Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi Drosophila

Summary

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Abstract

Fonksiyonel nöromüsküler devrelerin oluşturulması motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas bağlantılara dayanır. Motor nöronları, çevredeki hücre dışı ortamdan çıkan çok sayıda akson rehberliğine yanıt olarak spesifik yol boyunca gezinmek için büyüme konilerini uzatır. Büyüme konisi hedef tanıma da nöromüsküler özgüllükte kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya protokolü sunmaktadır . Bu protokol, istenen mutant embriyoları sıralamak için bir genotiplendirme prosedürü de dahil olmak üzere birkaç temel adım içerir; Fasciclin II (FasII) antikoru ile embriyoların etiketlenmesi için bir imüno boyama prosedürü; Ve sabit embriyolardan dolgulu preparatların üretilmesi için bir diseksiyon prosedürü. Çevredeki motor akson projeksiyonları ve kas desenleri, fileto embriyoların yassı preparatlarında daha iyi görselleştirilirOle-mount embriyolar. Bu nedenle, FasII antikoru ile boyanmış sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve hedef tanıma için gerekli genleri karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar ve hem fonksiyon kaybı hem de işlev kazanım genetik ekranlarına da uygulanabilir .

Introduction

Embriyonik gelişme esnasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas ve seçici bağlantılar, Drosophila larvalarında normal hareket için gereklidir . Karın hemisiyasyon A2-A7'nin her birinde 30 kas lifinin embriyonik desenlenmesi, evre 16 ¹ ile oluşturulmuştur. Ventral sinir kablosunda üretilen 36 motor nöron, spesifik hedef kasları innerve etmek için aksonları periferiye uzatır. Motor akson yol bulma ve hedef tanıma, bir antikor (fare monoklonal antikor 1D4) ^{3 , 4} ile immünohistokimya ile görselleştirilebilir. Vahşi embriyolardaki motor akson projeksiyon modelleri....

Protocol

1. Hazırlık

1. 0.5 g sığır serum albümini (BSA) ve 0.5 mL t-Oktilfenoksipolietoksietanol (Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL 1X PBS ilave ederek t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) çözeltisi ile 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) Ve en az 30 dakika boyunca karıştırma. 4 ° C'de saklayın. Nispeten taze olduğunda kullanın ve çözeltiyi temiz bir şişeye koyun.
2. 2.5 mL% 16 stok paraformaldehid solüsyonu ve 1 mL 10x PBS'den 6.5 mL deiyonize suya 10 mL% 4 paraformaldehit yapın. 4 ° C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
   DİKKAT: Son derece toksik olduğu için paraformaldehit çözeltisiyle cilt temasından kaçının.
3. 1 mL DMSO'....

Results

Sinir gelişiminde motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki kesin bağlantılar, seçici akson akson iticiliğine ve belirli seçim noktalarında hedef tanımaya bağlıdır. Drosophila'da , motor aksonlar arasındaki seçici itme , Sema-1a, Sema-2a ve Sema-2b ^{8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 dahil.......}

Discussion

Motor akson rehberliğinde kusurların ayrıntıları, DAB lekeli embriyoların örtülü hazırlanmasıyla, flüoresan etiketli olanların konfokal mikroskobunda lazer taramasından daha hızlı ve daha doğru bir şekilde skorlanır. Dolayısıyla, sabit ve 1D4 ile boyanmış embriyoların dolgulu hazırlanması en iyi kılavuzluk ipucu moleküllerinin fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Netrinler, Yarıklar, semaforinler (Semas) ve efrinler ile bunların ortak kökenli reseptörleri de dahil olmak üzere dört temel rehberlik ipucu sınıfı, so.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sığır Serumu Albümini	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	T-Oktilfenoksipolietoksietanol
16 Paraformaldehit Çözeltisi	Ted Pella	18505
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S5886
Potasyum Klorür	Sigma-Aldrich	P5405
Sodyum Fosfat Dibazik	Sigma-Aldrich	30435
Sodyum Fosfat Monobazik	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrat	ABD Biyolojik	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-kloro-3-indolil-b-D-galaktosid galaktopiranosid)
Dimetil Sülfks	Sigma-Aldrich	D4540
Magnezyum Klorür	Sigma-Aldrich	M8266
Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidrat	Sigma-Aldrich	P9387
Potasyum hekzasiyanoferrat(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hidrojen Peroksit	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidin Tetrahidroklorür	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	ABD Biyolojik	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Kültür Kabı (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beher	Simport	B700-100	Bu, embriyo toplama için plastik bir beher kafesi yapmak için kullanılır.
Maya	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Maya Kırmızı
Pamuklu Çubuk (Ahşap Tek Uçlu Pamuk PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tüpü (1.5 ml)	Sarstedt	# 72.690
Çamaşır Suyu	Clorox Company	Clorox
Heptan	Sigma-Aldrich	246654
Metanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Keçi Serumu	Yaşam Teknolojileri	16210-064
Anti-Fasikülin II Antikor	Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası	1D4 anti-Fasiclin II
Keçi Anti-fare-HRP Antikoru	Jackson İmmünoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Parça Keçi Anti-Fare IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Gliserol	Sigma-Aldrich	G9012
Sürgülü Cam	Duran Grubu	235501403
Lamel	Duran Grubu	235503104	18 x 18 mm
1 ml Şırınga	Becton Dickinson Medikal(ler	)301321
Tungsten İğne	Ted Pella	#27-11	Tungsten Tel, ø 0,13 mm/6,1 m (ø. 005 inç/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Kore Bilimi	KO. VS-96TWS	Alternatif olarak, BD Clay Adams Marka Nutatör (BD 421125)