Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

Nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve yakından ilgili prion hastalıkları gibi yavaş yavaş birikimi ile karakterize proteinopathies vardır deterjan çözünmez protein toplamları ile bilişsel birlikte beyin reddedin. ^{1 , 2} bu paylaşılan patolojik özellik etyoloji ve bu nörodejeneratif hastalıklar Patofizyoloji merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. ² bu toplamları liflerinin misfolded protein βsergilenmesi birim yinelenen oluşan polimer amiloid, genellikle-yapısı. ^{1 , 2 , 3 , 4} biyokimyasal olarak, amiloid toplamları kimyasal veya termal denatürasyon ve solubilization, onların arıtma, analiz için benzersiz zorluklar sunar³ son derece dayanıklıdır ve geleneksel biyokimyasal teknikleri ile çalışma. ^{2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} şaşırtıcı olmayan bir şekilde, deterjan çözünmez protein fraksiyonu nörodejeneratif hastalıklar misfolded proteinleri birikimi ile ilgili Patofizyoloji içine çok araştırma odağı olmuştur. ^{6 , 12 , 13 , 14}

Biyokimyasal ayırma teknikleri kez ölüm sonrası beyin homogenates dan deterjan çözünmez kesir zenginleştirmek için kullanılmıştır. ^{6 , 12 , 13 , 14} en yaygın yöntemlerden birini doku homogenates ile tampon sıralı çıkarma ve sıkılık çözünür ve çözünmez kesirler bölme ultrasantrifüj tarafından takip, artan deterjanlar içerir. Yaygın olarak kullanılan sıralı Ayırma Protokolü^6,14 donmuş doku örnekleri bir deterjan-Alerjik düşük tuz (LS) arabelleği homojenizasyon içerir ve sonuç çözünmez granül sonra sırayla ile ayıklanır yüksek tuz, non-iyonik deterjanlar, yüksek Sükroz içeren arabellekleri, üre iyonik deterjanlar ve nihayet chaotropes gibi. ^{6 , 14} önemli ölçüde zaman ve emek taahhüt bunları tamamlamak için gereken böyle bir sıralı ayırma iletişim kuralları belli bir dezavantajı var. Homojenizasyon ve ultrasantrifüj de dahil olmak üzere, tipik beş adım Ayırma Protokolü saat veya bile birkaç alabilir gün tamamlamak için. ^{4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18} Ayrıca, çok sayıda patolojik protein toplamları kalır en sert koşullar^19,20 hariç hepsi çözünmez oluşturulan kesirler çoğu sınırlı değeri. Böylece, yüksek tuz konsantrasyonları ve non-iyonik deterjanlar kullanarak daha az sıkı ayırma adımları büyük ölçüde gereksizdir.

Önceki çalışmalarda iyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) basitleştirilmiş tek adım deterjan Ayırma Protokolü için mükemmel bir aday olduğunu göstermiştir. ^{5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23} denaturing bir deterjan olarak sarkosyl beta-amiloid (Aβ),^{6,11 oluşan misfolded protein toplamları çözücü olmadan yerel olarak katlanmış proteinlerin beyinde büyük çoğunluğu solubilize için sıkı} fosforile tau (pTau),⁶ TAR DNA'ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43),¹⁴ Alfa-synuclein,^12,13 büyük,²³ veya U1 küçük nükleer ribonucleoproteins (U1 snRNPs) gibi U1 - 70 K. ^{5 , 21 , 22} Sarkosyl her yerde Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) daha az sıkı olduğu için daha az sağlam oligomeric formları SDS tedavi dayanıklı olamaz misfolded protein toplamları korur. ⁹

Daha önce biz sonuçları daha zahmetli sıralı ayırma yöntemleri için karşılaştırılabilir elde kısaltılmış bir deterjan-Ayırma Protokolü nitelendirdi. ⁵ daha az sıkı ayırma adımları ihmal olarak, deterjan çözünmez protein toplamları üzerinden öldükten sonra insan beyni zenginleştirme için facile tek adım Ayırma Protokolü geliştirmeye başardık. ⁵ burada açıklanan bu ayrıntılı iletişim kuralı deneysel uygulamalar Western Blot arasında değişen geniş bir yelpazesi için son derece uygundur ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik fonksiyonel proteini misfolding ve tohum toplama deneyleri. ^{5 , 6 , 21}

etik beyanı: tüm beyin dokuları Emory Alzheimer elde edilmiştir ' s hastalığı Araştırma Merkezi (ADRC) beyin banka. İnsan öldükten sonra dokular uygun kurumsal inceleme Kurulu (IRB) protokolleri altında elde.

1. homojenizasyon ve ayırma

1. doku seçim
   Not: ölüm sonrası frontal korteks doku sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş teyit edilen reklam durumlarda Emory seçildi ADRC beyin banka (n = 2). Alzheimer için bir kayıt defteri kurmak için konsorsiyum göre gerçekleştirilen amiloid plak dağıtım öldükten sonra neuropathological değerlendirilmesi yapıldı. ' s hastalığı yarı nicel ölçüt ²⁴, her ne kadar puanlama neurofibrillary dolaştırmak patoloji Braak hazırlama sistemine uygun olarak değerlendirildi. Ölüm sonrası beyin dokusunun sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş ¹⁶
   1. elde edilir reklam durumlarda doğruladı. Kuru buz, forseps ve jilet konteyner kullanmak, tüketim ~ 250 mg bölümlerini tek kullanımlık şeytan üzerinde her doku örneği üzerinden gri cevherde tartmak tekneler, doku çözdürme gelen önlemek için dikkat çekici. Homojen için her parçası ağırlığı kaydetmek.
   2. Tüketim ~ gri cevherde forseps ve jilet görsel olarak inceleyerek dış gri madde ve iç beyaz madde arasındaki arabirimi bulmak için kullanarak 250 mg. Beyaz madde ve daha da önemlisi, herhangi bir kaçının büyük kan damarları veya kanlı bölgeler, zarları veya araknoid mater. Hızlı bir şekilde çalışıyor ve sık sık tartı sandala polistren kapları kuru buz ile beyin dokusu ile yerleştirerek kesme işlemi sırasında dondurulmuş doku devam
   3. Gri madde bir analitik denge kullanarak her dondurulmuş parça eksize tam ağırlığı kaydetmek. Düşük tuz (LS) arabellek hacmi hesaplamak dounce homojenizasyon (5 mL/g veya % 20 w/v) için gerekli (bkz. Tablo 1).
   4. Hazırlamak 10 mL LS arabellek fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyl ve buz üzerinde sakin x 1
   Bu Tammy'nin gibi
   5. tartılır doku ve tartı tekne kuru buz ve kabaca 2 x 2 mm parçalar halinde zar çıkarın. 2 mL önceden soğutulmuş dounce homogenizer Tube transferinde buz
   6. 5 mL/g (% 20 w/v) 1 X fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyl ile buz gibi düşük tuz (LS) tampon ekleyin.
   7. Homogenize beyin dokusu yüksek izni havaneli A ve düşük giriş izni havaneli d. 15 vuruş yaklaşık 10 vuruş kullanarak buz üstünde
   8. Tüm homogenate bir cam Pasteur pipet kullanarak 2 mL polipropilen boru için transfer. Tüp ile etiket “ TH ” (Toplam Homogenate), doku olgu sayısı ve homogenate cilt. Aliquot 0.8 mL etiketli 1,5 mL tüp içine. Herhangi bir aşırı homogenate benzer şekilde bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.
   9. Aliquot her 0.8 mL için 5 M NaCl ve % 10 (w/v) sarkosyl her 100 µL 0,5 M ve % 1 w/v, konsantrasyonları sırasıyla ekleyin. Mix tüpler de INVERSION tarafından ve 15 dk. etiket tüpleri ile buz üzerinde kuluçkaya " TH-S " (Toplam Homogenate-homogenates sarkosyl-arabellekte (Tablo 1) olduğunu belirtmek için Sarkosyl).
   10. Her tüpün üç 5 s bakliyat, buz üzerinde % 30 genlik için solüsyon içeren temizleyicide (maksimum yoğunluk % 40 =) microtip sonda kullanarak
   11. bicinchoninic asit (BCA) kullanarak homogenates protein konsantrasyonları tahlil ²⁵ belirlemek yöntemi.
       Not: 15-20 mg/mL 5 mL LS doku gram başına hazırlanmış TH-S homogenates ortalama protein konsantrasyonu olduğunu. Hemen şeker veya-80 ° C'de kadar kullanmak saklı homogenates.
   12. 10 mg/ml 1 x fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile buz gibi sark tampon (Tablo 1) kullanarak seyreltik TH-S homogenates.
   Her TH-S homogenate 500 µL polikarbonat ultracentrifuge tüpler ve Sark'ın arabellek ile çift-denge
   13. transfer 5 mg protein (0.5 mL). Yük tüpler içine önceden soğutulmuş rotor ve 180.000 x g 1.5 mL tüpler için 4 ° C. Transfer sarkosyl çözünür supernatants (S1), 30 dk için de ultracentrifuge ve saklamak-80 ° C.
       Not: (İsteğe bağlı yıkama) eklemek 200 µL sark-arabelleği ultracentrifuge için tüpler deterjan çözünmez kesirler (P1) içeren ve granül (P1) 200 µL pipet ucu kullanarak ultracentrifuge tüpler altından çıkarmak.
   14. Kısaca nabız-spin ters tüpler için 2-3 s (≤ 2500 x g) üzerinde 1,5 mL tüpler aşağıdaki granül (P1) ve arabellek aktarmak için bir microcentrifuge. Pelet bozulur sağlamak için yukarı ve aşağı pipetting tarafından sark arabellekte çözünmez granül (P1) resuspend.
   15. Çift-denge ve 180.000 x g, santrifüj için ek bir 30 dk 4 ° C.
   16. İsteğe bağlı yıkama süpernatant (S2) atmak ve sarkosyl çözünmez granül (P2) 50-75 µL üre arabelleği (Tablo 1) 1 ile kuluçkaya x solubilize için oda sıcaklığında 30 dk (proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl) PIC Pelet.
       Not: Sıcak üre arabelleğe oda sıcaklığında SDS yağış önlemek için kullanmadan önce. Deterjan duyarlı uygulamalar için üre arabelleğinden SDS atlarsanız, çözünmez Pelet (P2) yıkama düşük tuz arabellekte üre arabellekte resuspending önce düşünün.
   17. Resuspended granül (P2) 0.5 mL tüpler için transfer edecek ve kısa (1 s) microtip sonication % 20 genlik, (maksimum yoğunluk = % 40) tam granül solubilize için.
   18. Sarkosyl çözünür (S1) protein konsantrasyonları belirlemek ve - BCA kullanarak çözünmez (P2) kesirler yöntemini tahlil. Bu kesirler hemen kullanmayın veya saklamayın-80 ° C'de kadar kullanmak.

2. Immunoblotting

1. Western Blot
   Not: Western Blot gerçekleştirilen hafif değişiklikler ile daha önce raporlanmış yordamlara göre belirleme yapılacağı. ^{5 , 10}
   1. Toplam homogenates (TH-S), sark çözünür (S1) ve sark çözünmez (P2) kesirler 1 X Laemmli SDS-sayfa örnek arabelleği 5 mM TCEP pH 7 ile hazırlamak 40 µg örnekleri. Örnekleri 5 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya
   2. Yük örnekleri bir prekast 10-iyi 4-%12 Bis-Tris SDS-sayfa jel. 80 V için ilk santimetre (10 dakika) ve 120 V kalanı (60 dk) için veya izleme boya jel sonuna ulaşana kadar electrophorese.
   3. Split-önceden döküm jel kaset açık için bir taze jilet ve jel bıçak kullanın. Yavaşça Kes gitsin tarak ve taze bir tıraş bıçağı ile jel çok altında.
   4. 200 µl sark-tampon PIC pipetting tarafından yukarı ve aşağı 1 x ile çözünmez granül (P1) resuspend.
   5. Transfer blotting bir makinede bir kuru aktarım yöntemini kullanarak bir 0.2 µm nitroselüloz membran için (malzeme tabloya bakın).
   6. Blok BB ile %0,05 ile takip membran engelleme arabelleği (BB) olmadan ara 20 için 30 dk, 30 dk için ara 20 (BB/T). Engelleme sonra durulama zar TBS/t (% 0,1 ara 20) aşırı engelleme arabellek kaldırmak 5 min için.
   7. Hazırla 1:1,000 dilutions birincil antikorlar pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 ve EEA1 BB/t (% 0.05 arası 20).
   8. Gecede 4 ° C'de dairesel ajitasyon ile birincil antikor çözümde membranlar kuluçkaya. Membran TBS/T 3 x 15 dk. için durulama
   9. Sonda membran 1:20,000 seyreltme fluorescently etiketli bir ile en yakın-IR ikincil antikor BB/t shaker üzerinde karanlık oda sıcaklığında 60 dk için. Membran 3 x 10 dk TBS/T ve 2 x 5 dk içinde TBS. durulama
   10. Membran görüntüleme sistemi uygun uyarma dalga boyu (örneğin 700 nm (kırmızı kanalı) kızılötesi boya 680 keçi Anti-fare IgG (H + L) ikincil ve 800 nm (yeşil kanal) kızılötesi boya 790 eşek Anti-tavşan IgG (H + L için için bir kızılötesi kullanarak tarama ) ikincil).
   11. Sinyal yoğunluklarda ölçmek ve üretici göre Dansitometresi ölçümleri gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı kullanmanız ' s talimatları, tüm arka plan ortalama üzere ayarlanmışsa otomatik arka plan ayarlama sağlanması.

Deterjan çözünmez protein toplamları kontrol ve AD ölüm sonrası beyin (şekil 1) zenginleştirmek için kullanılan kısaltılmış tek adım sarkosyl-ayırma protokol. Proteinler üzerinden TH-S, S1, S2 ve P2 kesirler SDS-sayfa, 15 dk Coomassie nazik Coomassie parlak mavi G-250 boyama arabellek ile boyama tarafından mavi sabitleştirici arabellek takip için sabit tarafından çözüldü. Protein S2 kesir tespit edilemez seviyede olduğundan resuspension isteğe bağlı bir adımdır (1.1.14 bakın). Western blot analizi (şekil 2A ve B) açıkça gösteriyor ki reklam beyin, patolojik yüksek molekül ağırlıklı fosforile tau toplamları sarkosyl çözünmez ve çok az pTau kaldı sarkosyl çözünür kesirler. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 tersine, sarkosyl çözünür kesir pTau kontrol beyin çoğunluğu bölümlenmiş. 5 , 6 , 10 buna ek olarak, EEA1 öncelikle S1 kesir hem denetim hem de reklam beyin (şekil 2C) içine bölümleri. Burada, EEA1 doğal olarak sarkosyl çözünür5en yerli, patolojik proteinler için genel bir işaretleyici gibi davranır. Özellikle, EEA1 için biraz daha az sinyal EEA1 küçük bir havuz büyük olasılıkla sarkosyl-çözünmez, henüz bu belirli antikor ile western blot tarafından algılamayı sınırı altında olduğunu belirten TH-S kesir karşılaştırıldığında çözünür kesir (S1) vardır. Aynı derecede öyle EEA1 non-spesifik bağlama ultracentrifuge tüpler için EEA1 sinyal gücünü çözünür kesir (S1) hafif azalma kaynaklanmaktadır mümkün de beklenen sonuçları hafif sapma durumu açıklar.

Kısaltılmış tek adım Ayırma Protokolü (şekil 3A) karşı daha geleneksel Multi-step sıralı ayırma yöntemi (3B rakam), etkinliğini sarkosyl çözünmez göreli düzeyleri benchmark için Amiloid precursor protein (APP), tau (MAPT), küçük nükleer Ribonükleoprotein U1 - 70K (snRNP70) ve apolipoprotein E (APOE) arasında havuza alınan denetim (Ctl), hafif kognitif bozukluk (MCI) etiket içermeyen kütle spektrometresi (MS) dayalı proteomik tarafından karşılaştırıldığında ve reklam durumlarda önceki çalışmalar7,18 (şekil 3). Deterjan çözünmez APP ölçümleri etkili tam uzunlukta 695 kalıntı APP protein7Aβ bölgesine eşlenen Aβ peptid, tüm tam tryptic APP peptidler sayısal olarak temsil eder. Her iki yöntem ile tüm dört patolojik proteinlerin sarkosyl çözünmez düzeyleri yukarı denetimleri, bilişsel gerileme ve patolojik yükü güçlü korelasyon ile tutarlı göre MCI ve reklam durumlarda langıç. Genel olarak, zenginleştirme deterjan çözünmez kesirler (P2) bu proteinlerin tek adım18 ve çok adımlı ayırma iletişim kuralları7kullanarak son derece tutarlı.

Ancak, avantajlı veya tam yapısına bağlı olarak zararlı olduğu kanıtlanabilir iki Metodolojisi ve bireysel deney hedefleri arasında küçük farklılıklar vardır. Şekil 3 ' te özetlenmiştir karşılaştırmalı proteomik veri belirli deneysel parametreleri ve uygulamaları bağlı olarak kullanmak için hangi iletişim kuralının bilgilendirebilir. Bir tahmin edebileceğiniz gibi örnek zenginleştirme ve saflık, daha zenginleştirilmiş örnekleri çok adımlı yöntem'den daha az protein kaybı saglayan Basitleştirilmiş ayırma protokolü ile arasında genel bir denge vardır.

Örneğin, denetim çözünmez kesirler Basitleştirilmiş Protokolü (şekil 3A) kullanılarak hazırlanan bu çok adımlı yaklaşım ile hazırlanan daha biraz daha yüksek arka plan düzeylerine hastalık ilgili proteinlerin sergi. Buna karşılık, tek adım ayırma tekniği kayıp azaltılacağını genel örnek düşük-bereket proteinler için avantajlı olabilir. Örneğin, MCI durumlarda sarkosyl çözünmez APOE göreceli zenginlik kısaltılmış Protokolü (şekil 3A) yolu ile hazırlanan çözünmez kesirler daha yüksek olduğunu.

Her iki yaklaşımın hastalık ilgili veya patolojik misfolded protein toplamları, daha çok sayıda önemli herhangi bir artış gözlemlemek daha--dan yeterli olmasına rağmen ve geniş ayırma ve yıkama adımları çok adımlı yaklaşım bir süpürge komutu verebilir ve daha spesifik proteomik imza. Yine de, bizim veri tek adım ayırma yöntemi tau neurofibrillary tangles (NFTs), Aβ plaklar ve büyük Prionlar (PrSc) gibi patolojik toplamları sarkosyl içinde çözünmez yayımlanmış bulguları ile tutarlı olduğundan emin olun, Yerel olarak katlanmış karşılıkları çözünür kalırken. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26

Denetim deterjan çözünmez kesirler bölme protein göreli miktarda hesaplayarak (n = 3) ve AD (n = 3) beyin (Tablo 2), sadece ~ toplam protein havuzu yüzde 10'u sarkosyl çözünmez. Beyin homogenate (TH-S) 5 mg toplam protein şeker zaman ve Proteom ,3 ,4 bölümleri kontrolü ve reklam çalışmaları, deterjan çözünmez kesir içine sırasıyla. Sarkosyl çözünmez protein reklam beyinde zenginleştirilmiş toplam miktarı kontrol biraz daha yüksek olmakla birlikte, hiçbir önemli farklılıklar iki gruplarında gözlendi (p = 0.703). Bu protein misfolding ve toplama reklam beyinde yaygın değildir, ancak oldukça dar ve belirli alt kümesine tau, Aβ ve U1 gibi proteinlerin snRNPs sınırlı gösterir. 7 , 21 , 22

Şekil 1: Sarkosyl ayırma düzeni. (A) A ölüm sonrası insan beyninin içinde düşük tuz tampon, sonra sarkosyl ve NaCl % 1 w/v ve 0,5 M, son konsantrasyonları sırasıyla eklendi ve buz üzerinde 15 dakika inkübe homojenize oluncaya. Sonication sonra homogenates tarafından ultrasantrifüj 180.000 x g 30 dk sarkosyl çözünür süpernatant (S1) ve sarkosyl çözünmez Pelet (P1) saglayan için de şeker. P1 Pelet (isteğe bağlı) sark-tampon ve re-posalı son sarkosyl çözünmez Pelet (P2) göze ultrasantrifüj tarafından yıkandı. Bu P2 kesir üre arabelleği için bir temiz microtip sonda ile 3 x 5 s sonication tarafından takip oda sıcaklığında 30 dk çözündürüldükten. (B) proteinler (20 µg) TH-S, S1, S2 den (10 µL) ve P2 kesirler SDS-sayfa, mavi sabitleştirici arabellek takip nazik bir gecede, oda sıcaklığında Coomassie parlak mavi G-250 boyama arabelleği ile boyama tarafından Coomassie 15 dakika sabit tarafından karar verdi.com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"hedef ="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: reklam beyin deterjan çözünmez kısmını fosforile-tau zenginleştirme. (A ve B) Protein (40 μg) (TH-lar) toplamı (S1) çözünür ve çözünmez (P2) kesirler ile bir antikor treonin 231 (pT231) fosforile tau karşı deyimiyle veya AT8 (patolojik fosfo-tau türler zenginleştirme göstermek için pSer202, pThr205) Reklam beyin çözünmez kısmını (P2). Reklam beyinde yüksek molekül ağırlıklı toplanan tau sadece deterjan çözünmez (P2) kesir bölüme. (C) EEA1 çözünür protein marker ve göreli yükleme denetimi için toplam (TH-S) ve çözünür (S1) kesirler kontrol ve AD beyin olarak görev yaptı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: proteomik analiz bir tek adım veya çok adımlı ayırma iletişim kuralı kullanılarak patolojik reklam proteinlerin. Temsilcisi sarkosyl çözünmez proteinlerin APP (Aβ), tau, snRNP70 göreli düzeyleri (U1 - 70K) ve APOE arasında farklı hastalıklar arasında havuzlu denetim, MCI ve reklam durumlarda tek adım (A) veya çok adımlı (B) sarkosyl kullanarak ayırma yaklaşım. Her iki veri kümeleri için protein seviyesini peptid spektral maçlar (PSMs) bu proteinler tespit ve maksimum 100'e ayarlamak için normalleştirilmiş tahmin edilmiştir. PSMs kontrolü, MCI ve reklam çalışmalarından (n = 5 her) tek-set veri kümesi için kullanıldı. Çok adımlı yaklaşım, kontrol, iki Çoğalt havuzlarından PSMs için MCI ve reklam durumlarda (n = 5 her) analiz edildi. Hata Çubuklarõn değerleri ortalama ± S.E.M. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Arabellek listesi.

Tablo 2: Protein miktarı sarkosyl çözünmez kesirler (P2). Ortalama olarak, protein yüzdesi bu bölümleri kontrol sarkosyl çözünmez kısmını (n= 3) ve AD (n= 3) beyin yapıldı .4 ve % 11,3, anılan sıraya göre. Kanıtladığı gibi kontrol ve AD beyin, istatistiksel olarak anlamlı bir fark sarkosyl çözünmez protein miktarının yapıldı tarafından öğrenci t-test (p 0.703 =) ve standart hata demek (S.E.M.) değerlerden.

Yazarlar ifşa gerek yok.