Hipokampal Theta Bandında Tuning In vitro: İzole edilmiş Kemirgen Protokokal Circüse Kayıt için Metodolojiler

Hipokampal teta salınımları (4 - 12 Hz), memeli beyinde ritmik aktivitenin en baskın formları arasındadır ve spatiotemporal bilginin işlenmesi ve episodik hatıraların oluşturulması gibi bilişsel işlevlerde anahtar rol oynadığı düşünülmektedir ^{1 , 2 , 3} . Theta modülasyonlu yer-hücrelerinin uzamsal seyrüsefer ve lezyon çalışmaları ile ilişkisini vurgulayan bazı in vivo çalışmalar ve klinik bulgular, hipokampal teta salınımlarının bellek oluşumu ^{4 , 5 , 6'da} yer aldığı görüşünü desteklemekle birlikte, ilişkili mekanizmalar Hipokampal teta salınımlarının oluşumu hala tam olarak anlaşılamamıştır. İn vivo erken araştırmalar, teta aktivitesinin esas olarak dışsal salınımcılara, özellikle de ritmik girdiye dayandığını ileri sürdüSeptum ve entorinal korteks ^{7 , 8 , 9 , 10} gibi aferent beyin yapılarından. Hipokampal sinir ağlarının iç bağlantısının hipokampal nöronların özellikleri ile birlikte intrensek faktörlerin rolü aynı zamanda in vitro gözlemlere dayanılarak ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} varsayımıyla da ileri sürülmüştür. Bununla birlikte, ^{19 , 20 , 21 numaralı} birkaç dönüm noktası çalışmasının yanı sıra, basit in vitro dilim hazırlamada fizyolojik olarak gerçekçi popülasyon aktivitelerini çoğaltabilen yaklaşım geliştirme zorluklarıUzun süredir hipokampüsün ve ilgili alanların kendi kendine teta salınımlarını üretme yeteneklerinin daha ayrıntılı olarak deneysel olarak incelenmesini geciktirdi.

Standart in vitro ince dilim deney ortamının önemli bir dezavantajı, beyin yapılarının 3D hücresel ve sinaptik organizasyonunun tehlikeye girmesidir. Bu, lokalize gruplardan (≤1 mm yarıçapı) bir veya daha fazla beyn alanına (> 1 mm) yayılmış nöron popülasyonlarına kadar uzanan uzaysal olarak dağıtılan hücre gruplarına dayanan uyumlu ağ faaliyetlerinin birçok formunun desteklenemediği anlamına gelir. Bu düşünceler göz önüne alındığında, otonom titreşimlerin hipokampusta nasıl ortaya çıktığı ve ilgili kortikal ve subkortikal çıkış yapılarına nasıl yayılacağı üzerinde farklı bir yaklaşım gerekiyordu.

Son yıllarda, çift yönlü intera incelemek için "komple septo-hipokampal" preparatın ilk gelişimiiki yapı ²² ve "izole edilmiş hipokampus" preparasyon ardından gelen evrimin seksiyonlar, içsel teta salınımlar dış ritmik girişi ²³ eksik hipokamp spontan olarak meydana çıkarmıştır. Bu yaklaşımların değeri, in vitro ^22'de bir teta ritm jeneratörü olarak işlev görmek için bu bölgelerin tüm fonksiyonel yapısının korunması gereken ilk anlayışa dayanmaktadır.

Tüm işlemler, McGill Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Canadian Care on Canadian Care Council tarafından onaylanan protokollere ve yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Akut Hipokampus İn Vitro Hazırlık

NOT: Sağlam hipokampal preparatın izole edilmesi üç ana aşamadan oluşur: (1) solüsyonların ve ekipmanın hazırlanması, (2) hipokampüsün diseksiyonu ve (3) intrensek teta salınımlarının oluşturulması için gerekli olan hızlı perfüzyon oranının ayarlanması. Bu protokolde, diseksiyondan rekorda prosedürlerin zamanında uygulanması özellikle önemlidir, çünkü izole edilmiş hipokampüs, yapının in vitro işlevsel bağlantısını korumanın büyük önem arzetmesi için yoğun ama narin bir hazırlık oluşturmasıdır. Herşeyi önceden hazırlamak, hücre d en aza indirmek için mümkün olduğunca erken bir perfüzyon seviyesinin mevcut olmasını sağlarFizyolojik fonksiyonu sürdürür ve sürdürür.

1. Sükroz bazlı yapay Serebral Spinal Sıvı (aCSF) çözeltisi
   1. Diseksiyon ve post-diseksiyon inkübasyon için kullanılacak 1X stok sakaroz çözeltisi hazırlayın. Tablo 1'de listelenen tüm bileşenleri CaCl ₂ hariç olmak üzere 1 L iyonu alınmış suya birleştirin ve en fazla 2 hafta süreyle 4 ° C'de saklayın.
2. Standart aCSF çözümü
   1. Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında izole edilmiş hipokampüsün yüksek akış hızı perfüzyonu için standart aCSF hazırlayın. Konsantre edilir (5X) stok aCSF yapmak için, 4 ° C'de iyonu giderilmiş su ve mağaza 2 L, _CaCl2 hariç Tablo 2'de listelenen tüm bileşenleri, çözülür.
3. Ekipmanı hazırla
   1. Diseksiyona başlamadan önce, tezgah alanını buz dolu bir plastik tepsi (30 x 20 x 5 cm), karbogen bağlı tüp hatları ve trEe cam Petri kapları (10 x 2 cm) (Bkz. Şekil 1 ).
   2. 500 mL'lik bir behere 300 mL sükroz çözeltisi (1X stok) ekleyin, karbojen (% 95 O ₂ ,% 5 CO ₂ ) ile kabarcıklayın ve Ca ²⁺ [1.2 mM] ekleyin.
   3. 60 mL'lik bir sakaroz çözeltisini bir cam Petri kabına aktarın ve oda sıcaklığında bırakın. Gerisini, 10 ° - 15 dakika boyunca 4 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
   4. Diseksiyon boyunca karbojen ile buz gibi sakaroz çözeltisini kabarcıklar.
   5. Sakkaroz solüsyonu (4 ° C) ile ikinci bir Petri kabını (soğuk tutma odası) doldurun ve buzda tutun.
   6. 50 mL'lik bir behere 30 mL buz soğuk sakaroz çözeltisi ekleyin.

2. Tüm Hipokampus Diseksiyonu

NOT: İzole edilmiş hipokampüsün ayrıştırılması için kullanılan yöntem esas olarak ^22'de tarif edilen ve geliştirilen yöntemle özdeştir, fakat peRfüzyon hızı ve kayıt teknikleri.

1. Beyin diseksiyonu
   1. Fareye (P20 - 35), kafese eklenen 1 mL izofluran (% 100) ile ıslatılmış küçük bir kağıt havlu ile duman kapağı altında anestezi uygulayın.
   2. Anestezi uygulanmış fareyi kesiniz ve başlığı buz gibi soğuk sakaroz çözeltisine (50 mL beher, ~ 5 s) daldırın. Kağıt havluya aktarın.
   3. Medial deri insizyonu (rostral kaudal) yapmak için bir neşter kullanın ve kafatası maruz kalacak şekilde kenarlarından itin.
   4. Kafatasını küçük bir makasla açın ve beyin hızla özütlemek için bir spatula kullanın ve buz gibi sakaroz çözeltisi içeren Petri kabına koyun. Beyinin soğuması için 1-2 dakika bekleyin.
   5. Beyin iyileşirken, buz üzerinde bir lens kağıdı kaplı Petri (diseksiyon) çanağına 2 - 3 mL sakaroz çözeltisi ekleyin.
2. Hipokampusu izole etme
   1. Beyni diseksiyon çanağına dik duran bir positio üzerine yerleştirinn.
   2. Bir bıçak ağzı ile serebellum ve frontal korteksi çıkartın. Beyni midsagital düzlem boyunca yarı yarıya kesin ve iki izole yarımküreyi tutma odasına geri gönderin. İyileşme için 1-2 dakika daha bekleyin.
   3. Tekli hemisected beyin diseksiyon yuvasına dik yerleştirin.
   4. Midsagittal yapılar gözlemciye bakana dek çanağı döndürün ve septal kompleksin gömülü anahatları, talamusun önündeki ince bir armut şekilli doku katmanı olarak görülebilir.
   5. Hemiset bulunan beyini mikro spatula ile sabit tutun ve politetrafluoroetilen (PTFE) kaplı spatula'nın küçük ucunu septal bölgenin hemen arkasına (kaudal) yerleştirin.
   6. Kaplanmış spatula septumun altına yerleştirin ve ucu aşağıya doğru diseksiyon çanağına ulaşana kadar aşağıya doğru hareket ettirin. Septal bölgede kaudal bağlanan lifleri ayırın. Aynı işlemi septumun ön kenarı boyunca tekrarlayın ve beynin ön kısmına bağlanan lifleri kesin.
   7. Spatula hafifçe korteksin iç kısmını hipokampüsten dik konumda tutarak, talamik, hipotalamik ve kalan beyin sapı çekirdeklerini dikkatle aşağı çekmek için mikro spatuyu kullanın. Çıkarılan dokuyu kesmek ve çıkarmak için spatula kullanın.
   8. İzole edilmiş yarımkürede yan tarafını çevirin ve hipokampüsün dış çizgisini belirleyin.
   9. Kaplamalı spatula, yanal ventriküle, dorsal hipokampüsün rostral ucunun altına yerleştirilir.
   10. Spatayı yatay olarak hemiplejik beyin midsagital düzlemiyle aynı hizaya getirin ve ucun kaudal yönde ortaya çıkıncaya kadar ventriküler duvarların pürüzsüz konturuyla kaydırın.
   11. Hipokampusun altında spatula tutun ve hafifçe onu bağlayan elyaf üzerine basın, iç katman boyunca hipokampus üst korteks ile katılır. Mikrogözenekleri bu tabakanın dış tarafına uygulayın ve kaplama spatula üzerine kaydırarak bağlantı fiBers.
   12. Çıkarmayı tamamlamak için diseksiyon çanağını döndürün ve kaplamalı spatula'yı ventral hipokampüsün altına yerleştirin. Hafifçe kortikal katın iç kısmını spatula ile tutun ve mikro spatulaya karşı dilim hareketi kullanarak entorinal bağlantıları kesin.
       NOT: Bütün septohipokampal kompleks, kaplanmış spatülün tüm hipokampüsün altına yerleştirilmesi ve geri kalan beyin dokusunun altından çıkarılmasıyla çıkarılabilir.
   13. İzolasyon tamamlandıktan sonra, hipokampüsü yemeğin üzerinde tutun ve soğuk tutmak için bir damla buz soğuk sakaroz çözeltisi ekleyin. Kalan tüm korteksi ve lifleri dikkatlice kesin ve forniks içerisine hafifçe bir traş bıçağı uygulayarak hipokampusu septumdan ayırın.
       NOT: Yama tutturma kayıtları piramidal hücrelerden gerçekleştirilecekse (bkz. Kısım 4.6 Optogenetik kontrol), izole edilmiş hipokampus, CA1'in piramidal tabakasını açığa çıkarmak için 45 ° açıyla çapraz olarak kesilebilir ("anglE-cut "hazırlığı), hipokampüsün geri kalan kısmındaki yerel ağ devresinden ödün vermeden.
   14. Preparat oda sıcaklığında sükroz çözeltisine aktarın ve kayıt odasına aktarılmadan önce 15-30 dakika geri kazmasına izin verin.

3. İzole Hipokampusu Kaydetmek İçin Hızlı Perfüzyon Kurma

1. 20 - 25 mL / dak'da oksijenli aCSF'nin sürekli yüksek hızlı girmesini sağlamak için yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemini kurun.
   1. Önceden bir CSF (1X) şişeler hazırlayın ve deney başlamadan önce en az 15 dakika boyunca onları ısıtma banyosuna (~ 30 ° C) daldırın. Hat çözümü ısıtıcı sistemini açın (30 ° C).
   2. Deney boyunca aCSF oksijen ve [mM 2], önceki perfüzyonun başlamasından _CaCl2 eklemek için bir karbojen tankına bağlanan akvaryum kabarcık oluşturucu ve boru hatları kullanın.
   3. ACSF akışını durdurun ve hipokampüsünü geniş kullanarak kayıt odasına aktarınBir cam pipetin ucunda. Sakaroz doymuş preparatın batmasına ve altına yerleşmesine izin verin.
   4. Hazırlama yüzeyini CA1 ve SUB düz yüzeyleri üstte olacak şekilde kayıt odasının merkezine yerleştirin (giriş-çıkış ekseni doğrultusunda). Septal ve temporal ekstremitelerde küçük ağırlıklarla hipokampusu dengeleyin ve aCSF akışını yeniden başlatın.

4. İzole Hipokampusta Elektrofizyoloji

1. İn vitro hippokampal teta salınımlarının ekstraselüler kayıtları
   1. Lokal Alan Potansiyelinin (LFP) hücre dışı izlenmesi veya in vitro izole edilmiş hipokampüsten alınan tekli ünite aktivitesi için aCSF ile dolu cam mikropipetler (1 - 3 MΩ) kullanın. Kazanç x1000, çevrimiçi bant geçiren filtreleme 0.1-500 Hz ve örnekleme hızı 5-20 kHz olan bir patch clamp amplifikatör ile düşük gürültülü AC-bağlı alan potansiyel sinyallerini kaydedin.
      NOT: Bu protokolde kullanılan özel yapılı mikroskopHipokampüsün düşük büyütme görüntüsü için düşük (2,5X) ve yüksek büyütme (40X) hedefleri ile birlikte tek hücreli tanıma için kızılötesi video mikroskopisi ve epifloresans ile donatılmıştır. Bu sistemin bileşenleri dik flüoresan mikroskop, flüoresan filtre küpleri, analog video kamera ve görüntüleme yazılımı olan dijital çerçeve kaptör, nöronal kayıtlar için yüksek performanslı mikromanipülatörler ve sahne özel perfüzyon odası ( Şekil 2A , inset i) Optik fiber yerleşimi.
   2. Hipokampal preparatın düşük büyütme (2.5X) altında incelenmesi için mikroskopta monte edilen kamerayı bir bilgisayar ekranına bağlayın ve dış yüzeye herhangi bir alttan kesik veya hasar olmadığını hızla kontrol edin. Alfabe elyaflarının CA1'in pürüzsüz yüzeyi boyunca diyagonal olarak yönlendirilmesi, iletilen ışığı hipokamdan parlattığında görülebilir olmalıdır ( Şekil 2A , ekteki ii)irin.
   3. İzole edilmiş hipokampüsün ve LFP elektrotlarının belirli kayıt konumlarına yerleştirilmesini görüntülemek için düşük büyütmeli geniş alan hedefini kullanın.
      NOT: Şekil 2A'da , farklı kayıt yerlerine yerleştirilmiş çok elektrotlu izole hipokampal preparatın bir düzeni gösterilmiştir.
   4. Bir LFP elektrotunu CA1 alanının yüzeyine (alveus) dokunana kadar banyoya indirin.
      NOT: Bu, genellikle, AC birleşimli kayıtta, elektrot kayıt ortamıyla temasa geldiğinde olana benzer şekilde hızlı bir geçiş üretir. Bir ses monitörü, bu adımdan sonra LFP kanal sinyalini dinlemek için yararlı olabilir.
      NOT: Genellikle, erken aktivite belirtileri yalnızca 10-15 dakika sonra ortaya çıkacaktır, bu nedenle hazırlığın hızla ilerlememesi önemlidir. Yüzey LFP elektrodu hala bu aktiviteyi takip edemezse, stratum oriensleri boyunca biraz ilerletinVe ana hücre katmanına yaklaşırken herhangi bir etkinlik biçiminin olup olmadığını görmek için periyodik olarak duraklatın. Başka bir şey 5-10 dakika sonra algılanmazsa, elektrodu dikkatli bir şekilde geri çekin ve aynı bölge boyunca başka bir yere yerleştirin.
   5. LFP elektrodunu piramit tabakası boyunca ilerletin. Münferit nöronlardan (çoğunlukla piramidal ve inhibitör sepet hücrelerinden) tek birimli deşarj bulunursa, hücre dışı spor aktivitesinin başlangıçta arttığını gözlemleyin. Elektrotu daha da alçaltın ve ucu radyasyona geçerken yayılma tekrar solmaya başlar. Kayıt mevkisi radyasyon yoluyla düştüğü için, teta frekans aralığında (4 - 12 Hz) açıkça görülebilen ağ salınımının belirginleştiğini ve maksimum genliğe (~ 100 - 300 μV) ulaştığını gözlemleyin.
2. Tek bir bölgede teta salınımları
   1. CA1 bölgesi boyunca spontan teta salınımlarının mekansal özelliklerini test etmek için, ucunFa referans LFP elektrodunu medial CA1 bölgesinde (medialde uzunlamasına septo-temporal eksende bulunur) ve daha önce tarif edildiği gibi radyasyona indirgemektir.
   2. İkinci bir LFP elektrodu bir CA1 alanına (200 - 800 um septal veya ilk LFP'den temporal) yerleştirin ve CA1 teta salınımlarının nispeten geniş mesafelerde senkronize olabileceğini gözlemleyin.
3. Katlar arası teta salınımları
   1. Hipokampal tabakalardaki teta salınımlarının özelliklerini test etmek için bir CA1 radyasyon sitesinde bir referans LFP elektrodu bırakın. Tabaka oriflerinin hemen üstünden başlayarak ikinci bir elektrotu piramidal hücre katmanına ve radyasyon yoluyla indirgeyin. Piramit katman boyunca LFP sinyalinin kademeli olarak tersine çevrilmesini (bağıl faz tersine çevirme) izleyin.
      NOT: Bu tür aktivitelerin temsili örnekleri için bkz. Şekil 2B . Laminer / derinlik profilleri ve Akım Kaynak Yoğunluğu (CSD) analizlerine örneklerIzole hipokampusta faz geçişi yerini göstermekte olup daha önce ^{23 , 24 , 25} yayınlanmıştır.
4. Sağlam hipokampusta gam osilasyonları ve teta-gama kuplajı
   1. CA1 / SUB kenarlığına bir alan elektrod yerleştirin ve piramidal ve molekül katmanları arasındaki ara yüze oturuncaya kadar aşağı indirin. Bu seviyede, genlikte değişikliklerle birlikte açık gama titreşimleri sergileyen bir alan potansiyeli, yerel teta ritmine faz kilidi kaydedilebilir ²⁴ . Teta-gama bağlantının yavaş zaman ölçeğini gözlemlemek için ölçeklemeyi ayarlayın. Gama patlamaları, yavaş (25-50 Hz) ve hızlı gamma (150-250 Hz) aralığında devam eden LFP sinyalini bant geçiren filtreleme ile ortaya çıkartabilen iki farklı frekans bandında ortaya çıkar. (Temsil edilen filtreleme için Şekil 2C'ye bakın. izleri).
5. In vitro hipokampal teta salınımlarında tüm hücre yaması kelepçesi kaydı
   NOT: Protokolün bu bölümünde, PV destekleyicisinin kontrolü altındaki floresan proteini, tdTomato'yu eksprese eden transjenik PV-TOM farelerinden izole edilmiş hipokampideki belirlenmiş internöronlardan, görsel olarak yönlendirilen tüm hücre yaması tutam kayıtlarını elde etmek amaçlanmıştır (for Daha fazla bilgi için bkz. Malzemeler ve Ref. ²⁶ ).
   1. Bir PV-TOM faresinden alınan bir hipokampal preparatın yüzeyinin yakınında bulunan tdTomato pozitif internöronlarını görselleştirmek için düşük (2.5X) ve yüksek güç (40X) büyütme ile floresan video-mikroskopi kullanın ( Şekil 3 ). PV-TOM nöronları alveus yoluyla (100 μm'ye kadar) yama için başarıyla görselleştirilebilir ve hedeflenebilirken, hipokampus açılı kesim tekniği ile hazırlandığında floresan olmayan piramidal hücrelere nispeten kolayca ulaşılabilir (bkz. Bölüm 2.2.14 notu).
   2. Hipokampusun düşük büyütme görüntüsünde, patch clamp deneyleri hazırlanırken teta salınımlarını izlemek için CA1 / SUB'da bir LFP elektrodu yerleştirin.
   3. 40X büyütme moduna geçin ve hedefi hedef bölge üzerine daldırın; Üst katmanlar görünene kadar indirin. Karşı taraftan yama pipet yaklaşımı için yeterli açık erişim sağlamak için mikroskopun konumunu değiştirin.
   4. Floresan mikroskopi altında, bir floresan PV-TOM hücresi seçin ve standart hücre içi çözüm ile dolu bir yama pipet (2 - 3 MΩ) ile yaklaşın.
   5. Pipete hafif pozitif basınç uygulamak için bir ağızlık kullanın ve elektrot hücreye indirildiğinde direnci izleyin. İpucu hedef hücre ile karşılaştığında, pipet direnci artar ve pozitif basınç membran üzerine itildiğinde net bir çukur belirir. Basıncı tahliye edin ve bir mühür oluşmaya başlarken akım darbesinin düzgünleştiğini kontrol edin. Hemen clAmplifikatör ile hiperpolarize bir potansa (-70 mV) getirin ve bir kez GΩ mühür elde edildikten sonra, hücre zarını pipet tutucu yoluyla uygulanan küçük miktarda negatif basınç ile parçalayın.
   6. Tam hücre konfigürasyonuna girdikten sonra, spontan hipokampal salınımlar sırasında tanımlanan PV hücrenin fizyolojik özelliklerini inceleyin ( Şekil 3B ).
   7. PV hücrelerinden alınan hücre içi membran potansiyel kayıtlarının hızlı yayılma davranışı ve devam eden CA1 / SUB teta ritmine senkronize edilen aksiyon potansiyelleri patlaması ile karakterize edildiğini gözlemleyin.
   8. Voltaj kelepçesine geçin ve intrinsik ritmik aktivite tarafından üretilen inhibitör sinaptik akımlara karşı eksitatörün oranını karakterize etmek için hücreyi farklı zar potansiyellerinde tutun. Piramidal bir hücreden yama kelepçesi kaydı örneği, karşılaştırma için Şekil 3A'da gösterilmiştir.
6. İzole edilmiş hipokampusta optogenetik kontrol Not: Bu hücreler izole hipokampus ²⁵ ana hücre popülasyonları senkronize önemli bir rol oynadıkları gösterilmiştir olarak hipokampal ağ etkinliğinin Optogenetic kontrolü için, PV içeren GABAerjik hücrelerinin ritmik aktivasyonunu kapsayan bir hücre tipi özel stratejisi burada kullanılır. PV hücrelerinde eksitatör kanalı rhodopsin-2'nin (ChR2) seçici ifadesi, PV-Cre fare hattını, ChR2 Cre'ye bağlı olarak ifade eden farelerle (Ai32) çaprazlamak, böylece PV-ChY fareleri üretmek sureti ile elde edilir. Alternatif olarak, viral vektör yapıları ( örneğin , AAVdj-ChETA-eYFP), CA1 / SUB internöronlarında eksitatör opsin ekspresyonunu yönlendirmek için PV-Cre veya PV-TOM farelerinin hipokampusuna (P15-16) enjekte edilebilir ( Şekil 4A ).
   NOT: Bu strateji daha önce ²⁵ açıklanmıştır.
   1. CA1 / SUB alanına bir LFP elektrod yerleştirin ve izole edilmiş hipokoda yakınlardaki bir piramidal hücreyi yamalayınAmpulü fotovoltaj hücrelerinde mavi ışığa duyarlı eksitatör opsin ChR2'yi ifade etti.
   2. Hipokampal preparatın üzerine bir optik fiber ışık kılavuzu (0,2-1 mm çap) yerleştirin ve kaydedilen bölgenin üzerine ortalayın. Optogenetik uyarımı için bir LED kaynağından mavi ışık (473 nm) kullanın; ışık darbelerinden (10- 20 ms, bir transistör-transistör mantık sinyali tarafından tetiklenir) veya sinir dalga voltaj komutlarını teta frekanslarında (4-12 Hz) teslim edin.
      NOT: Özel LED tabanlı ışık uyarı tertibatı başka bir yerde tarif edilmiştir ²⁵ .
   3. Kendiliğinden teta salınımları sırasında piramidin aktivitesini karakterize etmek için mevcut kelepçeye geçin.
   4. Uyarılma protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Kaydedilen nörondaki alan salınımlarının ve sinaptik aktivitenin optogenetik uyarılma esnasında gittikçe senkronize edildiğini ve PV hücrelerinin ritmik hızlanmasının hem frekansın sağlam bir kontrolü sağladığını gözlemleyinSaya ve salınımların gücü ( Şekil 4 ).

Bu bölüm , in vitro fare izole hipokampal preparatta teta salınımlarını inceleyerek elde edilebilecek sonuç örneklerini göstermektedir. İzole edilmiş hipokampüsün çıkarılması için diseksiyon prosedürü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu preparatı kullanarak intrensek teta salınımları, çoklu alan elektrodlarının yerleştirilmesi sırasında incelenebilir, izole edilmiş hipokampüsün farklı bölgelerindeki ve katlarındaki nöronal popülasyonlara genel aktivite ve senkronize sinaptik girdiler kaydedilir ( Şekil 2 ). Eşzamanlı tüm hücre yaması kelepçesi ve hücre dışı kayıtların temsilci sonuçları spontan hipokampal teta salınımları sırasında spesifik hücre tiplerinin ateşleme ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için sunulmuştur ( Şekil 3 ) ve ayrıca ritmik aktivitenin optogenetik manipülasyonu sırasındaG "> Şekil 4).

Şekil 1: İzole edilmiş bozulmamış hipokampus hazırlığı için diseksiyon prosedürü.
( A ) Diseksiyon kurulumunun genel görünümü. Sağ üst: karbojenlenmiş buz soğukluğunda sakaroz çözeltisi şişesi (1); Sol alt: buz dolu plastik tepsi (2) diseksiyon çanağını lens kağıdıyla (3) tutarak; Sakaroz çözeltisini (4) içeren soğuk tutma odası; Ve bir dizi cerrahi alet (5). ( B ) Diseksiyon çanağındaki hemiseksiyon öncesi fare beyninin görünümü. ( C ) Soğuk tutma odasında hemisected beyin geri kazanıp, septumun altındaki kaplanmış spatula küçük ucunu yerleştirmeden önce sol beyin yarı küresinin yakınlaştırılmış görünümü (inset). ( D ) İzole edilmiş hipokampusun altında, CA1 / SUB bölgesi boyunca kalan beynin bulunduğu kaplamalı spatulaDoku alttan çıkarılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Batık Kayıt Odasındaki Hasarsız Hipokampal Hazırlığından In vitro Teta Salınımlarının Kaydedilmesi İçin Yapılandırmanın Yapılandırılması.
( A ) İzole edilmiş hipokampüs, hipokampal bölgelerin bir düzeniyle ve septometrik olarak dağıtılan dört farklı kayıt alanına (beyaz yıldızlarla gösterilen) yerleştirilen çoklu elektrotlarla gösterilir. Yukarıda gösterilen kayıt odacığı platformu (ekteki i) açısından, hızlı-perfüzyon akışı için giriş ve çıkış numaraları (1, 2) numaralarıyla gösterilir. Aşağıda gösterilen hipokampüsün büyütülmüş görüntüsünde (içeçek ii), tek bir elektrod ortaSepetotemporal CA1 ve alveusların lifleri, subikülümün karşısına çapraz olarak ilerleyerek kolayca görülebilir. S: septal, T: zamansal, f / fx: fimbria-fornik. ( B ) Katman orifiyallerinden (gri) ve katman radyasyonundan (siyah) eşzamanlı olarak kaydedilen temsili LFP izleriyle CA1 katmanlarının organizasyonunun şematik temsili. İki kat arasındaki sinyallerin ters fazını not edin. Alv: stratum alveus, Halkla ilişkiler: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Filtrelenmemiş sinyalden CA1 / SUB alanından (20 sn segment) ve 2 sn genişletilmiş segmentlerden (aşağıda) kaydedilen spontan teta salınımını gösteren örnek LFP izi; Teta frekansları (0.5-12 Hz) için bant geçiren filtreleme; Yavaş gam (25-55 Hz); Ve hızlı gama (125-250 Hz). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Bir PV-TOM Faresinden Sağlam Hipokampal Hazırlamada Spontan Teta Salınımları Sırasındaki Piramidal Hücrenin ve PV Interneuronun Hücre Tipi Spesifik Aktivitesi.
( A ) Theta salınımlarında bir piramidal hücreden kaydedilen sinaptik aktivite. Akım kıskaç izleri (sol panel), dinlenme sırasındaki spontan ancak ritmik ateşlemeyi ve yavaş yavaş ortaya çıkan LFP salınımıyla açıkça senkronize edilmeyen inhibitör postsinaptik potansiyelleri (iPSP'ler) göstermektedir. Voltaj kelepçesi kayıtları (sağ panel), karşılık gelen inhibitör postsinaptik akımların (iPSC'lerin) -70 mV civarında ters potansiyel taşıdıklarını göstermektedir. ( B ) Sinaptik aktivite, teta salınımları sırasında hızlı spike olan bir fluoresan PV internörüründen kaydedildi. Akım kıskaçında (solda), bu hücre kendiliğinden geride ateş ediyor ve ritmik eksitatör poStsynaptik potansiyelleri (ePSPs) dengeli LFP titreşimi ile faz kilitli idi. Voltaj kelepçesi kayıtlarında (sağda) eksitatör postsinaptik akım geri dönüşüm potansiyeli yaklaşık 0 mV idi. Şematik çizimler, deneysel düzeneği, kaydedilmiş piramidal hücre ve floresan PV internöronunun CA1 / SUB ve yüksek (40X) büyütme görüntülerinde yama ve alan elektrotlarının yerleştirilmesi ile birlikte göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: İzole Hipokampusta Spontan ve Optogenetik Olarak Titreşimler Sırasında Tek CA1 / SUB Piramidal ve PV Nöronlarından Lokal Alan Potansiyel ve Eşzamanlı Yama Kelepçe Kayıtları.
( A B ) Kaydedilen hücrenin tipik Regular-Spiking (RS) özelliklerini (üstte) ve yüksek büyütme (40X) görüntüsünü gösteren bir piramidal nöronun karakterizasyonu (altta). ( C ) Aynı hücrenin depolarize membran potansiyelinde (siyah) LFP sinyaliyle (gri) birlikte örnekleme ve spontan salınım sırasında (solda) ve teta frekansı (6 Hz) ışık uyarı srasnda senkronize ritmik IPSP'leri gösteren örnek akım-kelepçe kaydı sağ). Işık uyarımının deseni (mavi gölgeleme) gerilim izlerinin üstünde tasvir edilmiştir. ( D ) 6 Hz ışık simülasyonundan önce, sırasında ve sonrasında LFP dalga formunun spektrogramı ve güç spektrumu (taban çizgisi, uyar, mesaj). ( E ) İzolatın düşük büyütme parlak-alan ve floresan görüntüleriCA1 / SUB bölgesinde lokalize eYFP flöresanını (yeşil renkte) gösteren bir hippokampal preparat. ( F ) Kaydedilmiş bir PV-TOM interneuronunun Hızlı Spike (FS) davranışını gösteren şu andaki basamaklar karakterizasyonu (40X floresans görüntüsü). ( G ) Spontan alan salınımı sırasında (solda) ve 3 saniye sonra ışık uyarımı sırasında (sağda) LFP sinyaliyle senkronize edilen kaydedilen PV hücresinin büyük EPSP'lerini ve ritmik ateşlemesini gösteren membran potansiyel kaydı. ( H ) CA1 / SUB LFP sinyali üzerinde PV hücresi sivri uçlarının alan tetiklemeli ortalaması (FTA). PV hücrenin birden çok deneme boyunca boşaltılması (LFP doruklarına odaklanmıştır), spontan salınım (taban çizgisi) sırasında ve ışık uyarımı sırasında (stim) kaydedilen sivri uçların bir FTA'sına dönüştürüldü. Orta ve alt grafikler, sivri uçların ve sıçrama olasılığı histogramlarının raster çizimlerini göstermektedir (ortalama olasılık kırmızı renkte gösterilir). En üstteki grafikler, lig sırasında güç artan ortalama LFP sinyalinin grafiğini göstermektedirHt stimülasyonu, PV hücrenin yüksek oranda senkronize ateşlemesine paralel olarak LFP salınım zirvesine faz kilitli olarak uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

İZOLELİ HİPOK KAMPÜSÜ İÇİN İLAÇ ÇÖZÜMLERİ (1X)
(Ana çözelti)
bileşik	MW	Final Conc. (mM):	1 L (g) için miktar
sakaroz	342.3	252	86.26 g
NaHCO 3	84,01	24	2.020 g
glikoz	180.2	10
KCl	74,55	3	0.223 g
MgSO 4	120.4	2	0.241 g
NaH2 4	120	1.25	0.150 g
CaCl2 .2H2O [1 M] hazır	147	1.2	120 uL / ​​0.1 L *
* 360 uL CaCl2 [1 M] 0.3 L oksijenli sukroz çözeltisi için ilave
		Oksijenlendiğinde pH = 7.4, Osm 310-320

Tablo 1.

PERFÜZYON İÇİN STANDART ACSF ÇÖZÜMLEMESİ (5X)
(Ana çözelti)
bileşik	MW	Final Conc. (mM):	2 L 5X Miktarı
NaCl	58.44	126	73.6
NaHCO 3	84,01	24	20.2
glikoz	180.2	10	18
KCl	74,55	♦ 4.5	3,355
MgSO 4	120.4	2	2.41
NaH2 4	120	1.25	1.5
askorbat	176.1	0.4	0.705
CaCl2 .2H2O [1 M] hazır	147	2	2 mL / L *
X 1 L CSF (1 kez) oksijenli çözelti 2 mL CaCl2 [1 M] ekleyin
		Oksijenlendiğinde pH = 7.4, Osm 310-320
♦ Bu aCSF solüsyonu (normal aCSF 2.5 mM KCl'ye kıyasla) biraz yükselmiş [K + ] o, hipokampal ağların eksitabilitesini arttırmak ve teta salınımlarının oluşumunu kolaylaştırmak için kullanılır.

Tablo 2.

Yazarlar rakip ticari veya finansal çıkarların olmadığını beyan ettiler.