Yöntem makalesi

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

6.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55824

⸱

15 Eylül 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.

Özet

Endotel tabakası, birçok farklı fonksiyonları kontrol ederek vücuttaki homeostazı korumak için önemlidir. İnflamatuvar yanıtta endotel tabakası tarafından düzenlenmesi verimli bir şekilde zararlı girişleri karşı mücadele ve hasarlı bölgeleri kurtarma yardım çok önemlidir. Endotel hücreleri gibi gram-negatif bakteri membran, lipopolysaccharide (LPS), dış bileşen inflamatuar bir ortam maruz kaldığı zaman hızlı Ccl5, Cxcl1 ve Cxcl10, gibi çözünebilir pro-inflamatuar sitokinlerin ve tetik lökosit dolaşan harekete geçirmek. Buna ek olarak, ifade adezyon moleküllerinin E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1 endotel yüzeyindeki etkileşim ve endotel tabakası ve sonunda ekstravazasyonu iltihaplı doku doğru harekete geçirmek lökosit yapışma sağlar. Lökosit işe aşırı veya kusurlu harekete geçirmek ilgili enflamatuar bozuklukları için açabilir, çünkü bu senaryoya göre endotel fonksiyonları sıkı bir şekilde düzenlenmiş olması gerekir. Bu yana birçok Bu bozuklukların etkili bir tedavi yok, vasküler katman odaklı bir roman stratejileri araştırılmalı. Lökosit işlevini değiştirin roman endotel düzenleyiciler arama için yararlı olan kapsamlı deneyleri öneriyorum. Biz de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile belirli ifade düşman hedefi lökosit işe alım (örneğin, sitokinler, kemokinler ve adezyon molekülleri) kullanarak endotel aktivasyon analiz: gerçek zamanlı nicel Polimeraz zincir reaksiyonu () RT-qPCR), western-blot, Akış Sitometresi ve yapışma deneyleri. Bu yaklaşımlar endotel fonksiyonları inflamatuar bağlamında belirlemek ve yeni tedavi edici stratejiler tasarlamak için potansiyel olarak değerli roman endotel inflamatuar düzenleyiciler karakterize etmek için tarama testleri gerçekleştirmek çok yararlıdır.

Giriş

İltihabı bulaşıcı ajanlarla patojen ortadan kaldırmak ve hasarlı doku onarımı için büyük amacı karşı faydalı bir biyolojik yanıttır. Kronik enfeksiyonlar veya otoimmün hastalıklar, gibi belirli koşullar altında iltihap gidermez. Bunun yerine, sürekli bir uzun süreli bağışıklık giden doku hasarı, fibrozis, işlev ve genel kayıp, Engellilik ve bazı durumlarda ölüm hastanın tepkisine yol lökosit infiltrasyonu ile anormal bir reaksiyonu vardır. İnflamatuar hastalıklar olarak kataloğa insan bu bozuklukların tümü lökosit ekstravazasyonu1,2kontrolü için kan damarlarının ilgilidir.

Endotel hücreleri lökosit kaçakçılığı kontrol ederek inflamatuar yanıt yönetmelikte temel bir rol oynar. Endotel tabakası LPS gibi inflamatuar aracılar için maruz kaldığında, istirahat endotel etkinleştirir ve pro-inflamatuar sitokinlerin (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, vb) ve adezyon molekülleri (E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) ifade bu iyilik lökosit enfeksiyon sitesine dolaşan işe alım. Tarafından yayımlanan sitokinler sonra astarlanmalıdır lökosit haddeleme ve muhabir yapışkanlı meslektaşları ile endotel tabakası ile etkileşimi aracılık: PSGL-1 selektin, α4β1 integrin VCAM-1 ve αLβ2 integrin ICAM-1. Son olarak, lökosit damarlara doğru odağı iltihap3arasında göç eder.

Endotel inflamatuar yanıt düzenlenmesinde önemli rol LPS reseptör, toll benzeri reseptör 4 (TLR4), endotel hücreleri üzerinde sadece hızlı için genetik olarak değiştirilmiş fareler üzerinde gösterilmiştir. Bu TLR4 endotel hayvanlar yanıt vermek bir LPS-aracılı inflamasyon ve enfeksiyon bakteri aşılama sonra oluşturulan tespit ve sonuç olarak enfeksiyon çözünürlük ve vahşi tip fareler4 olarak benzer düzeyde hayatta elde başardık , 5.

İnflamatuar yanıt endotel düzenlenmiştir pathway için lökosit-endotel etkileşim bazı aşamalarında inhibisyonu trans-endotel geçiş ve için daha iyi bir prognoz azaltılması neden olacağından bu öne inflamatuar bağlı hastalıklar. Aslında, çeşitli stratejiler endotel harekete geçirmek ve lökosit-endotel etkileşim hedefleme enflamatuar bozuklukları6,7için bir tedavi olarak bağışıklık hücre ekstravazasyonu engellemek için tasarlanmıştır.

Bu raporu, vitro teknikleri tam olarak karakterize enflamatuar uyarıcı LPS karşılık olarak endotel aktivite ve lökosit harekete geçirmek ve yapışma vasküler katmana rolü için kapsamlı bir grup açıklamak. Bu el yazması kullanılan endotel hücre model fare akciğer endotel hücre satırı (MLEC-04), Hortelano ve ark. tarafından açıklandığı gibi oldu 8. MLEC-04 hücre kültürünü endotel harekete geçirmek9,10çalışmaya uygun bir sistem olarak literatürde doğrulanmış. Araştırma çıkarlara dayanan, bu yaklaşımların kolayca herhangi bir endotel yaygınlaştırılması veya lökosit sistemleri ve inflamatuar profil. Seçilen koşullar endotel parametrelerinde tanımladıktan sonra sistem vasküler harekete geçirmek değerlendirmek için önerilen deneme roman uyuşturucu test edebilirsiniz. İnflamatuar bu bağlamda faiz bileşik ile test endotel hücre hücreleri kontrol şartları karşılaştırılabilir ve ortaya çıkan farklılık gelişme ve ilerleme inflamasyon ilacın prognostik sonuç bilgilendirebilir. Sonuç olarak, yeni uyuşturucu hedefler roman vasküler özgü terapiler inflamatuar ilgili hastalıklara karşı tasarımını etkileyebilecek endotel hücreleri, karakterize etmek için bir sistem teklif ediyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. endotel hücre kültür

    1. 2.5 mL jelatin ile kat 100 mm doku kültürü tabak tabak doku kültürü tedavi çözüm (distile su içinde autoclaved, % 0,1 jelatin) 37 ° C'de 30 dk için; bu iyi gibi gerekli biçime yaygınlaştırılması. Jelatin çözüm Aspire edin ve doku kültürü mahallede kurumasını tabakları bırakın.
  2. Doku kültürü koşulları
    1. MLEC-04 hücrelerin biyolojik bir kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) içinde yetiştirmek. Dulbecco komple medya hücreleri büyümek ' s modifiye kartal orta: %10 Fetal sığır Serum (FBS) ve 100 adet/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin (P/S) ile desteklenmiş besin karışımı F-12 (DMEM/F-12).
    2. Standart Neubauer odası yöntemi tarafından hücreleri saymak ve 100 mm jelatin tedavi plakaları 10 mL tam ortamda, düşük yoğunluklu 2-11 x 10 4 hücreleri/cm 2, MLEC-04 hücreleri ekleyin. İzdiham ulaştığında 1:3 hücreleri bölme.
      Not: Genellikle bu kültür içinde 2-3 gün sonra ortaya çıkar.
    3. Alt kültür 10 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 2 mL tripsin-EDTA çözüm (% 0.25 Tripsin, 5 mM EDTA) ekleyerek takip ve 3 dk. 37 için kuluçkaya ile tabak yıkama tarafından hücreleri ° C.
    4. Tripsin-EDTA reaksiyonu durdurmak ve 10 mL tam medya ekleyerek askıya alınan hücreleri kurtarmak. Spin hücreler (300 x g, 5 dk), süpernatant atmak, komple bir medya ve alt kültür hücresel Pelet uygun şekilde resuspend.

2. LPS tedavi ve arabulucu

  1. MLEC-04 hücreleri aşağıdaki iyi biçime alt kesiştiği yerde, tam medya plaka: 7 x 10 5 hücreleri/iyi 6-şey plakaları ve 2.5 x 10 5 hücreleri/iyi 96-şey Tabaklarda.
  2. Kültür bir hücre kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) 6 h için kuluçkaya. Hücreleri eksik medya (DMEM-F12, P/S) geçin ve gece (ON) eşitlemek için ve hücre etkinliğini azaltmak üzere bırakın.
  3. Medyayı çıkarın ve endotel hücreleri ile (veya olmadan) kuluçka tarafından roman farmakolojik bileşikler test ilaç söz konusu (örneğin DT 10) eksik medya (30 dk, 37 ° C) seyreltilmiş; 1.4 mL ekleyin/iyi 6-şey plaka veya 0,14 için 96-şey plakaları için mL/de).
  4. Hücreleri her tahlil belirtilen süre için kuluçka ortamına (100 ng/mL, son konsantrasyonu) LPS ekleyerek meydan. Bir denetim olarak PBS kullanın.

3. Transkripsiyon profil sayfası aktive endotel RT-qPCR tarafından değerlendirilmesi

  1. 6-şey kültür alt izdiham tohum MLEC-04 hücreleri tabak (7 x 10 5 hücreleri/de). 6 h (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) kuluçkaya ve daha sonra serum açlıktan ölecek devam edin (ON kuluçkaya).
  2. Medyayı çıkarın ve endotel hücre kültürleri ile ilgi uyuşturucu (kuluçkaya 30 dk, 37 ° C) eksik medya seyreltilmiş; 1.4 mL ekleyin/iyi 6-şey plaka (30 dk, 37 ° C) tedavi (veya muamele yapmak).
  3. Hücreleri 100 ng/mL LPS inkübe medyaya (2.3 adımda anlatıldığı gibi) ekleyerek meydan ve iki kez soğuk PBS ile yıkayarak tepki 6 h. durdurmak için kuluçkaya ve plakaları-80 ° C'de örnek işleme kadar devam.
  4. RNA çıkarma
    1. plakaları çözülme ve 1 mL/iyi RNA ayıklama arabellek (% 38 fenol ve 0, 8 M guanidinium isothiocyanate malzemelerin tabloya bakın;) ekleyin. Ajitasyon ve toplamak homogenate 1,5 mL tüpler altında (RT) oda sıcaklığında 30 dakika bırakın.
    2. 200 µL kloroform ekleyip hafifçe RT ve santrifüj (11,600 x g, 15 dk, 4 ° C) 3 dk 15 s. Incubate için kışkırtmak.
    3. Sulu faz için başka bir 1,5 mL tüp aktarın. RT, sonra Santrifüjü (11,600 x g, 4 ° C) bir 10 min kuluçka ardından 500 µL isopropanol ekleyerek RNA çökelti.
    4. Süpernatant atmak ve Pelet % 75 etanol ile yıkama girdap ajitasyon ve sonra Santrifüjü (7,500 x g, 4 ° C).
    5. Pelet kurumasına ve RNA 25 µL saf H 2 O kadar örnek işleme 55 ° C. Keep RNA-80 ° C'de 10 dakika için kuluçka solubilize.
  5. Miktar ve saflık RNA'ın
    1. örnek 260 Absorbans ölçerek RNA konsantrasyon ölçmek bir Spektrofotometre nm (Tablo malzemeleri görmek).
    2. Ölçü at 230 nm ve 280 nm RNA saflık belirlemek için.
      Not: 260/280 oranında protein veya fenol kirlenme gösterir. 2 yakın bir oran kabul edilebilir. 260/230 oranında EDTA, karbonhidrat veya fenol kirletici maddeleri gösterir. 2.0-2.2 arasında değerleri kabul edilebilir.
  6. Kontrol RNA bütünlük
    1. çalıştırmak 2 µg toplam RNA ve bir RNA merdiven üzerinde özel jel denaturing %1,5; bir jel dokümantasyon sistemde görselleştirmek (Tablo malzemeleri görmek).
      Not: Net ve keskin 28S ve 18S rRNA bantları 2:1 oranında sağlam bir RNA gösterir. Kısmen bozulmuş RNA çözümler olarak bulaşmış bir kez.
  7. RT-qPCR
    1. Standart takip tek iplikçikli RNA (cDNA) tamamlayıcı DNA sentez protokol (bakınız Tablo reçetesi) 11.
  8. Değerlendir gen ekspresyonu RT-qPCR tarafından
    1. tepki karışımı her örnek için hazırlamak: Mix 2 µL cDNA, 7 µL floresan bileşik, 300 nM ileri astar ve 300 nM ters astar (Tablo 1) içinde bir Son 13 µL, hacmi ve 96-iyi tepki plakasına eklemek (Tablo malzemeleri görmek).
    2. Optik bir yapışkan kapak, santrifüj (300 x g, 1 dk) ile plaka mühür ve bir gerçek zamanlı PCR sistemde reaksiyon (sıcak başlangıç için 20 95 ° C s 40 döngüsü tarafından takip: 95 ° C 3 s ve 60 ° C 30 s) (Tablo malzemeleri görmek).
    3. Analiz sonuçları karşılaştırmalı yöntem 2 kullanarak göreli Nefelometri tarafından -ΔΔCt temizlik genler gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) veya asidik ribozomal Fosoprotein P0 (36B4) 12 .

4. Akış Sitometresi tarafından endotel harekete geçirmek değerlendirmek

  1. 2 bölümünde açıklanan koşullar takip MLEC-04 hücreleri tedavi ve endotel yüzey proteinleri değişiklikleri Akış Sitometresi tarafından değerlendirmek.
  2. Hücrelerinin LPS stimülasyon açıklanan tripsin-EDTA yöntemi ile 6 h sonra 1.2.3 adım ve 4'te eksik medya ile yıkayın Detach ° C.
  3. Neubauer odası yöntemini kullanarak hücreleri saymak ve 10 x 10 4 hücreleri u-alt 96-şey kalıplara yerleştirin. Santrifüj (300 x g, 5 dk) ve atma bir 180 ° süpernatant yaslama üst bilek alt ve özgün konuma hızlı kurtarma için.
  4. Eksik medya (10 µg/mL, son konsantrasyonu) hücrelere seyreltilmiş seçili antikor 50 µL ekleyip (30 dk, 4 ° C) kuluçkaya.
  5. Hücreleri iki kez w yıkamaAşağıdaki açıklanan yordamı eksik medya 4.3 adım ve ilgili ikincil antikor 10 µg/mL, 50 µL ile kuluçkaya ith birleştiğinde FITC veya benzer eşlenik (30 dk, karanlık bir alanda 4 ° C).
  6. Hücreleri bir kez PBS yıkama tarafından takip eksik medya ile yıkayın. 1 mL pipet ipuçlarını kullanarak 300 µL PBS ile hücreleri kurtarmak ve yer sitometresi tüplerde.
  7. Akış Sitometresi sistemi örnekleri değerlendirmek (Tablo malzemeleri görmek). Hücre nüfus tarafından ileri ve yan Saçılma parametreleri ayarlayın. Faiz nüfusu bir kapı. Gates izotip kontrol ile inkübe hücrelerden negatif kontrol dayalı ayarlayın. Sonuçlar pozitif hücrelerinin yüzde olarak çözümlemek veya demek floresan yoğunluğu 8.

5. Endotel etkinleştirme Western Blot tarafından değerlendirmek

  1. endotel alt izdiham içinde 6-şey kültür tabak (7 x 10 5 hücreleri/de), tohum ve LPS ile 2 bölümünde açıklandığı gibi davranın. İnflamatuvar protein ifade aşağıdaki western blot protokolü tarafından analiz.
  2. Endotel yanıt farklı yönlerini aydınlatmak için farklı zaman noktalarda LPS stimülasyon durdurmak:
    1. inflamatuar proteinler profil LPS stimülasyon 6 h sonra tespit.
    2. Her 15 dakikada bir 60 dk süre boyunca sinyal hücre belirlemek.
  3. İki kez soğuk PBS ile yıkayarak tepki her iki durumda da, durdurmak ve-80 ° C'de örnekleri örnek işleme kadar mağaza.
    4. Her şey (% 1 iyonik olmayan yüzey aktif, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM Sodyum Klorür, sodyum pirofosfat 30 mM, 50 mM sodyum florür, 2.1 mM sodyum orthovanadate,
  4. Lyse hücreleri ve protein çıkarma
    1. ekleyin 200 µL lizis arabelleğe pH 7,6, proteaz inhibitörü kokteyl ile desteklenmiş) (malzemelerin tabloya bakın).
    2. Ajitasyon altında 4 ° C'de 15 dakika wells bir pipet ucu ile scrape ve 1,5 mL tüpler homogenate toplamak için kuluçkaya.
    3. 4'te 11,600 x g de tüpler santrifüj kapasitesi ° C.
    4. Süpernatant temiz 1.5 mL tüpler-80 ° C'de işleme kadar saklayın.
  5. Ölçü standart takip bicinchoninic asit tahlil tarafından protein konsantrasyonu protokol (malzemelerin tabloya bakın) 13.
  6. Toplam protein her örnek için lysate 30 µg % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat, % 10 polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) 14 standart tekniği ile çözmek. 10 mM β-mercaptoethanol (azalan bakiyeli koşullar) ile ya da ezelî örneklerini çalıştırma (sigara azaltarak koşullar) bağlı olarak protein ilgi algılamak için kullanılan antikor.
  7. Ayrılmış proteinlerin polyacrylamide jel polivinilidin difluoride (PVDF) transfer membran ile 0,45 µm gözenek boyutu standart bir işlem kullanarak transfer.
  8. Aktarım sonra membran PBS, % 0,1 polysorbate-20 (PBS-T) ile iki kez yıkayın ve PBS-t için tespit edilen phosphoproteins ya da %5 yağsız kuru süt PBS-t ajitasyon (90 dk, altında toplam proteinler için seyreltilmiş 20 mL % 2 BSA ekleyerek belirsiz bağlayıcı siteleri blok RT).
  9. Seçili antikor uygun engelleme arabellek önerilen konsantrasyon, 10 ml seyreltik ve ajitasyon (ON, 4 ° C) altında membran kuluçkaya. Alternatif olarak, membran mühürlü plastik torbalara koyun ve 5 mL sulandırılmış antikor de kullanılan.
  10. Ertesi gün, membran üç (aşırı PBS-T, 15 dk, RT) yıkayın.
  11. Membran ajitasyon (30 dk, RT) 10 mL ile muhabir ikincil antikor, altında bağlı 1:10,000 uygun engelleme arabelleği, seyreltilmiş horseradish peroksidaz (HRP) için Incubate.
  12. Membran ajitasyon (aşırı PBS-T, 15 dk, RT) altında üç kez yıkayın.
  13. Membran peroksidaz gelişmiş substrat Kemiluminesan (ECL) 0.1 mL/cm 2 1 dk. için kuluçkaya. İki şeffaf plastik levhalar arasındaki süzülmüş zar ve bir Charged-Coupled aygıt fotoğraf makinesi (CCD) içeren Kemiluminesan algılama sistemi yerleştirin.
    1. CCD kamera sinyal ve birikmiş programı ile kayıt resimlere yazılımının belirlemek için kullanın (resimleri görüntülemek birikmiş sinyal her 30 s pozlama toplam 15 dk süreyle).
  14. Kullanıcı Kılavuzu 15 ' te açıklanan protokol sonrası ImageJ yazılımını kullanarak Dansitometresi tarafından grup yoğunluğunu ölçmek.
    1. Numune ImageJ yazılımında açın ve grubun ilgi dikdörtgen Seçim aracıyla seçin.
    2. İlk lane ve basın profil araziler almak için şerit arsa gibi seçin.
    3. Alan normal amortisman seçimi ile doruklarına sınırlandırmak.
    4. Her tepe içini tıklatarak her grup boyutunu ölçmek.
    5. Protein denetim (β-aktin, tübülin vb.) yükleme ile ilgili sonuçları temsil.

6. Faktörü endotel yayımlanan lökosit etkinleştirme yapışma deneyleri tarafından üzerinden değerlendirmek

  1. endotel şartına medyayı edinmek.
    1. 2 bölümünde belirtildiği gibi MLEC-04 hücreleri tedavi ve LPS ile 24 h stimülasyon sonra kültür süpernatant toplamak (100 ng/mL).
    2. Klimalı ortam tedavi MLEC-04 hücreleri ve santrifüj (600 x g) toplamak. Süpernatant 0.5 mL aliquots-80 ° C'de kullanımda kadar devam.
  2. Lökosit yapışma tahlil
    1. 50 µL/iyi (dışında kollajen, 0.1 M Asetik asit içinde seyreltilmiş) PBS içinde seyreltilmiş seçili hücre dışı matriks proteinleri ile 96-şey plakalar kat: fibronektin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL) ve kollajen tip ı (10-40 µg/mL). Bırak ON 4 ° C'de
    2. Kaplamalı medya atmak ve wells ile 150 µL PBS, % 1 BSA ısı inaktive (1 dk, 100 ° C) dik, 90 dakika için üzerinde belirsiz bağlayıcı siteleri blok
    3. Wells PBS ile iki kez yıkayın ve wells için 100 endotel şartına µL, daha önce toplanan medya (Bölüm 6.1) ekleyin.
      Not: Yapışma tahlil gerçekleştirmek için hazır tabaklara.
    4. Kültür biyolojik bir kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) fare monosit makrofaj hücre kültürünü J774 Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI ile), % 10 FBS, % 1 P/S.
      Not: Süspansiyon J774 hücrelerin büyümesine.
    5. J774 hücre içine a 15 mL tüp ve santrifüj (300 x g, 5 min) toplamak. Süpernatant atın ve hücresel Pelet 10 mL serum-Ücretsiz medya ile resuspend. Neubauer odasında hücreleri saymak. Hücreler (300 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve serum-Ücretsiz medya 50 µL medya başına 15 x 10 4 J774 hücre hücrelerde resuspend.
    6. Ekle 15 x 10 4 J774 hücreleri her şey 50 µL serum-Ücretsiz medya ve CO 2 hücre kuluçka 37 ° C'de 1 h ardından 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
    7. Sıcak PBS ekleyerek iki kez, yavaşça kuyuları yıkama; (300 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi ve üst bilekten alt ve özgün konuma hızlı kurtarma için bir 180 ° erken tarafından süpernatant atmak. Ekli cep tamirs % 4 paraformaldehyde (PFA) 100 µL/kuyu içinde PBS ekleyerek ve (10 min, RT) kuluçkaya.
    8. Medya yavaşça atmak ve RT. atma medya adlı 2 min için PBS içinde % 2 metanol hücrelerle hafifçe permeabilize ve % 20 metanol için %90 0.5 kristal violet 50 µL/kuyu ekleyerek hücreleri leke RT. s
    9. Plaka bol su ile yıkayın, aşırı sıvı atmak ve kurumasını bırakın. Dijital kamera için ışık mikroskop birleştiğinde tarafından eklenen hücreleri raporu.
    10. 100 µL/kuyu 0.1 M sodyum sitrat, % 50 etanol ekleyerek boyama hücre sulandırmak. 545 nm ve Absorbans veya yüzdesini % 100 olarak hücre adezyon dikkate alınarak tarafından yapışma rasgele birimleri olarak sonuçlarını ulaştı wells için temsil Absorbans kaplı yüksek ligand konsantrasyonu ile ölçü

7. Test endotel etkinleştirme lökosit-endotel co yapışma tahlil tarafından

  1. MLEC-04 hücreleri 96-şey plakaları 2 bölümünde açıklandığı gibi tedavi ve LPS (6 h, 37 ° C) ile kuluçkaya.
  2. Fluorescently J774 hücre Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE) ile etiketleyin. 6.2.5 yordamda aşağıdaki PBS
    1. yıkama J774 hücrelerde. Hücreler tarafından Neubauer odası yöntemi ve 1 x 10 6 hücre/mL PBS, % 0,1 BSA, resuspend sayımı.
    2. CFSE (5 µM, son konsantrasyonu) hücrelerle 20 dk 37 ° C. Ekle 5 mL eksik medya için kuluçkaya ve (5 dk, 4 ° C) kuluçkaya.
    3. Yıkama bir kez eksik medya ile 6.2.5 içinde açıklandığı gibi., 15 x 10 4 hücreleri/100 µL resuspend ve co yapışma tahlil için devam.
  3. Endotel tedaviden sonra wells üç kez eksik medya ile yıkayın. CFSE-J774 hücreleri (15 x 10 4 hücreleri/100 µL) her endotel kaplı-de ekleyin. 37 60 dk ardından 4 ° C'de 10 dakika plaka kuluçkaya ° C.
  4. Kuyuları yavaşça 6.2.7 içinde açıklandığı gibi yıkayın. ve J774 adezyonu endotel tabakası tarafından aşağıdaki iki yöntemden rapor ısıtılan PBS kullanma:
    1. Lyse 0.1 M Tris-HCl pH 8.8, % 1 SDS hücrelerde (100 µL/de) ve ölçmek CFSE-J774 sinyal fluorometry ile (uyarma/emisyon 492 nm/517 nm =). Sonuçlar floresan yoğunluğu rasgele birimleri veya yapışma açısından olumlu denetim yüzdesi olarak temsil (sinyal eklendi toplam hücrelerden her şey için).
    2. Floresan mikroskop altında görselleştirme tarafından eki CFSE-J774 hücrelerin endotel hücreleri %4 PFA ve rapor düzeltmek (uyarma/emisyon 492 nm/517 nm =).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LPS kaynaklı endotel hücre aktivasyonu RT-qPCR tarafından değerlendirilmesi

Açlıktan serum MLEC-04 hücreleri 100 ng/mL LPS 6 h için tarafından teşvik ve endotel gen ekspresyonu harekete geçirmek işaretleri istirahat durumuna ifade karşılaştırarak RT-qPCR kullanarak değerlendirildi. Şekil 1Aile gösterildiği gibi LPS inkübe MLEC-04 hücreler seçili adezyon molekülleri (E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) inflam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Roman mekanizmaları inflamatuar yanıt yönetmelikte yer keşfetmek için zemin oluşturur kademeli bir teknoloji bu endotel protokolünü açıklar. Bu yaklaşımlar endotel faaliyetinin LPS tarafından uyarılan çalışmaya dayanarak ve lökosit işe inflamatuar yanıt sırasında özellikle dahil kritik adımları değerlendirmek: endotel sitokinler açıklaması, endotel yapışma Vasküler katmana molekülleri ifade ve lökosit yapışma. Endotel parametreleri oluşturulduktan sonra sistem yeni bileşikler endotel fonksiyonları yönetmelikte yer alan a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser "gayri resmi" de Economía y Competitividad (MINECO) ve Instituto de tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (grant sayıya IERPY 1149/16 al; MPY 1410/09 için S. Hortelano); tarafından MINECO Fondo de Investigación tr Salud (FIS) (verir numaraları PI11.0036 ve PI14.0055, S. Hortelano) aracılığıyla. S. Herranz tarafından IERPY 1149/16'dan ISCIII destek verdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
JelatinSigmaG9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Fetal Sığır SerumuSigmaA4503
Penisilin streptomisinLonzaDE17-602E
TripsinLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424RNA ekstraksiyon tamponu
İzopropanolSigma33539
Etanol absolutoPanreac1,310,861,612
Saf H2OQiagen1017979RNAse içermeyen
AgarozPronadisa8020
Agaroz jelleri için lekeInvitrogens33102
SuperScript III Birinci İplikli SynthRT-PCR içinInvitrogen18080051
Hızlı SYBR Green Master MixqPCR MicroAmp için Floresan leke4385610Uygulamalı Biyosistemler
Optik 96İyi Uygulanmış Biyosistemler4346906Plakaları
Falcon353072
Sitometri tüpleriFalcon352054
TX100Panreac212314İyonik olmayan yüzey aktif madde
Tris-HClPanreac1,319,401,211
Sodyum klorürMerck1,064,041,000
Sodyum pirofosfatSigma221368
Sodyum florürSigmaS7920
Sodyum ortovanadatsigma13721-39-6
Proteaz inhibitörü kokteylsigmaP8340
Pierce BCA Protein Test KitiPierce23225Bikinkoninik asit tahlili
ve beta;-merkaptoetanolmerck805,740
PVDF Transfer Membranı, 0.45 &mikro; mThermo Scientific88518
Ara-20Panreac1,623,121,611Polisorbat 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLMilliporeWBKLS0500
FibronektinSigmaF1141
LamininSigmaL2020
Kollajen tip ISigmac8919
Asetik asitPanreac1,310,081,611
Tripan mavisiSigmaT8154
ParaformaldehitSigmaP6148
MetanolPanreac1,310,911,612
Kristal viyoleSigmaHT90132
Sodyum sitratSigmaC7254
Etanol %96Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Sonsuz M200TecanM200Çok modlu mikroplaka okuyucu
Gel Doc 2000Bio-Rad2000Jel dokümantasyon sistemi
StepOnePlusUygulamalı BiyosistemlerStepOnePlusqPCR sistemi
MACSQuant Analizörü 10Miltenyi BiotecAnalizörü 10Sitometri ekipmanı
ChemiDoc MPBio-RadMPKemilüminesans algılama sistemi
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü >Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar<
güçlü > antikorlar< / güçlü >
PECAM-1BD Biosciences55337010 ve mikroda kullanın; g/mL
ICAM-2Biolegend105460210 & mikroda kullanın; g/mL
E-selektinBD Biosciences55374910 & mikroda kullanın; g/mL
VCAM-1BD Biosciences55333010 & mikroda kullanın; g/mL
ICAM-1Becton Dickinson55325010 & mikroda kullanın; g / mL
anti-sıçan IgG-FITCJackson İmmüno Araştırma112-095-00610 & mikro'da kullanın; g/mL
anti ermeni hamster-FITCJackson İmmüno Araştırması127-095-16010 & mikroda kullanın; g/mL
Sıçan IgG izotyop kontrolüInvitrogen1070010 & mikro'da kullanın; g / mL
Ermeni hamsterı IgG izotip kontrolüInvitrogenPA5-3322010 & mikro'da kullanın; g/mL
, P-Iκ Β-&alfa;Hücre Sinyalizasyonu285910 &'de kullanın; g / mL
ve beta; -AktinSigmaA544110 & mikro'da kullanın; g/mL
P-ERKHücre Sinyalizasyonu910110 & mikroda kullanın; g/mL
anti-fare HRPGE HealthcareLNXA931/AE1:10.000'de kullanın
anti-tavşan HRPGE HealthcareLNA934V/AG1:10.000'de kullanın
sıçan önleyici HRPSanta CruzSc-38231:10.000'de kullanın
Reaktifleri qPCR U-bottom 96 kuyulu plakalar için Hızlı için reaktifler

Kaynaklar

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930(2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149(2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RT qPCRWestern BlotAk SitometrisiAdezyon AnalizleriL kosit GSitokin EkspresyonuAdezyon Molek lleriLPS Stim lasyonu

İlgili makaleler