Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

12.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55835

⸱

24 Ekim 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Emory School of Medicine

Bu makalede

Özet

Deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.

Özet

Bu çalışmada, deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış tek adım Ayırma Protokolü açıklar. İyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) etkin bir şekilde beyin dokusu gibi deterjan çözünmez protein toplamları nörodejeneratif proteinopathies, geniş bir dizi zenginleştirme sağlayan yerel olarak katlanmış proteinlerin solubilizes Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz ve prion hastalıkları. İnsan kontrolü ve reklam ölüm sonrası beyin dokuları ultrasantrifüj patolojik fosforile tau, neurofibrillary temel bileşenidir dahil olmak üzere deterjan çözünmez protein toplamları zenginleştirmek için sarkosyl huzurunda tarafından homojenize ve posalı düğüm reklam. Western Blot toplanan fosforile tau ve deterjan çözünür protein, erken Endosome antijen 1 (EEA1) kontrolü ve reklam beyin farklı çözünürlük gösterdi. Proteomik çözümleme Ayrıca βzenginlik ortaya-amiloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) ve apolipoprotein E (APOE) bu kontrol, önceki doku ayırma stratejileri ile tutarlı göre reklam beyin sarkosyl çözünmez kesirler . Böylece, bu basit zenginleştirme Protokolü deneysel uygulamalar Western Blot ve fonksiyonel proteini ortak toplama deneyleri kütle spektrometresi tabanlı proteomik kadar geniş bir yelpazede için idealdir.

Giriş

Nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve yakından ilgili prion hastalıkları gibi yavaş yavaş birikimi ile karakterize proteinopathies vardır deterjan çözünmez protein toplamları ile bilişsel birlikte beyin reddedin. 1 , 2 bu paylaşılan patolojik özellik etyoloji ve bu nörodejeneratif hastalıklar Patofizyoloji merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. 2 bu toplamları liflerinin misfolded protein βsergilenmesi birim yinelenen oluşan polimer amiloid, genellikle-yapısı. 1 , 2 , 3 , 4 biyokimyasal olarak, amiloid toplamları kimyasal veya termal denatürasyon ve solubilization, onların arıtma, analiz için benzersiz zorluklar sunar3 son derece dayanıklıdır ve geleneksel biyokimyasal teknikleri ile çalışma. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 şaşırtıcı olmayan bir şekilde, deterjan çözünmez protein fraksiyonu nörodejeneratif hastalıklar misfolded proteinleri birikimi ile ilgili Patofizyoloji içine çok araştırma odağı olmuştur. 6 , 12 , 13 , 14

Biyokimyasal ayırma teknikleri kez ölüm sonrası beyin homogenates dan deterjan çözünmez kesir zenginleştirmek için kullanılmıştır. 6 , 12 , 13 , 14 en yaygın yöntemlerden birini doku homogenates ile tampon sıralı çıkarma ve sıkılık çözünür ve çözünmez kesirler bölme ultrasantrifüj tarafından takip, artan deterjanlar içerir. Yaygın olarak kullanılan sıralı Ayırma Protokolü6,14 donmuş doku örnekleri bir deterjan-Alerjik düşük tuz (LS) arabelleği homojenizasyon içerir ve sonuç çözünmez granül sonra sırayla ile ayıklanır yüksek tuz, non-iyonik deterjanlar, yüksek Sükroz içeren arabellekleri, üre iyonik deterjanlar ve nihayet chaotropes gibi. 6 , 14 önemli ölçüde zaman ve emek taahhüt bunları tamamlamak için gereken böyle bir sıralı ayırma iletişim kuralları belli bir dezavantajı var. Homojenizasyon ve ultrasantrifüj de dahil olmak üzere, tipik beş adım Ayırma Protokolü saat veya bile birkaç alabilir gün tamamlamak için. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 Ayrıca, çok sayıda patolojik protein toplamları kalır en sert koşullar19,20 hariç hepsi çözünmez oluşturulan kesirler çoğu sınırlı değeri. Böylece, yüksek tuz konsantrasyonları ve non-iyonik deterjanlar kullanarak daha az sıkı ayırma adımları büyük ölçüde gereksizdir.

Önceki çalışmalarda iyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) basitleştirilmiş tek adım deterjan Ayırma Protokolü için mükemmel bir aday olduğunu göstermiştir. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 denaturing bir deterjan olarak sarkosyl beta-amiloid (Aβ),6,11 oluşan misfolded protein toplamları çözücü olmadan yerel olarak katlanmış proteinlerin beyinde büyük çoğunluğu solubilize için sıkı fosforile tau (pTau),6 TAR DNA'ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43),14 Alfa-synuclein,12,13 büyük,23 veya U1 küçük nükleer ribonucleoproteins (U1 snRNPs) gibi U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl her yerde Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) daha az sıkı olduğu için daha az sağlam oligomeric formları SDS tedavi dayanıklı olamaz misfolded protein toplamları korur. 9

Daha önce biz sonuçları daha zahmetli sıralı ayırma yöntemleri için karşılaştırılabilir elde kısaltılmış bir deterjan-Ayırma Protokolü nitelendirdi. 5 daha az sıkı ayırma adımları ihmal olarak, deterjan çözünmez protein toplamları üzerinden öldükten sonra insan beyni zenginleştirme için facile tek adım Ayırma Protokolü geliştirmeye başardık. 5 burada açıklanan bu ayrıntılı iletişim kuralı deneysel uygulamalar Western Blot arasında değişen geniş bir yelpazesi için son derece uygundur ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik fonksiyonel proteini misfolding ve tohum toplama deneyleri. 5 , 6 , 21

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

etik beyanı: tüm beyin dokuları Emory Alzheimer elde edilmiştir ' s hastalığı Araştırma Merkezi (ADRC) beyin banka. İnsan öldükten sonra dokular uygun kurumsal inceleme Kurulu (IRB) protokolleri altında elde.

1. homojenizasyon ve ayırma

  1. doku seçim
    Not: ölüm sonrası frontal korteks doku sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş teyit edilen reklam durumlarda Emory seçildi ADRC beyin banka (n = 2). Alzheimer için bir kayıt defteri kurmak için konsorsiyum göre gerçekleştirilen amiloid plak dağıtım öldükten sonra neuropathological değerlendirilmesi yapıldı. ' s hastalığı yarı nicel ölçüt 24, her ne kadar puanlama neurofibrillary dolaştırmak patoloji Braak hazırlama sistemine uygun olarak değerlendirildi. Ölüm sonrası beyin dokusunun sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş 16
    1. elde edilir reklam durumlarda doğruladı. Kuru buz, forseps ve jilet konteyner kullanmak, tüketim ~ 250 mg bölümlerini tek kullanımlık şeytan üzerinde her doku örneği üzerinden gri cevherde tartmak tekneler, doku çözdürme gelen önlemek için dikkat çekici. Homojen için her parçası ağırlığı kaydetmek.
    2. Tüketim ~ gri cevherde forseps ve jilet görsel olarak inceleyerek dış gri madde ve iç beyaz madde arasındaki arabirimi bulmak için kullanarak 250 mg. Beyaz madde ve daha da önemlisi, herhangi bir kaçının büyük kan damarları veya kanlı bölgeler, zarları veya araknoid mater. Hızlı bir şekilde çalışıyor ve sık sık tartı sandala polistren kapları kuru buz ile beyin dokusu ile yerleştirerek kesme işlemi sırasında dondurulmuş doku devam
    3. Gri madde bir analitik denge kullanarak her dondurulmuş parça eksize tam ağırlığı kaydetmek. Düşük tuz (LS) arabellek hacmi hesaplamak dounce homojenizasyon (5 mL/g veya % 20 w/v) için gerekli (bkz. Tablo 1).
    4. Hazırlamak 10 mL LS arabellek fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyl ve buz üzerinde sakin x 1
      5. Bu Tammy'nin gibi
    5. tartılır doku ve tartı tekne kuru buz ve kabaca 2 x 2 mm parçalar halinde zar çıkarın. 2 mL önceden soğutulmuş dounce homogenizer Tube transferinde buz
    6. 5 mL/g (% 20 w/v) 1 X fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyl ile buz gibi düşük tuz (LS) tampon ekleyin.
    7. Homogenize beyin dokusu yüksek izni havaneli A ve düşük giriş izni havaneli d. 15 vuruş yaklaşık 10 vuruş kullanarak buz üstünde
    8. Tüm homogenate bir cam Pasteur pipet kullanarak 2 mL polipropilen boru için transfer. Tüp ile etiket “ TH ” (Toplam Homogenate), doku olgu sayısı ve homogenate cilt. Aliquot 0.8 mL etiketli 1,5 mL tüp içine. Herhangi bir aşırı homogenate benzer şekilde bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.
    9. Aliquot her 0.8 mL için 5 M NaCl ve % 10 (w/v) sarkosyl her 100 µL 0,5 M ve % 1 w/v, konsantrasyonları sırasıyla ekleyin. Mix tüpler de INVERSION tarafından ve 15 dk. etiket tüpleri ile buz üzerinde kuluçkaya " TH-S " (Toplam Homogenate-homogenates sarkosyl-arabellekte (Tablo 1) olduğunu belirtmek için Sarkosyl).
    10. Her tüpün üç 5 s bakliyat, buz üzerinde % 30 genlik için solüsyon içeren temizleyicide (maksimum yoğunluk % 40 =) microtip sonda kullanarak
    11. bicinchoninic asit (BCA) kullanarak homogenates protein konsantrasyonları tahlil 25 belirlemek yöntemi.
      Not: 15-20 mg/mL 5 mL LS doku gram başına hazırlanmış TH-S homogenates ortalama protein konsantrasyonu olduğunu. Hemen şeker veya-80 ° C'de kadar kullanmak saklı homogenates.
    12. 10 mg/ml 1 x fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile buz gibi sark tampon (Tablo 1) kullanarak seyreltik TH-S homogenates.
      13. Her TH-S homogenate 500 µL polikarbonat ultracentrifuge tüpler ve Sark'ın arabellek ile çift-denge
    13. transfer 5 mg protein (0.5 mL). Yük tüpler içine önceden soğutulmuş rotor ve 180.000 x g 1.5 mL tüpler için 4 ° C. Transfer sarkosyl çözünür supernatants (S1), 30 dk için de ultracentrifuge ve saklamak-80 ° C.
      Not: (İsteğe bağlı yıkama) eklemek 200 µL sark-arabelleği ultracentrifuge için tüpler deterjan çözünmez kesirler (P1) içeren ve granül (P1) 200 µL pipet ucu kullanarak ultracentrifuge tüpler altından çıkarmak.
    14. Kısaca nabız-spin ters tüpler için 2-3 s (≤ 2500 x g) üzerinde 1,5 mL tüpler aşağıdaki granül (P1) ve arabellek aktarmak için bir microcentrifuge. Pelet bozulur sağlamak için yukarı ve aşağı pipetting tarafından sark arabellekte çözünmez granül (P1) resuspend.
    15. Çift-denge ve 180.000 x g, santrifüj için ek bir 30 dk 4 ° C.
    16. İsteğe bağlı yıkama süpernatant (S2) atmak ve sarkosyl çözünmez granül (P2) 50-75 µL üre arabelleği (Tablo 1) 1 ile kuluçkaya x solubilize için oda sıcaklığında 30 dk (proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl) PIC Pelet.
      Not: Sıcak üre arabelleğe oda sıcaklığında SDS yağış önlemek için kullanmadan önce. Deterjan duyarlı uygulamalar için üre arabelleğinden SDS atlarsanız, çözünmez Pelet (P2) yıkama düşük tuz arabellekte üre arabellekte resuspending önce düşünün.
    17. Resuspended granül (P2) 0.5 mL tüpler için transfer edecek ve kısa (1 s) microtip sonication % 20 genlik, (maksimum yoğunluk = % 40) tam granül solubilize için.
    18. Sarkosyl çözünür (S1) protein konsantrasyonları belirlemek ve - BCA kullanarak çözünmez (P2) kesirler yöntemini tahlil. Bu kesirler hemen kullanmayın veya saklamayın-80 ° C'de kadar kullanmak.

2. Immunoblotting

  1. Western Blot
    Not: Western Blot gerçekleştirilen hafif değişiklikler ile daha önce raporlanmış yordamlara göre belirleme yapılacağı. 5 , 10
    1. Toplam homogenates (TH-S), sark çözünür (S1) ve sark çözünmez (P2) kesirler 1 X Laemmli SDS-sayfa örnek arabelleği 5 mM TCEP pH 7 ile hazırlamak 40 µg örnekleri. Örnekleri 5 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya
    2. Yük örnekleri bir prekast 10-iyi 4-%12 Bis-Tris SDS-sayfa jel. 80 V için ilk santimetre (10 dakika) ve 120 V kalanı (60 dk) için veya izleme boya jel sonuna ulaşana kadar electrophorese.
    3. Split-önceden döküm jel kaset açık için bir taze jilet ve jel bıçak kullanın. Yavaşça Kes gitsin tarak ve taze bir tıraş bıçağı ile jel çok altında.
    4. 200 µl sark-tampon PIC pipetting tarafından yukarı ve aşağı 1 x ile çözünmez granül (P1) resuspend.
    5. Transfer blotting bir makinede bir kuru aktarım yöntemini kullanarak bir 0.2 µm nitroselüloz membran için (malzeme tabloya bakın).
    6. Blok BB ile %0,05 ile takip membran engelleme arabelleği (BB) olmadan ara 20 için 30 dk, 30 dk için ara 20 (BB/T). Engelleme sonra durulama zar TBS/t (% 0,1 ara 20) aşırı engelleme arabellek kaldırmak 5 min için.
    7. Hazırla 1:1,000 dilutions birincil antikorlar pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 ve EEA1 BB/t (% 0.05 arası 20).
    8. Gecede 4 ° C'de dairesel ajitasyon ile birincil antikor çözümde membranlar kuluçkaya. Membran TBS/T 3 x 15 dk. için durulama
    9. Sonda membran 1:20,000 seyreltme fluorescently etiketli bir ile en yakın-IR ikincil antikor BB/t shaker üzerinde karanlık oda sıcaklığında 60 dk için. Membran 3 x 10 dk TBS/T ve 2 x 5 dk içinde TBS. durulama
    10. Membran görüntüleme sistemi uygun uyarma dalga boyu (örneğin 700 nm (kırmızı kanalı) kızılötesi boya 680 keçi Anti-fare IgG (H + L) ikincil ve 800 nm (yeşil kanal) kızılötesi boya 790 eşek Anti-tavşan IgG (H + L için için bir kızılötesi kullanarak tarama ) ikincil).
    11. Sinyal yoğunluklarda ölçmek ve üretici göre Dansitometresi ölçümleri gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı kullanmanız ' s talimatları, tüm arka plan ortalama üzere ayarlanmışsa otomatik arka plan ayarlama sağlanması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deterjan çözünmez protein toplamları kontrol ve AD ölüm sonrası beyin (şekil 1) zenginleştirmek için kullanılan kısaltılmış tek adım sarkosyl-ayırma protokol. Proteinler üzerinden TH-S, S1, S2 ve P2 kesirler SDS-sayfa, 15 dk Coomassie nazik Coomassie parlak mavi G-250 boyama arabellek ile boyama tarafından mavi sabitleştirici arabellek takip için sabit tarafından çözüldü. Protein S2 kesir tespit edilemez seviyede olduğundan resuspension isteğe bağlı bir adımd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada biz tanıtmak ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizinden deneyleri misfolding fonksiyonel proteini değişen deneysel uygulamalar çok çeşitli için geçerlidir kısaltılmış bir tek adım deterjan-Ayırma Protokolü tartışmak ve western Blot. 5 , 6 , 7 , 10 Bu metodoloji olduğunu Belki de çoğu zaman nörodejeneratif proteinopathies Alzheimer gibi çalışmak için kullanılan etkili, ALS, Hun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Drs. Jim Lah ve Allan Levey, Emory sevgi Nöroloji, yazarlar yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen finanse edildi hızlanan tıp ortaklık tarafından (U01AG046161-02), Emory Alzheimer'ın hastalığı Araştırma Merkezi (P50AG025688) ve yaşlanma Ulusal Enstitüsü (R01AG053960-01) N.T.S. için erişim izni verme Bu araştırma da kısmen Emory nörolojik NINDS çekirdek İmkanları grant, P30NS055077 nevropatoloji çekirdeği tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli, EDTA içermeyen (100X)Thermo Fisher78441proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)Fisher ScientificFB505110mikrotip ultrasonicator
Optimax TLX UltrasantrifüjBeckman Coulter361545soğutmalı ultrasantrifüj
TLA120.1 rotorBeckman Coulter362224ultrasantrifüj rotor
500 ul (8 x 34 mm) polikarbonat tüpler, kalın duvarBeckman Coulter343776TLA120.1 rotor için ultrasantrifüj tüpleri
4X SDS numune tamponuEv yapımıN/ASDS-PAGE
TCEP çözeltisi, nötr pHThermo Fisher77720indirgeyici ajan
(TBS) bloke edici tamponThermo Fisher37542engelleme tamponu
(TBS) engelleme tamponu +% 0.05 Tween 20Thermo Fisher37543engelleme tamponu ve antikor seyreltici
% 4-12 Bolt Bis-Tris Plus jelleri, 10 kuyuluThermo FisherNW04120BOXprekast SDS-PAGE jelleri
MES SDS Koşu Tamponu (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE çalışma tamponu
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu (sarkosil)Sigma AldrichL5777-50Gdeterjan
Anti-Tau-2 (pan tau) antikoruChemiconMAB375antikorları
Anti-fosfo-treonin 231 Tau antikoruMilliporeMAB5450antikorları
Anti-fosfo-seroin 202 ve treonin 205 Tau antikoru (AT8)Thermo FisherMN1020antikorları
Anti-erken endozom antijen 1 (EEA1) antikoruabcamab2900antikorları
Alexa Fluor 680 keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikorThermo FisherA21058antikorları
Alexa Fluor 790 eşek anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikorThermo FisherA11374antikorları
iBlot2 Kuru Kurutma SistemiThermo FisherIB21001Jel transferi
iBlot2 Transfer Yığınları, Nitroselüloz, miniThermo FisherIB23002Jel transferi

Kaynaklar

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130(2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).
  23. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sarkozil FraksiyonlamasUltrasantrif j ProtokolWestern Blot AnaliziProteomik AnalizFosforile Tau Zenginle tirmesiN rodejeneratif ProteinopatilerBCA Deneyi Y ntemiK z l tesi G r nt leme Sistemi
Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.