Deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışmada, deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış tek adım Ayırma Protokolü açıklar. İyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) etkin bir şekilde beyin dokusu gibi deterjan çözünmez protein toplamları nörodejeneratif proteinopathies, geniş bir dizi zenginleştirme sağlayan yerel olarak katlanmış proteinlerin solubilizes Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz ve prion hastalıkları. İnsan kontrolü ve reklam ölüm sonrası beyin dokuları ultrasantrifüj patolojik fosforile tau, neurofibrillary temel bileşenidir dahil olmak üzere deterjan çözünmez protein toplamları zenginleştirmek için sarkosyl huzurunda tarafından homojenize ve posalı düğüm reklam. Western Blot toplanan fosforile tau ve deterjan çözünür protein, erken Endosome antijen 1 (EEA1) kontrolü ve reklam beyin farklı çözünürlük gösterdi. Proteomik çözümleme Ayrıca βzenginlik ortaya-amiloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) ve apolipoprotein E (APOE) bu kontrol, önceki doku ayırma stratejileri ile tutarlı göre reklam beyin sarkosyl çözünmez kesirler . Böylece, bu basit zenginleştirme Protokolü deneysel uygulamalar Western Blot ve fonksiyonel proteini ortak toplama deneyleri kütle spektrometresi tabanlı proteomik kadar geniş bir yelpazede için idealdir.
Giriş
Nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve yakından ilgili prion hastalıkları gibi yavaş yavaş birikimi ile karakterize proteinopathies vardır deterjan çözünmez protein toplamları ile bilişsel birlikte beyin reddedin. 1 , 2 bu paylaşılan patolojik özellik etyoloji ve bu nörodejeneratif hastalıklar Patofizyoloji merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. 2 bu toplamları liflerinin misfolded protein βsergilenmesi birim yinelenen oluşan polimer amiloid, genellikle-yapısı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
etik beyanı: tüm beyin dokuları Emory Alzheimer elde edilmiştir ' s hastalığı Araştırma Merkezi (ADRC) beyin banka. İnsan öldükten sonra dokular uygun kurumsal inceleme Kurulu (IRB) protokolleri altında elde.
1. homojenizasyon ve ayırma
- doku seçim
Not: ölüm sonrası frontal korteks doku sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş teyit edilen reklam durumlarda Emory seçildi ADRC beyin banka (n = 2). Alzheimer için bir kayıt defteri kurmak için konsorsiyum göre gerçekleştirilen amiloid plak dağıtım öldükten sonra neuropathological değerlendirilmesi yapıldı. ' s hastalığı yarı nice....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deterjan çözünmez protein toplamları kontrol ve AD ölüm sonrası beyin (şekil 1) zenginleştirmek için kullanılan kısaltılmış tek adım sarkosyl-ayırma protokol. Proteinler üzerinden TH-S, S1, S2 ve P2 kesirler SDS-sayfa, 15 dk Coomassie nazik Coomassie parlak mavi G-250 boyama arabellek ile boyama tarafından mavi sabitleştirici arabellek takip için sabit tarafından çözüldü. Protein S2 kesir tespit edilemez seviyede olduğundan resuspension isteğe bağlı bir adımd.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada biz tanıtmak ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizinden deneyleri misfolding fonksiyonel proteini değişen deneysel uygulamalar çok çeşitli için geçerlidir kısaltılmış bir tek adım deterjan-Ayırma Protokolü tartışmak ve western Blot. 5 , 6 , 7 , 10 Bu metodoloji olduğunu Belki de çoğu zaman nörodejeneratif proteinopathies Alzheimer gibi çalışmak için kullanılan etkili, ALS, Hun.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Drs. Jim Lah ve Allan Levey, Emory sevgi Nöroloji, yazarlar yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen finanse edildi hızlanan tıp ortaklık tarafından (U01AG046161-02), Emory Alzheimer'ın hastalığı Araştırma Merkezi (P50AG025688) ve yaşlanma Ulusal Enstitüsü (R01AG053960-01) N.T.S. için erişim izni verme Bu araştırma da kısmen Emory nörolojik NINDS çekirdek İmkanları grant, P30NS055077 nevropatoloji çekirdeği tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli, EDTA içermeyen (100X) | Thermo Fisher | 78441 | proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | mikrotip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | 361545 | soğutmalı ultrasantrifüj |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultrasantrifüj rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polikarbonat tüpler, kalın duvar | Beckman Coulter | 343776 | TLA120.1 rotor için ultrasantrifüj tüpleri |
| 4X SDS numune tamponu | Ev yapımı | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP çözeltisi, nötr pH | Thermo Fisher | 77720 | indirgeyici ajan |
| (TBS) bloke edici tampon | Thermo Fisher | 37542 | engelleme tamponu |
| (TBS) engelleme tamponu +% 0.05 Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | engelleme tamponu ve antikor seyreltici |
| % 4-12 Bolt Bis-Tris Plus jelleri, 10 kuyulu | Thermo Fisher | NW04120BOX | prekast SDS-PAGE jelleri |
| MES SDS Koşu Tamponu (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE çalışma tamponu |
| N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu (sarkosil) | Sigma Aldrich | L5777-50G | deterjan |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antikoru | Chemicon | MAB375 | antikorları |
| Anti-fosfo-treonin 231 Tau antikoru | Millipore | MAB5450 | antikorları |
| Anti-fosfo-seroin 202 ve treonin 205 Tau antikoru (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antikorları |
| Anti-erken endozom antijen 1 (EEA1) antikoru | abcam | ab2900 | antikorları |
| Alexa Fluor 680 keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikor | Thermo Fisher | A21058 | antikorları |
| Alexa Fluor 790 eşek anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikor | Thermo Fisher | A11374 | antikorları |
| iBlot2 Kuru Kurutma Sistemi | Thermo Fisher | IB21001 | Jel transferi |
| iBlot2 Transfer Yığınları, Nitroselüloz, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Jel transferi |
Kaynaklar
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
