrelerinde in situ K d' yi belirlemek için, bölüm 4.2 ve bölüm 5'de özetlendiği gibi protokolü uygulayın ve bölmede 1 mL, 0 mM Ca 2+ Ringer tamponu koyun.
    1. Hücreleri, hücre içi tamponda 0.002-0.005% saponin ile 15-30 saniye boyunca Permeabilize ederek herhangi birinin hücrelerini boşaltın.Catcher + sitosolda olabilir. Hücreleri, 10 uM ionomisin ile KCl tamponu içinde 3-6 mL 1 mL EGTA ile yıkayın. Bir platoya erişinceye kadar yoğunluğun düşmesine izin verin.
    2. 10 uM ionomisin ile 3-6 mL KCl tamponu ile durulayın ve yoğunluğun dengelenmesine izin verin, ardından adım 2.7'de detaylandırılan her Ca 2+ solüsyonunu ekleyin. Her ilavenin yoğunluğunun bir platoya erişmesine izin verin.
  13. Algılayıcıyı bazal [Ca 2+ ] ölçümü için kalibre etmek için adım 6.12'yi izleyin. Minimum ve maksimum floresans yoğunluğunu elde etmek için adım 2.7'deki EGTA ve 100 mM Ca 2+ tamponunu kullanın.

7. Veri İşleme

  1. Yoğunluk ölçüm verilerinin elektronik tablo dosyasını indirin.
  2. Her bir hücre için verileri taban çizgisi yoğunluğuna (F / F 0 ) göre normalleştirin. Herhangi bir grafik programında zamana karşı normalleştirilmiş verileri çizin.
  3. % Değişimini hesaplamak için, normalleştirilmiş tepe değerini çıkarınUe'dan 1'e çarpın ve 100 ile çarpın. Birden fazla hücre görüntülendiğinde ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
  4. SNR sinyalini hesaplamak için, deneyden kaydedilen görüntü dosyasını ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımında açın ve sinyali, transfekte hücreleri ve gürültüyü, arka planı ölçün. SNR = sinyal / gürültü denklemini kullanarak SNR'yi hesaplayın.
  5. Toplanan floresans görüntüleme verilerinden in situ Kd'yi hesaplamak için, her Ca2 + konsantrasyonunun ve EGTA'nın (0 mM Ca2 + ) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verisinin ortalamasını alın. Θ, göreli yoğunluk, F, herhangi bir noktadaki flüoresan, F min minimum floresan yoğunluğu olduğu durumda, θ = (F - F min ) / (F max - F min ) kullanılarak kesirli doygunluğun (göreli yoğunluk) hesaplanması ve Fmax, t yoğunluğundaki değişimi görmek için maksimum floresans yoğunluğudurMinimum yoğunluğa kıyasla Ca 2+ ilavesi ile sondaj yapar. Herhangi bir grafik ve eğri uydurma programında [Ca 2+ ] karşı göreli yoğunluk verilerini çizin. K d hesaplamak için herhangi bir grafikleme ve eğri uydurma programı için tercüme edilmiş 1: 1 bağlanma denklemi θ = [M T ] / (K d + [M T ]) kullanın. M T toplam metal konsantrasyonudur.
  6. 6.13'te özetlenen kalibrasyondan alınan bazal kalsiyumun miktarını belirlemek için, 1 mM EGTA (Fmin) ve 100 mM Ca2 + (Fmaks) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verilerini ortalaması alın. Bazal kalsiyum hesaplamak için kalibrasyon denklemi [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölüm, ER / SR Ca 2+ değişikliklerini farklı reseptör aracılı yollarla izlemek için optimize edilmiş ER / SR hedef GECI Catcher + kullanılarak önceden açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen sonuçları gösterecektir.

Şekil 1 , 200 uM 4 cmc ile uyarılan RyR boyunca boşaltılmayı göstermektedir. 4 cmc, RyR'nin bir agonistidir. İlacın ilavesi, Catcher + floresan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Catcher + gibi flüoresan probların canlı tek hücreli görüntülemesi, reseptör agonistlerine veya antagonistlerine yanıt olarak her bir hücredeki karmaşık ER / SR Ca 2+ sinyalleme süreçlerini analiz etmek için etkili bir tekniktir. Bu teknik, sırasıyla hem ER hem de sitozolik kalsiyum değişikliklerini izlemek için birlikte Fura-2 için veya Catcher + ve Rhod-2 görüntüsü için gerekli olan gibi, aynı anda birden çok dalga boyunu kullanan görüntüleme için de yararlıdır. Bu protokolde birkaç kr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant tarafından finanse edildi ve NI, FR, BB bursundan CM, CDT bursuna RG'ye bir Yardım Masası ek yardımı ile finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-Kloro-3-metilfenol (4-CmC)Sigma-AldrichC55402
515DCXR dikroik aynaChroma Technology Corp.
Adenozin 5&asal;-trifosfat disodyum tuzu hidratSigma-AldrichA26209
Kalsiyum klorür dihidratEMD Millipore102382
Corning doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları (100 mm)Sigma-AldrichCLS430167
Corning doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları (60 mm)Sigma-AldrichCLS430166
Siklopiazonik Asit (CPA)EMD Millipore239805
D (+) - GlikozACROS Organics41095-0010
Dow Corning 111 Valf Yağlayıcı & MastikWarner Instruments64-0275
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)Sigma-AldrichD7777
Etilenbis (oksietilennitrilo) < br / > tetraasetik Asit (EGTA)ACROS Organics409911000 
Fetal Sığır Serumu (FBS)ThermoFisher26140087
Fisherbrand Kapak Camları 22x40 mmFisher Scientific  12-544B
Hanks' Dengeli Tuzlar (HBSS)Sigma-AldrichH4891
HEPES, Serbest Asit, Moleküler Biyoloji SınıfıEMD Millipore391340
Otofloresan içermeyen Daldırma YağıLeica11513859
İyonomisin, Serbest AsitFisher Scientific50-230-5804
Leica DM6100B soğutmalı EM-CCD kameralı ters mikroskopHamamatsuC9100-13
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher11668019
Lipofektamin 3000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisherL3000015
Düşük Profilli Açık Elmas Banyosu Görüntüleme OdasıWarner InstrumentsRC-26GLP
Magnezyum Klorür HekzahidratFisher ScientificM33-500
Opti-MEMThermoFisher51985034
Potasyum KlorürEMD MilliporePX1405
Potasyum Fosfat, DibazikEMD MilliporePX1570
Potasyum Fosfat, MonobazikEMD MilliporePX1565
SaponinSigma-Aldrich47036
SimplePCI Görüntü Analiz YazılımıHamamatsu
Sodyum BikarbonatFisher ScientificS233-3
Sodyum KlorürFisher ScientificS271-500
Sterivex-GV 0.22 & mikro; m filtreEMD MilliporeSVGVB1010
Polikrom V Xenon lambaFotonik KadarN/A
Tripsin (%2,5), fenol kırmızısı yok (10x)ThermoFisher15090046
NC338059Yok

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  2. Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
  3. Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
  4. Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
  5. Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
  6. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  7. HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
  8. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
  9. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
  10. Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
  11. Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
  12. Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
  13. Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
  14. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
  15. Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
  16. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  17. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  18. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
  19. Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
  20. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  21. Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
  22. Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
  23. Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
  24. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  25. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
  26. Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
  27. Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
  28. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
  29. Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
  30. Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
  31. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  32. Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
  33. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  34. Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CatchER PlusER Kalsiyum Sal n mFloresan MikroskobisiHEK293 H creleriC2C12 H creleriIP3R AktivasyonuRyR AktivasyonuSERCA Pompa nhibisyonuKalsiyum Ge ici Durum l mBiyosens r Ekspresyonu

İlgili makaleler