Yöntem makalesi

Yenidoğan hipoksik-iskemik beyin hasarı, fare modeli neurobehavioral değerlendirmesi

11.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55838

⸱

24 Kasım 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

Bu makalede

Özet

Tek taraflı Karotis arter tıkanıklığı postnatal gününde gerçekleştirilen 7-10 CD-1 fare pups yenidoğan hipoksik-iskemik (hı) model oluşturmak ve HI beyin hasarı etkileri araştırıldı. Neurobehavioral işlevleri olmayan çalışan normal farelere göre bu farelerde görmüştük.

Özet

Biz tek taraflı Karotis arter tıkanıklığı bir yenidoğan hipoksik-iskemik (hı) model oluşturmak için CD-1 fareler üzerinde gerçekleştirilen ve neurobehavioral işlevleri olmayan işletilen (Yani, için karşılaştırıldığında bu farelerde inceleyerek yenidoğan HI beyin hasarı etkileri araştırıldı Normal) fareler. Çalışma sırasında pirinç-Vannucci'nın yöntemi postnatal gün 7-10 (P7-10) farelerde neonatal HI beyin hasar ikna etmek için kullanıldı. HI işlem üzerinde belgili tanımlık pups tek taraflı Karotis arter ligasyonu ve hipoksi (%8 O2 ve %92 N2 90 dk) maruz tarafından gerçekleştirildi. Bir hafta sonra ameliyat, hasarlı beyin yarı saydam kafatası ile çıplak gözle değerlendirildi ve devamsızlık ("hiçbir kortikal yaralanma" grubu) veya kortikal yaralanma ("kortikal yaralanma" grubu) varlığı göre alt gruplar halinde kategorize, sağ hemisfer bir lezyon gibi. 6 haftasında bilişsel ve motor işlevlerinin değerlendirmek için aşağıdaki neurobehavioral testler gerçekleştirilmiştir: pasif kaçınma görev (PAT), merdiven test ve kavrama gücü testi yürüme. Bu davranış testleri yenidoğan HI beyin hasarının etkilerini belirlemede yararlı ve nörodejeneratif hastalıklar diğer fare modellerinde kullanılır. Bu çalışmada yenidoğan HI beyin yaralanması fare Sağ Yarımküre hasar denk motor açıkları gösterdi. Davranışsal test sonuçlarını beyin felci veya neonatal inme hastalarında gibi insan yenidoğan HI hastalarda gözlenen açıkları alakalı. Bu çalışmada yenidoğan HI beyin hasarı bir fare modeli kurulan ve motor açıkları ve kognitif bozukluk sigara çalışan fareler için karşılaştırıldığında farklı derecelerde gösterdi. Bu eser HI fare modeli üzerinde temel bilgileri sağlar. MRI görüntüleri beyin hasarı şiddetine göre motor ve Bilişsel testleri tarafından ayrılmış farklı fenotipleri göstermektedir.

Giriş

Yenidoğan HI beyin hasarı erken çocukluk (yaklaşık 1000 çocuk başına iki hasta)1,2,3,4,5sırasında oluşur. Yenidoğan HI beyin hasarı ile ilgili çalışmalar, ve önemli bir kurulan yenidoğan HI beyin yaralanması fare modeli kullanarak HI beyin hasarı in vivo preklinik araştırma kolaylaştırabilir.

Geleneksel HI modelleri üzerinde yetişkin fareler6kullanılır. Kardiyolojik modeli için pirinç-Vannucci yöntemi P7 fareler7,8yaygın olarak kullanılır. Sıçanlar ve fareler her iki kemirgen olsa bile biraz farklı9,10, olduğundan Ancak, biz bir değiştirilmiş pirinç-Vannucci yöntemi üzerinde CD-1 pups P7-10, tabanlı P7-10 dönemi olduğunu gösterdi önceki çalışmaları üzerinde gerçekleştirilen featuring olgunlaşmamış oligodendrocytes, insan terim P011,12karşılık gelen. Yenidoğan HI fare modeli P7-10 pups içinde tek taraflı Karotid arter her iki tüp ligasyonu ve fareler maruz hipoksi %8 oksijen ile kurulur.

Fareyi sağ hemisfer posterolateral alanında değişik derecelerde beyin lezyonları gösterdi yordamı tabi. Bilişsel ve motor açıkları, neurobehavioral değerlendirmeler üzerinde PAT dayalı tanımlamak için test ve kavrama gücü testi yürüyen merdiven yapıldı. Sigara işletilen (Yani, normal) ve HI fareler arasındaki farkları analiz edildi. Bu eser HI fare modeli hakkında temel bilgi sunar. MRI görüntüleri beyin hasar motor ve Bilişsel testleri kullanarak şiddetine göre ayrılmış farklı fenotipleri göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bütün hayvanlar standart bir kafeste (27 x 22,5 × 14 cm3) değerlendirme ve Akreditasyon, laboratuvar hayvan bakım (AAALAC) Derneği tarafından akredite edilmiş ve yiyecek verilen bir tesiste yer alan ve 12-h açık/koyu alternatif altında ad libitum su geçiş yapar. Yazarlar hayvan koruma hükümlerine takip ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Yonsei Üniversitesi Üniversite Tıp tarafından kabul edildi (IACUC No 2010-0252; 2013-0220).

1. fare modeli yenidoğan HI beyin hasarı

  1. Belgili tanımlık pups isoflurane ile anestezi.
    1. Belgili tanımlık pups (daha az 5) anesthetizing bir kutuya yerleştirin ve kapağını kapatın.
    2. Yaklaşık 15 dakika anesthetizing sistem açın; gaz ve tablo üst anestezi makinasıyla isoflurane ayarlayın. 1, 5 L/dak ayarlama isoflurane Buharlaştırıcı anestezi indüksiyon için 3-%5 için oksijen Flowmetre ayarlayın.
    3. 15 dk sonra isoflurane Buharlaştırıcı anestezi bakımı için 1-%2 için ayarlayın.
  2. Tam imzalat bir yavru bir diseksiyon mikroskop (araştırmacı karşı karşıya karin) altında yatıyordu ve bant ile sabitleyin.
  3. Bir ~0.7-mm kesi sterilize makas kullanarak boynundan olun.
  4. Dikkatle sterilize forseps kullanarak yağ dokusu kaldırmak ve tek taraflı şu Şah damarı açığa.
  5. 5-0 absorbe dikiş ile tek taraflı sağ Karotis arter ligate.
  6. Kesik boyun ile 5-0 Dikiş dikiş.
  7. Her yavru için kurtarma için 1 h 37 ° C sıcak hipoksik odası yerleştirin. Odası kapağını kapatmayın.
  8. Ameliyattan sonra 1 h ne zaman belgili tanımlık pups tamamen uyanık, hipoksi odası kapağını kapatın ve hipoksik koşullarını (%8 O2 , %92 N2) oluşturmak için gaz seviyesi azaltın.
  9. Hipoksi, 90 dakika sonra yavrular için onların kafes dönmek.
  10. Bir hafta sonra HI beyin hasarı, 1. adımı yineleyin.
    1. Anestezi sonra bir kesi ile sterilize makas ve forseps beyin lezyon sağ hemisfer posterolateral alanında tanımlamak için kafa derisi içinde olun.
      Not: Bu tedavi hipoksi pups içinde neden olmaktadır. Varlığı ve tüm farelerde beyin hasarının ölçüde görsel olarak değerlendirildi yarı saydam kafatası ile çıplak gözle. Boyut veya renk değişikliği (yani, beyin lezyon) hacmi tarafından belirlenen pups gruplar halinde sınıflandırılır. Hiçbir görünür kortikal yaralanma varsa, fare "hiçbir kortikal yaralanma" grup olarak sınıflandırılır. Görünür bir kortikal yaralanma (yani, bir lezyon sağ hemisfer) ise, fare "kortikal yaralanma" grup olarak sınıflandırılır. Fareler sınıflandırılması gruplar halinde ameliyat sonrası bir hafta beri beyin örnekleri türleri Morfoloji açıkça kurban1,2,3sırada tanımlanır gruplandırmalar değiştirilebilir, 4.

figure-protocol-1
Resim 1: farelerde neonatal HI beyin hasarı modelleme.
(A) bir yedi günlük eski fare yavru ameliyat oldu ve tek taraflı şu Karotid arter bakmaksızın. (B) pups hipoksik Odası %8 O2 ve % 92 N290 dk için yerleştirildi. (C, D ve E) Yenidoğan HI yaralanma ile beyin hasar çeşitli önem gösterdi ve hasarı derecesine göre kategorize edildi. Haftası 14, beyin elde edilmiştir ve bu lezyonlar görüntülenir. (C) bir "hiçbir kortikal yaralanma" gizli bir beyin görüntüsünü. Her iki (D) ve (E) "kortikal yaralanma" grup olarak sınıflandırıldı. (F, G ve H) Temsilcisi MRI (c), (D) ve (E) fareler, anılan sıraya göre. (F) hasar oluşur içinde sarı bir ok ile gösterilir ve sağ hemisfer lezyonlarının da sarı oklarla (G ve H) gösterilir. Ölçek çubukları = 1 mm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. yenidoğan davranış testleri

Not: Burada, 6 haftalık davranış testleri yapıldı.

  1. Pasif kaçınma görev.
    Not: bellek işlevi öğrenme ve caydırıcı bir uyarıcı kaçınma dayalı değerlendirmek için adım aracılığıyla bir iki bölmeli PAT yapılan13,14,15,16olması gerekir.
    1. Bir fare bir PAT aparatı pleksiglas Servisi kutusunu (41,5 × 21 × 35 cm3) parlak bölmesine yerleştirin.
    2. Sonra 30 s, giyotin kapı açık ve koyu bölmesine taşımak fare gecikme süresi saatlerini kaydetmek (300 s).
    3. Fare tüm dört bacaklarda tam içinde karanlık bölme olduğunda Giyotin kapıyı kapat.
    4. Elektrikli ayak şok yönetmek (0,5 mA) 2 s ve onun kafes fare dönmek için.
    5. Fareyi parlak yerde 24 saat elektrik ayak şoktan sonra değiştirin.
    6. Fare tamamen parlak kompartımanda yerleştirildikten sonra Giyotin kapı 10 s açın ve karanlık bölmesine taşımak fare gecikme süresi saatlerini kaydetmek (300 s).
  2. Merdiven yürüme testi.
    Not: Merdiven basamak yürüyen görev ince bozuklukları motor işlevleri birleştirerek nitel ve nicel analizler yetenekli yürüyen17,18arasında ayrımcılık için izin verir.
    1. Bir video kamerayı açın.
    2. Bir fare merdiven başlangıç paneli üzerindeki yeri ve hemen kayıt başlar.
    3. Fare bacaklarda üzerinde odaklanan video kaydetmek.
    4. Fare merdivenin son paneli dokunduğunda kaydı durdur. İleri geri seyahat dört kere tekrar edin.
    5. Video kaydı analiz ve el ile her forelimb notları aşağıdaki gibi sayma:
      1. Bir bilgisayar yavaş hızda video kaydı Çal (0.1 x) ve adımları el ile saymak.
  3. Kavrama gücü test.
    Not: Kavrama gücü test bir itme-çekme ağırlık ölçme esneklik detektörler içerir bir kavrama gücü ölçer kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. Kavrama gücü aparatı akrilik bir panel üzerine düzeltmek.
    2. Akrilik panelde yer bir fare ve onun kuyruk tutun.
      1. Fare erişebilmesi kuyruğunu tutan el ve kavrama cihazları metal tel taşıyın.
    3. Fareyi bir üçgen parça metal tel (2 mm çapında); kulpları kadar birden fazla deneme izin tepe Kuvvetleri gram cihaz tarafından otomatik olarak kaydedilir.
      Not: ortalama en yüksek güç üç denemeler analiz19,20,21için kullan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tüm veriler ortalama ± standart hata ortalamaya (SEM) ifade edilir. Değişkenleri iki grup arasında karşılaştırma bağımsız veya eşleştirilmiş tkullanılarak yapılmıştır-testi SPSS istatistik yazılımı. Bir p-değeri < 0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul.

Yenidoğan HI yaralanma ile beyin hasar farklı önem gösterdi ve buna göre kategorize edildi (şekil 1 c- E). Beyin Haftası 1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada biz HI beyin hasarı yenidoğan P7-10 CD-1 Mouse indüklenen ve beyin lezyon ile ilgili motor ve Bilişsel açıkları tespit. Bu işlem sırasında tek taraflı şu Karotid arter tıkanıklığı son derece önemliydi. Bu adımda, arter zarar görmüş ve yırtılmış. Çoğu yavru bir arter gözyaşı deneyimli öldü. Tersine, araştırmacılar tek taraflı şu Karotid arter yerine başka bir kan damarı bakmaksızın, yavru fok beyin sadece hafif hasar gördü ve hiçbir önemli fenotip24gözlenen.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

Bu çalışmada hibe Ulusal Araştırma Vakfı (NMK-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), Bilim Bakanlığı ve teknoloji, Kore, Kore sağlık teknoloji R & D Projesi (HI16C1012), Sağlık Bakanlığı tarafından desteklenen & Refah, Kore ve "Dongwha" fakülte araştırma yardım programı Yonsei Üniversitesi College of Medicine (6-2016-0126).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hipoksik odaJeung Do Bio & Plant CoDeneysel Oluşturucu
PAT cihazıJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
Merdiven basamağı yürüyenJeung Do Bio & Plant CoDeneysel Oluşturucu
SDI Kavrama Gücü SistemiSan Diego Instruments Inc.
Kavrama Gücü ÖlçerUgo Basile47200
Harvard Aparatı Fluovac anestezi sistemi Harvard Aparatı Anestezi
kutusuakrilik kutu
I-Fran Sıvı (İzofloran)Hana Pharm. Co., Ltd.Genel Anestezikler (izofluran 100ml)
CD-1 farelerOrient Co., Ltd.
Mavi Naylon Mono Emilmeyen sütür 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS İstatistikleriIBMVer. 23

Kaynaklar

  1. Yager, J. Y. Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn. Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).
  2. Vannucci, R. C., et al. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).
  3. Im, S. H., et al. Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).
  4. Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy? Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).
  5. Colver, A., Fairhurst, C., Pharoah, P. O. Cerebral palsy. Lancet. 383 (9924), 1240-1249 (2014).
  6. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
  7. Rice 3rd, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain. Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).
  9. Brazel, C. Y., Rosti 3rd, R. T., Boyce, S., Rothstein, R. P., Levison, S. W. Perinatal hypoxia/ischemia damages and depletes progenitors from the mouse subventricular zone. Dev Neurosci. 26 (2-4), 266-274 (2004).
  10. Buono, K. D., et al. Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia. J Neurosci. 35 (23), 8855-8865 (2015).
  11. Rumajogee, P., Bregman, T., Miller, S. P., Yager, J. Y., Fehlings, M. G. Rodent Hypoxia-Ischemia Models for Cerebral Palsy Research: A Systematic Review. Front Neurol. 7 (57), 1-20 (2016).
  12. Hagberg, H., Peebles, D., Mallard, C. Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8 (1), 30-38 (2002).
  13. Wi, S., Yu, J. H., Kim, M., Cho, S. R. In Vivo Expression of Reprogramming Factors Increases Hippocampal Neurogenesis and Synaptic Plasticity in Chronic Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Neural Plast. 2016 (2580837), 1-11 (2016).
  14. Lu, Y., Christian, K., Lu, B. BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory? Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).
  15. Manabe, T., et al. Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors. Nature. 394 (6693), 577-581 (1998).
  16. Alonso, M., et al. BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation. Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).
  17. Seo, J. H., et al. In Situ Pluripotency Factor Expression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia. Mol Ther. 24 (9), 1538-1549 (2016).
  18. Kim, M. S., et al. Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).
  19. Lee, M. Y., et al. Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain. Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).
  20. Rha, D. W., et al. Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice. Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).
  21. Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study. J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).
  22. Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study. NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).
  23. Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury. PLoS One. 8 (9), e74405(2013).
  24. Washington, P. M., et al. The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice. J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).
  25. Cho, S. R., et al. Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).
  26. Tsuji, M., et al. A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model. Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Unilateral Karotis Arter LigasyonuPasif Ka nma G reviMerdiven Y r me TestiKavrama G c TestiMRI G r nt lemeKortikal Hasar De erlendirmesiHipokampal HasarMotor Defisitler

İlgili makaleler