Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vestibüler Schwannoma Araştırması İçin Birleştirilmiş Metodolojik Çerçeve

7.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55827

⸱

20 Haziran 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, vestibüler schwannoma ve Schwann hücresi araştırmalarında birden fazla aşağı akım uygulaması için insan cerrahi numunelerinin toplanması ve işlenmesinin ana hatlarını vermektir.

Özet

Vestibüler schwannomalar, serebelopontin açıdaki en yaygın neoplazmlardır ve tüm intrakranyal büyümelerin% 6-8'ini oluştururlar. Bu tümörler, etkilenen bireylerin% 95'ine kadar sensörinöral işitme kaybına neden olsa da, işitme kaybının altında yatan moleküler mekanizmalar kaçınılmazdır. Bu makale, laboratuarımızda, vestibüler schwannomaların çalışmasına ayrık akışaşağı araştırma uygulamaları için çeşitli birincil insan dokusu örneklerinin toplanmasını ve işlenmesini kolaylaştırmak için kurulmuş olan adımları özetlemektedir. Özellikle, bu çalışma, cerrahi numunelerdeki Schwann ve schwannoma hücrelerinin toplanması, işlenmesi ve kültürü için birleşik bir metodolojik çerçeve tanımlamaktadır. Bu, şu anki araştırmalar için gerekli görülen paralel proses adımlarıyla bütünleşmiştir: tümör ve sinir salgılarının toplanması, RNA'nın korunması ve toplanan dokulardan protein ekstraksiyonu, bölümlerin hazırlanması için doku fiksasyonu,Primer insan hücrelerinin gen tedavisine uygulanması için adeno-ilişkili virüslere maruz kalması. Ek olarak, bu çalışma, bu tümörü, iç kulaktan ve perilymftten insan sensory epitelini elde etmek için eşsiz bir fırsat olarak toplamak için translabyrinthine cerrahi yaklaşımı vurgular. Deneysel kaliteyi artırmak için ipuçları sağlanmaktadır ve vurgulanılan yaygın tuzaklar bulunmaktadır.

Giriş

Vestibüler schwannomalar (VS), her 100.000 kişiden 1 tanesinde serebellopontin açılarının en sık rastlanan neoplazmıdır. Metastatik olmamasına rağmen, bu tümörler bir hastanın yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Etkilenen kişiler genellikle işitme kaybı, kulak çınlaması ve işitme hissi ile yaşar. Belirtileri, tümör büyüdükçe denge sorunları, yüz felci ve diğer kraniyal sinir fonksiyonlarının bozulmasına yol açarak giderek zayıflamaya başlar. Beyin sapı kompresyonuna bağlı yaşamı tehdit eden komplikasyonlar da oluşabilir 7 .

VS için yönetim seçenekleri esasen statik tümörleri beklemek ve stereotaktik radyasyon tedavisi veya büyümekte olan tümörler için cerrahi rezeksiyon ile sınırlıdır 8. Araştırmaya bağlı hastanelerde bu tümörlerin cerrahi olarak çıkarılması, hasta ameliyatları sırasında toplanan taze tümör dokusunu edinme ve analiz etme olanağı sunar. Translabirüsin rezeksiyonu olan, VS'ye spesifik bir cerrahi yaklaşım dahili kulaktan ve perilymfden değerli insan sensoryum epiteline ulaşmayı sağlayabilir.

VS'ler periferik bir duyu sinirinden ( yani, vestibüler sinir) kaynaklandığından VS ile ilişkili gözlemlerin, insan büyük auriküler sinir (GAN) gibi uygun bir kontrol sinirinden elde edilen gözlemlerle karşılaştırılması önemlidir. Sağlıklı GAN'lar parotidektomi veya boyun diseksiyonu sırasında düzenli olarak feda edilir ve sağlıklı Schwann hücre fizyolojisi için sağlam modeller olarak kullanılabilir 9 .

Sporadik VS'nin tedavisi veya önlenmesi için FDA onaylı herhangi bir ilaç bulunmadığından, araştırmacıların altta yatan moleküler meşeyi aydınlatması zorunludurTerapötik hedefleri belirlemek için hastalığın nismleri. VS patogenezinde rol oynadığı gösterilen proteinler merlin, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), siklooksigenaz 2 (COX-2), nükleer faktör kappa B (NF-κB), tümör nekroz faktör alfa (TNF-alfa) , Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve ilgili sinyal molekülleri olan 10,11,12,13,14,15,16,17 .

Yakın zamandaki ilerlemeler, birincil insan vestibüler schwannomaları ve sağlıklı sinir dokularının toplanması, işlenmesi, kültürü ve alt başlarında araştırılması için protokoller geliştirilmiş ve geliştirilmiş 18,19. Bununla birlikte, mevcut protokollerin çoğunun, preparatın( Örn . Tek başına hücre kültürü) için bu tür dokuların atılması. Bu makale, hücre tipi-spesifik kültür, protein ekstraksiyonu, RNA korunumu, tümör salgı toplama ve doku fiksasyonu gibi birçok alt akış uygulamaları için tek bir birincil insan VS veya GAN örneğinin aynı anda işlenmesi için birleşik bir metodolojik çerçeve sunmaktadır. Bu çalışma ayrıca, translabyrinthine VS reseksiyonu esnasında insan beyin-omurilik sıvısının (CSF) ve perilymfinin cerrahi olarak toplanması ve işlenmesi hakkında detaylı bilgi vermektedir, çünkü bu yakından ilişkili dokular VS için biyolojik belirteç kaynakları olarak hizmet edebilir. Sonunda, bu protokol, gen terapisinde kullanılmak üzere bu dokunun yeni bir uygulaması olan kültürdeki birincil insan VS hücrelerinin viral iletimi için adımlar sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm numunelerin toplanması için yazılı izin, ameliyattan önce elde edilmiş ve deneyler Dünya Tıp Birliği Etik İlkelerine (Helsinki Deklarasyonu) göre yapılmıştır. Çalışma protokolünün tüm bölümleri Massachusetts Göz ve Kulak ve Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.

NOT: Aşağıdaki 1-7. Bölümler, birincil bir insan VS veya GAN numunesinin ameliyat odasından alınması üzerine sırayla gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmıştır. İşleme her zaman bölüm 1 ile başlamalıdır. Daha sonra bir kural olarak önce RNA korunmalıdır (bölüm 2), ardından sekresyonların toplanması (bölüm 3) ve protein ekstraksiyonu (bölüm 4) için doku hazırlanmalıdır. Kültürlenecek doku (VS için bölüm 5, GAN için bölüm 6) bölüm 2, 3 ve 4 gerçekleştirilirken ilave kültür ortamında oturabilir. Kesit için doku fiksasyonu (bölüm 7) çok kısadır ve cHerhangi bir santrifüj adımı sırasında gerçekleştirilebilir. Bölüm 8 (perilymf işleme) ve bölüm 9 (BOS işleme), translabyrinthine VS rezeksiyon sırasında operasyon odasından perilymf veya CSF alındığında uygulanabilir. Bölüm 10 (viral transdüksiyon) kültürde büyüyen VS veya Schwann hücreleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

1. Cerrahi Bir Numunenin Hazırlanması ve Alındığı

NOT: Aşağıdaki adımlar, doku kültürü kapağı veya laminer akış davlumbazı gibi steril bir ortamda gerçekleştirilmelidir. Temel steril teknik hakkında bilgi sahibi olması beklenir.

  1. Primer insan VS veya Schwann hücre kültürü için ortam hazırlanması
    1. 37 ° C'lik bir su banyosu içinde 50 mL'lik bir dondurulmuş fetüs sığır serumu (FBS) parçasını çözün.
    2. 5 mL penisilin / streptomisin karışımı 500 mL'lik bir şişe DMEM / F-12'ye ilave edilerek 1: 100'lük nihai bir seyreltme elde edilir.
    3. 50 mL çözülmüş FBS'yi 500 mL'lik bir şişe DMEM / F-12'ye ilave edin,1:10 nihai seyreltme ile sonuçlanır.
    4. Şişeye tarih, araştırmacı baş harfleri ve ek bilgi ( örn. % 1 P / S,% 10 FBS) yazın.
    5. Yeni kültür ortamını buzdolabına yerleştirin (4 ° C).
  2. VS veya GAN örneğinin alındığı ve temizlendiği
    1. Ameliyathanede yeni hasat edilen VS veya GAN numunesini bir numune kabındaki steril tuzlu suya yerleştirin. Örneği buz üzerinde ameliyat odasından laboratuarda laminer bir akış kapağına nakledin.
      NOT: Örneklemin boyutları ve ağırlıkları, ilgili tümörün büyüklüğüne veya eksize edilen sinir miktarına bağlı olarak hastalar arasında önemli derecede farklılık gösterir.
    2. Dondurucudan hiyalüronidaz (25,000 U / mL) ve kollajenazın (3,200 U / mL) stok solüsyonu numunelerini çıkartın ve enzimlerin oda sıcaklığında çözülmesine izin verin (numunenin mi olup olmadığına bağlı olarak adım 5.1.4 veya 6.1.6 için gerekli) Bir VS veya bir GAN).
      NOT: liyofilize enzimlerin yeniden süspansiyonu iS ürün bilgi sayfalarında ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kollajenaz, 0.02 M fosfat tamponu (pH 7.0), 77 mM NaCl ve% 1 0.01 mg / mL sığır serum albüminden oluşan bir solüsyonda herhangi bir kalsiyumsuz dengeli tuz solüsyonu ve hiyalüronidaz içinde yeniden askıya alınabilir. Her bir liyofilize enzim için spesifik aktivite partiye göre değişir ve yeniden askıya alınmadan önce doğrulanmalıdır.
    3. 1.4 mL 1x steril PBS ile doldurulmuş üç adet 1.5 mL tüp kullanılarak, VS veya GAN örneğini üç kez yıkayın. Steril forseps ile numuneyi dikkatle tüpten tüpe aktarın. Her tüp örneği içerdikten sonra kapatın ve yıkamak için hafifçe çalkalayın.
      NOT: 1.5 mL tüplerin taşmasını önlemek için, tümör parçası büyükse, tüp başına 1.4 mL'den daha az PBS kullanılabilir.
    4. Numuneyi kuru bir 60 mm Petri kabına koyun ve tüm ölü dokuları ( yani çoğunlukla beyaz veya opak renkte olan koterleştirilmiş bölümleri) ve belirgin kan damarları olan alanları çıkarmak için forseps kullanın.
    5. F'yi kullanProteaz ekstraksiyonu, salgı toplama, fiksasyon ve hücre kültürü için numuneyi ayrı parçalara bölmek için bir omurga veya orkestra veya bıçak bıçağı (bkz. Aşağıda 2-6).
    6. 5-8 mL soğuk, ilave DMEM / F-12 ortamı içeren yeni bir 60 mm'lik kültür çanağına hücre kültürü (bölüm 5/6) için belirlenmiş numunenin parçasını aktarın (alternatif olarak birinci kültür çanağının kapağı Bu adım için kullanılır).
      NOT: Gerekli DMEM / F-12 ortamı miktarı (adım 1.1'den itibaren) tümörün veya sinirin boyutuna bağlıdır, ancak 5 ila 8 mL arasında olmalıdır. Bu parça sonraki adımlar yapılırken kültür ortamında oturabilir.

2. VS ve GAN Doku Dokularının Korunması (İnsan Vücut Duyu İçin de geçerlidir)

  1. Laminer akış kaputunun altında, yeni bir 1.5 mL tüp için 1-1.2 mL RNA stabilizasyon solüsyonu aktarın.
  2. Örneği PBS ile yıkadıktan (basamak 1.2.3) sonra, küçük pastayı kısaca daldırınRNA stabilizasyonu çözeltisine RNA korunması için belirlenen doku (yaklaşık 3 mm 3 VS veya 5 mm uzunluk GAN) eklenir. Numunenin çözeltiye tamamen batırıldığından emin olun.
  3. Yeni bir 1.5 mL tüp hazırlayın ve etiketleyin. Numuneyi RNA stabilizasyon çözeltisinden alın, yeni tüpe aktarın ve -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.

3. VS ve GAN Salgılarının Toplanması

  1. 1.gün
    1. PBS ile numuneyi yıkadıktan sonra (basamak 1.2.3), salgılar toplamak için belirlenmiş VS veya GAN parçasını boş bir 1.5 mL tüp içine yerleştirin.
    2. Her iki tüp içine iki ilave 1.5 mL tüp hazırlayın ve DMEM 500 mcL pipetleyin (FBS ile takviye edilmemiştir).
      NOT: DMEM'in ilk tüpü tümör sekresyonlarını toplamak için kullanılır ve DMEM'nin ikinci tüpü eşleşen bir kontrol görevi görecektir. Sekresyonlar DMEM'de toplanabilir, herhangi bir başka tipik kültür ortamı değilSerum veya PBS ile takviye edilmiştir.
    3. DMEM içeren tüplerden birini kalibre edilmiş bir dijital ölçek üzerine yerleştirin. Ölüyü tartın, böylece tüp ölçeğin üzerine oturduğunda 0 mg okur.
    4. Ölçekten DMEM tüpünü çıkarın, sekresyonların toplanması için belirlenmiş olan parçayı tüpün içine yerleştirin ve tartın. Tek dokunun ağırlığını tek başına temsil eden sonucu not edin.
    5. Laminer bir akış davlumbazı altında, tüp içindeki DMEM hacmini 10 mg örnek başına 100 uL'ye ayarlayın.
    6. Doku örneğini ve onun eşleşen kontrolünü (DMEM tek başına) içeren tüpü, bu deney için planlarla tutarlı bir süre boyunca inkübatöre (37 ° C,% 5 CO 2 ) yerleştirin. Biyolojik açıdan yararlı miktarda tümör veya sinir sekresyonu toplamak için dokuyu en az 72 saat inkübe edin 15 .
  2. 4. Gün
    1. 72 saat inkübasyondan sonra, sekresyon içeren ortamı1 mL'lik bir pipet kullanılarak numune ( örn., Doku-şartlandırılmış ortam). Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerini önlemek için, planlanan aşağı akış analizlerine göre ortamı yeni tüplere bölün ( örn., Her biri 50 mcL gerektiren 4 oyuklu bir ELISA çalıştırmak için, 210 uL'lik alikotlar hazırlanabilir).
    2. Gerekirse, daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu gibi ek analizler için -80 ° C'de orijinal tüp içinde kalan doku parçasını (halihazırda 1. Gün'de etiketli) dondurun.
    3. Aşağı akım uygulamaları başlatılana kadar doku, salgıları ve kontrol DMEM'i -80 ° C dondurucuda saklayın ( örn., ELISA, LC-MS / MS, sitokin dizileri, vb. ).

4. VS veya GAN Dokusundan Protein Ekstraksiyonu

  1. Güçlendirilmiş RIPA tamponunun hazırlanması
    1. 15 mL'lik bir tüpte 10 ml RIPA tamponuna bir tablet fosfataz inhibitörü ve bir tablet proteaz inhibitörü ilave edin; Bu güçlendirilmişRIPA tamponu.
      NOT: RIPA tamponunu 4 ° C'de saklayın ve tabletleri kullanımdan hemen önce ekleyin.
  2. Protein ekstraksiyonu
    1. 210 uL kuvvetlendirilmiş RIPA tamponu (adım 4.1.1) yeni bir 1.5 mL tüp içine aktarın.
    2. PBS ile numuneyi yıkadıktan sonra (basamak 1.2.3), protein ekstraksiyonu için belirlenen küçük doku parçasını (yaklaşık 3 mm 3 VS veya 5 mm uzunluğunda GAN) RIPA tamponu içeren tüp üzerine aktarın ve buz üzerine yerleştirin En az 10 dakika boyunca. Fosforile protein formları üzerinde çalışılıyorsa, RIPA tamponunu proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile destekleyin 14 . Bu arada, fiksasyon (bölüm 7) gibi doku işlemenin diğer bileşenleri için adımlar da yapılabilir.
    3. Santrifüjü 4 ° C'ye kadar önceden soğutun.
    4. Plastik bir havyandan kullanarak, RIPA tampon içeren tüp içindeki dokuyu homojenize edin. % 10 genlikte 10-15 saniye boyunca dokuyu sonike edin. NumuneninSonication sırasında bile buz üzerinde kalır.
    5. 15,000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
    6. Süpernatantı 50 μL'lik artışlarla yeni 0.5 mL tüplere bölün (amaçlanan aşağı akış uygulamalarına bağlı olarak, herhangi bir artış boyutu seçilebilir).
    7. İndirgenmiş uygulamalar başlatılana kadar protein lizatının alikotları bir -80 ° C dondurucuda saklanır ( örn., ELISA veya Western blots) 20 , 21 .

5. Birincil İnsan VS Kültürü

  1. 1.gün
    1. Hücre kültürü için atanan VS dokusunu (her biri bir elinde bir çift forseps kullanarak yaklaşık 1 mm3 parçaya kültür ortamında oturmuş olan, adım 1.2.6'da anlatıldığı gibi) ayın.
    2. 10 mL serolojik pipet ile tümör parçası içeren orta aspire ve 15 ml konik tüp tüm içeriği aktarmak.
    3. At 3 dak. Santrifüj1,000 xg ve 25 ° C.
    4. Kollajenaz 250 mcL (son konsantrasyon: 160 U / mL) ve hiyalüronidaz (son konsantrasyon: 250 U / mL) 50 mcL ile desteklenmiş DMEM / F-12 orta 4.7 mL birleştirerek yeni bir 60 mm kültür çanak içinde parçalanma orta hazırlayın. , 5 mL'lik nihai bir hacim için.
      NOT: Her iki enzim de bir -20 ° C dondurucuda saklanmalıdır, ancak bu ortamın hazırlanmasından önce çözülmelidir (basamak 1.2.2).
    5. Santrifüjden sonra, tümör parçaları konik tüpün tabanında bir pelet oluşturacaktır. Dikkatle pipetle alın ve süpernatanı atın.
    6. Yeni üretilmiş enzim içeren çözündürme ortamının 2 mL'sini (adım 5.1.4) tümör peletine ilave edin. Doku harekete geçirmek ve tümör içeren madde 60 mm kültür çanak aktarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlemek.
    7. Kültür çanağını inkübatöre (37 ° C,% 5 CO 2 ) 18 saat boyunca yerleştirin.
  2. 2. gün
    1. Sıcak D37 ° C su banyosunda% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin (adım 1.1'de hazırlanan) ile desteklenmiş MEM / F-12 ortamı.
    2. Kuluçka makinesinden VS kültürü içeren petri kabını çıkartın (adım 5.1.7). 6 mL'lik şırıngaya tutturulmuş 22 G'lik bir iğne kullanarak, kültürü içeren ortamı aspire edin ve yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın.
    3. 1,000 xg ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Bu arada, gerekli sayıda poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lamelleri 24 oyuklu bir kültür plakasına yerleştirmek için steril forseps kullanın.
      NOT: Kültüre edilecek kuyuların sayısı numunenin büyüklüğüne bağlıdır; Yaklaşık 24-32 kuyu 1 cm3'lük bir tümörden kültürlenebilir, bu nedenle daha küçük tümörler için 8-16 kuyu kültür hücresi için planlama uygundur.
    5. Santrifüjden sonra, süpernatantı atın ( örn., Enzimle zenginleştirilmiş ortam) ve kalan hücre pelletini taze, ilave DMEM / F-12 ortamında tekrar bekletin, ön ısıtınAdım 5.2.1'de
      NOT: Peleti tekrar süspansiyon haline getirme hacmi, planlanan kuyu başına 1 mL orta miktarını tahmin eden 5.2.4. Adımda planlanan kuyu sayısına göre belirlenir.
    6. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 2 mL yeniden asılmış hücre ortamını (adım 5.2.5) aspire edin. 24-yuvalı plakanın her bir hazırlanmış kuyusuna 1 mL tümör hücresi ihtiva eden ortam yatırın.
    7. Tümör hücresi süspansiyonu tüm hazır çukurlara eşit bir şekilde bölünene kadar, tüm hücre içeren ortamı (planlanan her bir kuyuya 1 mL'lik bir artışla 2 mL'lik artışlarla aspire ederek) aspire ve tortulaşmaya devam edin.
    8. 24-yuvalı plakayı gece boyunca 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
  3. 3. Gün
    1. Kuyuların tabanında önemli öpler bulunursa, yapışkan hücrelerin yok edilmemesine dikkat ederek yeni eklenmiş DMEM / F-12 kültür ortamı için her gözün ortamını dikkatlice değiştirin. Değilse plakayı inkübatöre geri götürün veE orta 5. Gününde ilk kez.
  4. 5-7 ve sonrasında günler
    1. Ortamı her 3 günde değiştir.
      NOT: Birincil insan VS ve GAN hücreleri genellikle, 14 yaşlarında veya yaklaşık 14 günlük yaş altındaki uygulamalarda kullanılıncaya kadar kültürde muhafaza edilir. Kültür saflığı bu 19'dan sonra azalır.

6. Birincil İnsan GAN Kültürü

  1. 1.gün
    1. Bir diseksiyon mikroskopu altında, fasikülleri GAN kültürü için belirlenmiş dokudan (1.2.6 no'lu adımda ana hatlarıyla belirtildiği gibi kültür ortamında oturur) izole edin.
      1. Felçleri epineuryum ve fibröz kılıftan ayırarak perineuryumdan çekerek fasikülleri ayırın. 5 forseps ile epineuryumu kapamaktadır. 3 forseps.
    2. Fasiküller çevresindeki epineuryumdan yeterince izole edildikten sonra, 2 mL taze sup içeren yeni bir kültür çanağına aktarınOrta seviye orta.
    3. Bıçak bıçağını kullanarak fasikülleri 1 ila 2 mm'lik kesitlere kesin.
    4. 15 mL'lik tüpün toplam hacmi 5 mL'ye gelecek şekilde 3 mL taze eklenmiş kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir tüp içine küçük fascicle parçalarını ve çevre maddesini pipetleyin.
    5. Numuneyi 1,000 xg ve 25 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin.
    6. Bu arada, 5 mL'lik nihai bir hacim için 4.7 mL eklenmiş DMEM / F-12 orta, 250 μL kollajenaz ve 50 uL hiyalüronidaz'ı birleştirerek yeni bir 60 mm Petri kabında bir Schwann hücre kültürü ortamı yapın.
      NOT: Her iki enzimi de -20 ° C'de saklayın; Bu ortamı hazırlamadan önce oda sıcaklığında çözdürün (basamak 1.2.2).
    7. Numunenin santrifüj edildikten sonra, fasiküller konik tüpteki küçük bir pelet haline yoğunlaşacaktır. Süpernatanı atın.
    8. Yeni üretilmiş enzim içeren çözündürme ortamı (adım 6.1.6) 2 mL'si sinir topuğuna ekleyin. Pipetle ve dDokuyu harekete geçirmek ve yeni bir 60 mm'lik kültür tabakına aktarmak için birkaç kez kendi.
    9. Çanağı inkübatöre (37 ° C,% 5 CO 2 ) 20-22 saat bekletin.
      NOT: Bu, VS numuneleri için gerekli olana kıyasla daha uzun inkübasyondur (adım 5.1.7).
  2. 2. gün
    1. 37 ° C'lik bir su banyosunda sıcak takviyeli DMEM / F-12 ortamı.
    2. 6 mL'lik şırıngaya bağlı 22 G'lik bir iğne kullanarak, hücre kültürü içeren ortamı aspire edin ve yeni bir 15 mL konik tüp içine aktarın.
    3. 1,000 xg ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Süpernatantı atın ve numuneyi, önceden ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM / F-12 kültür ortamında tekrar süspanse edin.
    5. 24 yuvalı bir kültür plakasının oyuklarına kaplanmış lamelleri gerekli sayıda yerleştirmek için steril forseps kullanın.
      NOT: 1 cm'lik sinir örneği başına iki kültür hücresi kuyusunun hesaplanması, sağlam kültür gelişimini destekler.
    6. Her biri için 1 mL kültür içeren ortam ekleyin24 oyuklu plakada iyi belirlenmiştir.
    7. 37 ° C'de ve% 5 CO 2 inkübatör içine 24 delikli plaka yerleştirin.
  3. 3. Gün
    1. Kuyularda önemli öpler bulunursa, yapışkan hücreleri uzaklaştırmamaya dikkat ederek ortamı yeni eklenmiş DMEM / F-12 kültür ortamı ile dikkatlice değiştirin. Değilse, plakayı inkübatöre geri götürün ve 5. günü Medyayı ilk kez değiştirin.
  4. 5-7 ve sonrasında günler
    1. Ortamı her 3 günde değiştir.

VS & GAN Doku Düzeltme

  1. Yeni bir 1.5 mL tüp içine 1-1.2 mL% 4 paraformaldehid (PFA; DİKKAT) pipetleyin.
  2. Tümör veya siniri PBS ile yıkadıktan sonra (basamak 1.2.3), küçük bir doku parçasını (yaklaşık 3 mm 3 VS veya 5 mm uzunluğunda GAN)% 4 PFA içine aktarın ve tüpü 4 ° C'de çalkalayıcıya yerleştirin C. Numunenin tamamen içine batırılmış olduğundan emin olunO çözümü.
  3. En az 2 saat fiksasyondan sonra, tüpü çalkalayıcıdan alın ve daha sonraki işleme tabi tutun ( örn., Sonraki immünohistokimya veya immünofloresans için parafine yerleştirme veya optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT)) 22,23,24. Alternatif olarak doku, daha önce tarif edildiği gibi 25 , 26 gibi hızlı dondurulabilir.

8. Translabyrinthine VS Rezeksiyon Sırasında İnsan Perilermfinin Toplanması ve Depolanması

  1. Buz üzerine üç steril 1.5 mL tüp yerleştirin.
    NOT: Bir tüp, kontaminasyon durumunda yedek olarak tutulacaktır.
  2. Bir 1.5 mL tübü, 0.22 um'lik bir filtre kullanılarak iki kez filtrelenmiş yaklaşık 1.2 mL PBS çözeltisi ile doldurun.
    NOT: Bir translabirinthin VS rezeksiyonu sırasında perilymf toplamak için, cerrah ilk önce cerrahininCal alanına kemik tozu, kan veya salin bulunmaz. Cerrah, bu amaçla dominant olmayan elinde bir Schuknecht 21 veya 24 G emme tüpü kullanabilir.
    Perilymph çıkarmak için tipik bir yer lateral semisirküler kanaldır (ancak cerrahın tercihine bağlı olarak posterior semisirküler kanala veya yuvarlak pencere membranına da erişilebilir). Seminal kanalın mavi çizgisini ( yani, membranöz labirenti) tanımlamak için cerrah, labirentin kemiğini bir elmas buruyla (sürekli emme irrigasyonu kullanırken) dikkatle kaldırmalıdır. Semisirküler kanal, 1 mL tüberkülin enjektörüne bağlı uzun bir 27 G iğne kullanılarak mavi çizgi boyunca nüfuz eder.
  3. Cerrahtan nazikçe küçük bir periksele aspirasyon yapmasını ve daha sonra cerrahi hemşiresine şırınga ve bağlı iğne geçirmesini isteyin.
    NOT: Tipik olarak, bir perilymph düşümü veya daha azı toplanır. Gözlenen hacim daha büyükse, numune muhtemelen diğer f ile kontamine olurakışkanı.
  4. Hazırlanan boş 1.5 mL tüpünü açın ve tüp kullanmadan önce doğrudan PBS ile doldurun. Tüp kapaklarını açarken içerisine dokunmamaya dikkat edin.
  5. Cerrahi hemşiresinden şırıngayı ve bağlı iğneyi alın ve sıvıyı boş boruya tamamen boşaltın, iğne ile tüpün kendisine dokunmamaya özen gösterin.
  6. İğneyi dikkatle şırıngadan ayırın. İğne ucunu kirletmeyin ve bir elinizle tutmaya devam edin.
    NOT: Çok küçük bir perilymik hacim toplanmıştır, bu nedenle iğnenin uzun ucunda bir miktar sıvı kalabilir.
  7. Diğer elinizle şırınganın gövdesine hazırlanan tüpten 0.2 mL'lik filtrelenmiş PBS solüsyonunu emmek için şırınganın kendisini (iğne olmadan) kullanın.
  8. İğneyi tekrar şırıngaya takın. İğne ucunu boşaltmak için steril PBS kullanarak şırıngayı perilymph içeren tüp içine tamamen boşaltın.
  9. Perilymf ve PBS içeren tüpü ve yeri kapatın Buz üzerinde.
  10. İğneyi keskin bir kapta imha ediniz.
  11. Perilymph içeren tüpü mümkün olan en kısa sürede -80 ° C dondurucuya yerleştirin.

9. İnsan BOS'u Toplama ve Depolama

  1. Buz üzerinde üç (veya daha fazla) steril 1.5 mL tüp yerleştirin.
    NOT: Bir tüp, kontaminasyon veya beklenenden daha büyük bir numune hacmi durumunda yedek olacaktır.
  2. Dura materyalini açtıktan sonra cerrahtan BOS'u 3 mL enjektörle (ekli bir iğne olmadan) toplamalarını isteyin.
    NOT: Kirlenmeyi önlemek için, dura materyelin açılmasından hemen sonra BOS toplaması yapılmalıdır.
  3. Cerrahtan şırıngayı cerrahi hemşiresine vermesini isteyin.
  4. Şırıngayı cerrahi hemşiresinden alın ve gerekli miktarda BOS'u tüpe (leri) tamamen boşaltın.
  5. Tüpleri kapatın ve buz üzerine yerleştirin.
  6. Tüpleri mümkün olduğunca çabuk -80 ° C dondurucuya yerleştirin.
E "> 10. Birincil VS hücreleri için viral transdüksiyon deneyleri

  1. Viral stok konsantrasyonunu bir referans olarak kullanarak, önerilen dönüştürme deneyi için gerekli olan istenen genom sayısı (gc) sayısını ve enfeksiyonun çoğunu (MOI) hesaplayın; Virüs stoğu direkt olarak eklenmiş kültür ortamına seyreltilebilir.
    NOT: Primer hücre transdüksiyonuna uygun herhangi bir viral vektör kullanılabilir; Bkz. Landegger ve ark. (2017), altı farklı adeno-ilişkili virüs serotipinin ayrıntılı bir karşılaştırması için 27 . Ek olarak, birincil insan hücrelerini kültürlerken, hücre sayıları lamelleri kaplamadan önce tipik olarak belirlenmez. Birincil VS hücreleri, güvenilir bir MOI hesabı için, iyi bir faz kontrast mikroskopu kullanılarak kuyu başına yapışan hücrelerin sayısı tahmin edilebilecek şekilde, tripsinasyon ve pasaja iyi cevap vermez. Alternatif olarak, hücreler konfluansa yakındırlarsa, sayıları standart hücre yoğunluk değerleri kullanılarak güvenilir şekilde tahmin edilebilir24 oyuklu bir plaka ( örneğin, oyuk başına 5 x 104 hücre).
  2. Laminer bir akış davlumbazının altında, arzu edilen miktarda virüs içeren 15 mL'lik bir konik laboratuar tüpünde, 1 mL'lik virüs içeren ortamın, transjenlenecek her bir hücre kuyusu için hazırlandığı şekilde ilave edilen ortam hazırlayın. Virüs içeren ortamı pipetle hafifçe ve iyice karıştırın.
  3. Steril forseps kullanarak, orijinal 24 kuyucuklu plakadan birincil VS hücreleri (adım 5.2.8) içeren lamelleri yeni bir 24 delikli plakaya aktarın. Her bir lamelin transferinden sonra, 1 mL virüs içeren ortam ekleyin. Hücrelerin virüs ile eşit olarak kaplanmasını sağlamak için plakayı her seferinde karıştırın.
  4. Planlanan deney süresince 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
    NOT: 48-120 saat arasında değişen inkübasyonlar, umut verici iletim sonuçları 27 gösterdi .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Beşinci bölümde belirtildiği gibi, kültürde birincil insan VS hücreleri, birçok aşağı akım araştırma uygulamasında hastalıkla ilişkili süreçler için bilgilendirici modeller olarak görülebilir ( Şekil 1 ). Bölüm 6'da yetiştirilen sağlıklı Schwann hücreleri doğrudan ve öğretici bir karşılaştırma noktası sağlar. Aşağıda ana hatlarıyla belirtildiği üzere, bu birleşik metodolojik çerçeveye göre işlenmiş VS'ler ve GAN'lardan elde edilen kapsamlı verile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu el yazması, VS araştırması için birleştirilmiş bir metodolojik çerçeve tanımlamakta ve insan VS ve GAN numunelerinin akış aşağısı araştırma uygulamaları için eş zamanlı işlenmesini özetlemektedir. VS araştırması hassas tıbbın yapıldığı çağa girerken, aynı örneği çok sayıda araştırma sorusuna cevap verebilecek formlarda hazırlamak, bireysel hastalara özgü moleküler, hücresel, genetik ve proteomik görüşlerin keşfedilmesine olanak tanır.

İnsan Schwann hücresi ve VS kültürlerinin saflığı, S10...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (JES ve SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) , Nancy Sayles Günü Vakfı (KMS), Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS) ve Barnes Vakfı (KMS).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Alman Cam LamelCorning354087Veya Corning Laminin (CB-40232) ve Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) ile lameller hazırlayın
CELLSTAR 15 mL Santrifüj Tüpleri, Konik tabanlı, Derecelendirmeli, SterilGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL Santrifüj Tüpleri, Konik tabanlı, Derecelendirmeli, SterilGreiner Bio-One227261
CELLSTAR Hücre Kültürü Çanağı, 60 mmGreiner Bio-One628160
Clostridium histolyticum'dan kollajenaz, Steril filtreliSigma-AldrichC1639
Costar 24 Kuyu Berraklığında TC ile İşlem Görmüş Çoklu Kuyu Plakaları, SterilCorning3526
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, yüksek glikoz, piruvat, glutamin yok, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 Forseps, DumoxelGüzel Bilim Araçları11231-30Kullanmadan önce otoklav
Dumont #5 Forseps, Standart uç, InoxFine Science Tools11251-20Kullanmadan önce otoklav
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgeler, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028Aliquot 50 mL tüplerde ve -20 ° C'de saklayın; Sığır
Testislerinden C dondurucu Hyaluronidaz, Tip I-S, Liyofilize TozSigma-AldrichH3506
Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 ve mikro; m, polietersülfon, 33 mm, sterilEMD MilliporeSLGP033RS
Paraformaldehit, Reaktif Sınıfı, KristalinSigma-AldrichP6148Kullanmadan önce: Çevrimiçi olarak sunulan protokollere dayalı Standart Çalışma Prosedürleri oluşturun
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023Kullanmadan önce otoklav
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL), 100 mLTermo Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP Fosfataz İnhibitör TabletleriRoche04906845001
Pierce Proteaz İnhibitörü TabletleriThermo Fisher Scientific88666
Pipetler ve pipet uçları, 5/10/25 mL
Plastik Homojenizasyon HavaneliE& K ScientificEK-10539
PrecisionGlide İğneleri, 27 G x 1 1/2 inçBD301629
RIPA TamponuBoston BioProductsBP-115
RNAlater (RNA stabilizasyon solüsyonu)Thermo Fisher ScientificAM7021
Güvenli Kilitli Mikrosantrifüj Tüpleri, Polipropilen, 0,5 mLEppendorf022363719Kullanmadan önce otoklav
Safe-Lock Mikrosantrifüj Tüpleri, Polipropilen, 1,5 mLEppendorf022363204Kullanmadan önce otoklav
Tuzlu - %0,9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, bakteriyostatik, 20 mLHospira0409-1966-05
Neşter Bıçakları - #15Güzel Bilim Araçları10015-00
Schuknecht Emme Borusu 24 gaugeBausch + LombN1698 42Cerrahi yaklaşım için kullanışlıdır (yaygın otolojik cerrahi aletlere ek olarak) ve ör. mavi bir cerrahi işaretleyici
Numune Kabı, VEYA steril, 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C Stereo MikroskopZeiss000000-1106-133
Şırınga/İğne Kombinasyonu, Luer-Lok Ucu, 5 mL, 22 G x 1 inç.BD309630
Sadece Tüberkülin Şırıngası, Kayma ucu, 1 mLBD309659
Sadece Tüberkülin Şırıngası, Kayma ucu, 3 mLBD309656
Ultrasonik homojenizatör, 4710 Serisi, CV18 probuCole-ParmerCP25013
, 1.5/2.0 mL Mikrotüpler için Değişken Değişken

Kaynaklar

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215(2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Schwann H creleriPrimer H cre K lt rT m r Salg s ToplamaRNA KorumaProtein EkstraksiyonuDoku FiksasyonuAdeno li kili Vir sTranslabyrinthine Yakla mH cre K lt r Protokol
Vestibüler Schwannoma Araştırması İçin Birleştirilmiş Metodolojik Çerçeve
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.