Yöntem makalesi

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

DOI:

10.3791/55869

⸱

27 Temmuz 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok sayıda hücresel protein, temel hücre proseslerini etkilemek için membran yüzeyleriyle etkileşir. Bu etkileşimler, spesifik subselüler lokalizasyon ve / veya aktivasyonu sağlamak için, fosfoinositidler (PIPs) durumunda olduğu gibi bir zar içerisinde spesifik bir lipid bileşenine yönlendirilebilir. PIP'ler ve hücresel PIP bağlanma alanları, hücresel fizyolojideki rollerini daha iyi anlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir. Protein-PIP etkileşimlerini incelemek için bir araç olarak desteklenen lipid bilayerlere (SLB'ler) bir pH modülasyon testi uyguladık. Bu çalışmalarda, pH'ye duyarlı orto- Sülohodamin B konjuge fosfatidiletanolamin, protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılmıştır. Bir proteinin bir PIP içeren membran yüzeyine bağlanmasının ardından ara yüzey potansiyeli, probun proton durumunu değiştirerek modüle edilir ( yani , yerel pH'daki değişim). PH modülasyon tahlilinin başarılı bir şekilde kullanılmasına ilişkin bir vaka çalışması, fosfolipaz C delta1 PleckstrHomoloji (PLC-δ1 PH) etki alanı ve bir örnek olarak fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) etkileşim içinde. Bu etkileşim için görünür çözülme sabiti ( Kd , app ) , diğerleri tarafından elde edilen Kd , app değerlerine benzer olarak 0.39 ± 0.05 μM idi. Daha önce gözlemlendiği gibi, PLC-δ1 PH alanı, PI (4,5) P 2 spesifiktir, fosfatidilinositol 4-fosfata karşı daha zayıf bağlar ve saf fosfatidilkolin SLB'ye bağlanma göstermez. PIP-on-a-chip testi, düşük örnek hacmi ve ligand / reseptör işaretleme gereksinimleri olmaksızın, geleneksel ve düşük PIP bağlanma deneyleri karşısında avantajlıdır, yüksek ve düşük afiniteli membran etkileşimlerini hem küçük hem de Büyük moleküller ve geliştirilmiş sinyal / gürültü oranı. Buna göre, çip üzerinde PIP'in kullanılması, çok çeşitli membran etkileşim mekanizmalarının aydınlatılmasını kolaylaştıracaktır. Dahası, bu yöntem muhtemelenProteinlerin membranlarla etkileşime geçme kapasitesini modüle eden terapötiklerin belirlenmesinde sed.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sayısız etkileşimler ve biyokimyasal işlemler iki boyutlu sıvı zar yüzeylerinde gerçekleşir. Ökaryotik hücrelerdeki zarla kapalı organeller, sadece biyokimyasal süreçlerde ve bunlarla ilişkili proteomda değil aynı zamanda lipit kompozisyonlarında da eşsizdir. Fosfolipidlerin olağan dışı bir sınıfı fosfoinositidlerdir (PIP'ler). Hücresel lipidomun sadece% 1'ini oluşturmalarına rağmen, bunlar 1 , 2 , 3 , 4 diğerleri arasında sinyal iletiminde, otofajiyede ve zar ticaretinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Hücresel PIP kinazlar tarafından inositol baş grubunun dinamik fosforilasyonu yedi PIP mono- ana grupları, bis- veya tris-fosforile 5 yol açar. Ek olarak, PIP'ler membranların subselüler kimliğini tanımlar ve bir veya daha fazla fosfoin içeren protein / enzimler için özel membran yerleştirme siteleri olarak görev yaparlarÖrneğin Pleckstrin Homolojisi (PH), Phox Homoloji (PX) ve epsin N-terminal Homolojisi (ENTH) 6 , 7 . En çok çalışılan PIP bağlayıcı bölgeleri biri, özellikle yüksek nanomolar düşük mikromolar afinite 8 içinde fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) ile etkileşime giren fosfolipaz C (PLC) -δ1 PH olan , 9 , 10 , 11 .

Bu etkileşimlerin mekanizması, termodinamiği ve özgüllüğünü incelemek için çeşitli nitel ve nicel in vitro yöntemler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. En sık kullanılan PIP bağlanma deneyleri arasında, yüzey plazmon rezonansı (SPR), izotermal kalorimetre (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, lipozom flotasyonu / sedimentasyon testi ve lipid lekeleri (Yağ-lekeleri / PIP-şeritleri)12 , 13 . Bunlar yaygın olarak kullanılsa da, hepsinin dezavantajları var. Örneğin, SPR, ITC ve NMR, büyük numuneler, pahalı aletler ve / veya eğitilmiş personel 12 , 13 gerektirir . Antikor bazlı lipid lekeleri gibi bazı tahlil formatları, suda çözünür PIP'leri kullanır ve onları fizyolojik olmayan bir şekilde 12 , 14 , 15 , 16 olarak sunar . Buna ek olarak, lipid blotlar güvenilir miktarı edilemez ve sık sık yanlış pozitif / negatif gözlem 12, 17, 18 ile sonuçlanmıştır. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve mevcut takım setini geliştirmek için am bağlamında desteklenen bir lipid katmanına (SLB) dayalı yeni bir etiketsiz yöntem geliştirildi Protein-PIP etkileşimlerinin çalışmasına başarıyla uygulanan bir mikroakışkan platform ( Şekil 1 ) 19 .

Protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılan strateji pH modülasyon algılamaya dayanmaktadır. Bu, fosfatidiletanolamin lipid başı grubu 20'ye direkt olarak konjuge edilmiş orto- Sulforhodamin B ( o SRB) içeren pH'ye duyarlı bir boya içerir. O SRB-POPE probu (Şekil 2A), düşük pH değerinde yüksek floresan ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS (Şekil 5B) içinde yaklaşık 6.7 bir pKa'ya sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. PLC δ1 PH nedeniyle PI (4,5) P2 (Şekil 5A) karşı yüksek özgüllük 21, 22 için yaygın olarak protein PIP bağlama yöntemleri doğrulamak için kullanılmıştır"> 23 , 24 , 25. Dolayısıyla, PLC-δ1 PH alanının PIP-on-a-chip analizi yoluyla PI (4,5) P 2'ye yapıştığını test etmek için kullanılabileceğini düşünüyoruz PH etki alanı yapısı Bu çalışmada kullanılan bir net pozitif yüke (pl 8.4) sahiptir ve bu nedenle, OH çeken -. iyonları - PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlanma üzerine iyonları (Şekil 5C), PH, OH getirir bu da ara yüzey potansiyel modüle ve o SRB-Pope (Şekil 5C) 26. PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, floresan söndürülür (Şekil 6A) protonasyon durumunu değiştirir zar yüzeyi. Son olarak, normalleştirilmiş verileri PH-PI (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 6B, 6C). afinitesini belirlemek için bir bağlanma izoterm uyacak

Bu çalışmada, mikroakışkan bir platformda PIP içeren SLB'lere proteinin bağlanmasını gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu protokol, okuyucuyu, mikroakışkan cihaz ve vezikül hazırlamadan SLB oluşumuna ve protein bağlamaya monte etmekten alıyor. Buna ek olarak, veri analizi için tarifi PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşimi sağlanır için afinite bilgileri elde etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cam Kapak Halkalarını Temizleme

  1. 7x Temizleme Çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakın) seyreltin, 100 mm derinliğinde borosilikatlı bir cam tabakasında deiyonize suyla 7 kez seyreltin ve düz bir tabanı olan bir tabakta 95 ° C'ye kadar 20 dakika boyunca veya bulutlu çözelti berraklaşana kadar ısıtın .
    NOT: Çözüm sıcak olacaktır, bedensel yaralanmaları önlemek için dikkatli olun. 7x Temizleme Çözeltisi, hekzasodyum [oksido- [oksido (fosfonatooksi) fosforil] oksifosforil] fosfat, 2- (2-bütoksietoksi) etanol, sodyum 1,4-bis (2-etilheksoksi) -1,4-dioksobütan'ın tescilli bir harmanıdır. -2-sülfonat ve zararlı olmayan ilaveler.
  2. Cımızı kullanarak, lamelleri (40 mm x 22 mm genişlik x 0.16-0.19 mm yükseklik), alüminyum bir lekelenme rafına alternatif yönlerde yerleştirin. Birbirlerine dokunmalarını önlemek için her lamel arasına boş bir yer tutun.
  3. Boyama rafını, temizleme solüsyonundaki lamelleri kullanarak tamamen suya daldırın. Lamelleri içeri saklamaya devam et1 saat süreyle çözüm.
    NOT: Su buharlaştıkça, çözelti konsantrasyonunu değiştirmek için taze deiyonize su eklemeye devam edin.
  4. Temizleme solüsyonundan lekelenme raflarını çıkarın ve deterjanı çıkarmak için lamelleri bol miktarda deiyonize suyla yıkayın.
  5. Azot gazı (1 boyama rafı başına yaklaşık 5 dakika) ile lamelleri kurutun ve tavlama için 550 ° C'de 6 saat boyunca lamelleri bir fırın yerleştirin.
    NOT: Bu, cam yüzeyindeki kaba özelliklerin yumuşatılması için önemli bir adımdır.
  6. Lamelleri plastik bir kapta yerleştirin ve tozdan uzak tutun.

2. Mikroişlemci PDMS Bloklarının Hazırlanması

  1. Büyük bir plastik tartım teknesinde polidimetilsiloksan (PDMS) ön polimeri ve sertleştirici ajanı 10: 1 (w / w) oranda karıştırın ve 500 Torr veya daha düşük vakum kuvveti ile 1 saat boyunca vakumda buharlaştınn.
    NOT: PDMS şeffaf ve inert bir silikon polimerdir. İstenen PDMS bloğunu almak için tKalınlık (0,5 cm), 55 g ön polimerin 5.5 g sertleştirici ajan ile karıştırılması.
  2. Aynı SU-8 mikro modelinin çok sayıda kopyasını içeren silikon kalıbı büyük (10 cm taban çapında) bir plastik tartım teknesine yerleştirin ve gazdan arınmış PDMS'ye dökün. Ardından gece boyunca 60 ° C'de kuru bir fırında tedavi edin.
    NOT: Mikro modeller çıplak gözle görülecek kadar büyüktür. Her model, arasında 40 μm aralık bulunan 8 mikro kanal (100 μm genişlik x 40 μm yükseklik x 1 cm uzunluk) içerir ( Şekil 1A , 1B ). Sabit bir şekilde pişirilmiş SU-8 fotorezistten oluşan silikon wafer kalıp bir nanofabrikasyon tesisinde 27 imal edilmiştir. Ana hazırlanması için diğer yaklaşımlar, hidroflorik asit (HF) aşındırma, yüksek sıcaklıkta su aşındırma, xurography ve 3D 28, 29, 30, 31 baskı içerir. CommercSilikon ana preparasyon için ial kaynakları da kullanılabilir. Mikroakışkan cihazın modelleri, bir çizim yazılımı ile tasarlandı (materyal tablosuna bakınız). Desen tasarımını içeren orijinal dosya, doğrudan üreticiye tedarik edilebilecek "Pattern Design.dwg" bir tamamlayıcı dosyası olarak sağlanmaktadır.
  3. Nazikçe PDMS'yi elle silikon ustadan soyun. Her mikro modelin sınırlarını, cerrahi bir neşrubat ve cetvel kullanarak dikdörtgenler halinde işaretleyin. Ardından PDMS'yi bloklara ayırın.
  4. Her mikrokanalın her iki ucundaki Şekil 3B'de gösterildiği gibi bir biyopsi zımba (1.0 mm delik çapı) ile 16 delik (8 giriş ve 8 çıkış) yerleştirin.
  5. Zarar ve tozdan mikro kalıpları korumak için her PDMS bloğunun üzerine bant uygulayın. Onları plastik bir kapta saklayın.

3. Küçük tek katmanlı veziküllerin (SUV'lerin) hazırlanması

NOT: Negatif kontrol çift katmanlı bileşim99.5 mol% 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glisero-3-fosfokolin (POPC) ve% 0.5 mol orto -Sulforhodamin B-1-palmitoil-2-oleoil- sn -gliseroo-3-fosfoetanolamin ( o SRB- PAPA). Deney iki tabakalı bileşimdir 92.0 mol% 'si POPC,% 0.5 mol o SRB-POPE ve her iki L-α-fosfatidilinositol-4-fosfat, 7.5 mol%' si (PI4P) ya da L-α-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat (PI ( 4,5) P 2 ). Aşağıda,% 0.5 mol o SRB-POPE ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SUV 92.0 mol% 'si POPC hazırlanması için bir işlemdir. Bu çalışmada kullanılan o SRB-POPE sentezi, daha önce 20 tarif edilmiştir.

  1. Karıştırılması gereken POPC, PI (4,5) P 2 ve o SRB-POPE hacmini aşağıdaki toplam miktarları hesaplar: 2.22 mg POPC, 0.26 mg PI (4,5) P 2 , ve o SRB-POPE 2.1 x 10 -5 mg.
  2. Hesaplanmış POPC hacmini pipetleyin, PI (4,5) P 2 ,Em> o SRB-POPE'yi tek bir 20 mL'lik cam sintilasyon şişesine yerleştirin.
    Not: metanol: su PI (4,5) P2 (ve diğer fosfoinositidler) hazır bir kloroform gelir oysa POPC ve O SRB-POPE stok çözeltileri, bir kloroform çözeltisi içinde gelir (20: 9: 1) çözücü karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Doğruluk için, pipet ucunu kullanmadan önce kloroformla ıslatın. Güvenlik için bu adım bir kimyasal duman davlumbazının içinde yapılmalıdır.
  3. Karışımı 10 dakika boyunca kimyasal bir duman kabı içine azot gazı akışı içinde veya çözücü buharlaşıncaya ve şişenin altında ince bir lipid film oluşana kadar kurutun.
  4. Karışımı, kalıntı organik çözücüyü çıkarmak için 10 mTorr'lik bir vakum mukavemeti ile vakum altında ≥ 3 saat kurutun.
    NOT: 3 saat kuruma süresi, 50 deney için yeterli olan, bu protokolde açıklanan SUV preparatının ölçeği için yeterlidir. SUV hazırlamanın daha büyük bir ölümü gerekiyorsa, gecede kurutulma yapılabilir.
  5. Dr'yi tekrar canlandırın(20 mM HEPES, 100 mM NaCI, pH 7.0'da) 5 mL'lik lipid filmi ile kapatıp oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 35 kHz'lik bir çalışma frekansında bir ultrasonik banyoda yerleştirin.
    NOT: Adım 3.1'de belirtilen lipid miktarlarının karıştırılması ve adım 3.5'te 5 mL akışlı tamponun eklenmesi, 0.5 mg / mL'de vezikül süspansiyonu verir. Bu aşamada vezikül süspansiyonu tek katmanlı ve çok katmanlı veziküllerin bir karışımıdır ( Şekil 2B ). Çözüm pembe / mor renkte ve nispeten bulanık görünür.
  6. Tek katmanlı vezikülleri elde etmek için vezikül süspansiyonunu sıvı azot ve su banyosu ile 40 ° C'de dondurarak çözdürün. Dondurarak-çözülmeyi 10 kere tekrarlayın.
    NOT: (İsteğe bağlı) Süspansiyonda tek katmanlı olmayan veziküllerin bulunmamasını sağlamak için santrifüj adımı 32 , 33 uygulanabilir.
  7. Vesikül süspansiyonunu, bir lipid ekstruder kullanarak 0.10 um iz izoleli polikarbonat zar içinden haddeleyin (bkz.Malzeme tablosu) SUV'ları zenginleştirecek. Ekstrüzyonu 10 kez tekrarlayın.
    NOT: Ekstrüzyona uğrayan veziküllerin toplanması için 15 mL'lik konik bir boru kullanılabilir. Çözüm, bu aşamada bulanıklığın geçersiz kalması gerekir. SUV çapı, dinamik ışık saçılması (DLS) ile teyit edilebilir ( Şekil 2C ). SUV iyi SLBS 34 oluşturulması için uygundur.
  8. Konik boruyu alüminyum folyo ile örtün ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

4. Mikroakışkan Cihazı Birleştirme

  1. PDMS bloğunun giriş ve çıkışlarını tıkanıklık açısından test edin, deiyonize suyu deliklere suyla yıkama şişesi kullanarak püskürterek test edin. Ardından PDMS bloğunu azot gazı ile kurutun.
    NOT: Bu adım aynı zamanda kanallar içinde ve / veya kanallar arasında sıkışmış olabilecek toz parçacıklarını da giderir. Gerekirse toz parçacıklarını gidermek için toz öncesi lamine camları azot gazı ile temizleyin.
  2. PDMS bloğunu ve önceden temizlenmiş75 Watt güç ayarı, 10 cm 3 / dak oksijen akış hızı ve 200 mTorr değerindeki vakum kuvveti ile 45 s boyunca oksijen plazması ile maruz bırakmak için oksijen plazma sistemi (bkz. Malzeme tablosu) içindeki örnek lamelini (bakınız bölüm 1) .
  3. Oksijen plazma muamelesinden hemen sonra, PDMS bloğunun desenli yüzeyini kaplamayla temas halinde yerleştirin. Temas noktalarındaki hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe basın.
  4. Yapışmayı artırmak için cihazı 100 ° C'de 3 dakika düz bir sıcak plakaya yerleştirin.
  5. Cihazın tepesinden (PDMS) ve alttaki (camdaki) toz parçacıklarını gidermek için% 100 etanol içeren ıslak tüy bırakmayan bir bezle ( örn. Kimwipe) kullanın. Ardından cihazı cam mikroskop lamı üzerine bantlayın.
    NOT: Aşırı miktarda etanol kullanmayın ve etanolün giriş ve çıkış kanallarına girmesini önleyin. Aygıt hala sıcakken bu adımı uygulamak, etanın derhal buharlaşmasını sağlamak için önerilir. Cam micrOscopy slaytlar, toz ve diğer bulaşıkları temizlemek için% 100 etanol çözeltisi içinde saklanabilir.

5. Desteklenen Lipid Bilayerlerin (SLB'lerin) Oluşturulması

  1. Adım 3.8'den 100 uL PI (4,5) P 2 ihtiva eden SUV'ları 0.65 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6.4 μL 0.2 N hidroklorik asit ilave ederek çözeltinin pH'ını ~ 3.2'ye ayarlayın.
    NOT: Çözeltinin pH'sını bir mikro pH probu ile donatılmış bir pH metre ile teyit edin (materyal tablosuna bakın).
  2. PH ayarlı SUV solüsyonundan 10 μL'lik bir miktarı girişten geçirerek her bir kanala pipetleyin ve solüsyon çıkışa gelene kadar pipeti kullanarak basıncı uygulayın. Ucu pipetten çıkarın ve cihaza bağlı bırakın.
  3. Her kanal için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve ardından cihazı RT'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Vesiküllerin mikrokanallara enjeksiyonu, cihaz montajından hemen sonra yapılmalıdır.
  4. Giriş ve çıkış borularının kesme takımları eaSırasıyla 60 cm (giriş tüpü) ve 8 cm uzunluğunda (çıkış borusu).
    NOT: Borunun çapraz kesilmesi ve keskin bir kenar oluşturulması, boruların giriş ve çıkışlara kolayca yerleştirilmesini sağlar. Çıkış tüpünün yay biçimi olmalıdır. Giriş borusunun uzunluğu, mikroskop kurulumuna bağlı olarak değişebilir. Borunun iç çapı 0,05 cm'dir.
  5. Cımleyi kullanarak, çıkış tüpü setini cihaza bağlayın ve ardından cihazı mikroskop sahnesine bantlayın.
  6. Giriş borusunun bir ucunu, konik bir boru içinde bulunan 25 mL'lik akan tampon içine batırın ve borunun güvenli olduğundan emin olmak için bantlayın.
  7. Yerçekimi akışı yoluyla çözeltiyi mikrokanallardan itmek için konik tübü cihazdan daha yüksek bir zemine (~ 20 cm) yerleştirin; Bunu başarmak için bir laboratuvar girişi kullanılabilir.
  8. Her bir giriş borusu için, hortumun serbest ucundan 1 mL'lik akan tamponu çizmek için bir şırınga kullanın. Pipet ucunu girişten çıkarın veGiriş borusunun cihazın içine serbest ucunu yerleştirin.
    NOT: Bu adım esnasında kanalın içine hava kabarcıklarının çıkma ihtimalini azaltmak için girişe bir miktar akan tampon koyun. Giriş tüpü cihaza bağlandıktan sonra, fazla tamponu çıkarmak için havsız bir bez kullanın.
  9. Tüm giriş boru parçalarını cihaza bağlamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Kanallar vasıtasıyla akan çalışma tamponu fazla vesiküllerin çıkarılmasına ve çift tabakanın deneye tabi tutulmasına yardımcı olur.
  10. Mikroskop kontrol yazılımını açın (materyal tablosuna bakın). Sol panelde, "Mikroskop" sekmesini tıklayın ve "10X" hedefi seçin.
  11. Araç çubuğunda "Canlı" ve ardından "Alexa 568" resim simgelerini tıklayın. İnce ve yol ayar düğmelerini kullanarak, mikrokanallara odaklanın.
  12. SLB'lerin ve kanalların kalitesini kontrol etmek için cihazı tarayın ( Şekil 8 ). Sonra,Araç çubuğundaki "FL Deklanşör Kapalı" resim simgesini tıklayın.
  13. "Edinme" sekmesini tıklayın ve "Temel ayarlamalar" ın altında "Pozlama zamanı" nı seçin. Pozlama süresini "200 ms" olarak ayarlayın.
  14. Sol panelde, "Çok Boyutlu Edinme" yi tıklayın ve filtreler menüsünün altındaki kırmızı kanalı seçin ("Alexa 568" olarak işaretlenmiştir). Ardından, "zaman aşımı" menüsünü tıklayın, zaman aralığını 5 dk olarak, süreyi 30 dk olarak ayarlayın ve "Başlat" ı tıklayın.
    NOT: Süre (30 dakika) ve akış hızı (~ 1.0 μL / dakika) temelinde SLB'yi bir kanal içinde dengelemek için 30 μL çalışma tamponu kullanılır; diğer bir deyişle , 8 kanalın tamamında 240 μL çalışma tamponu kullanılır.
  15. "Ölçme" sekmesinin altındaki "Daire" aracını seçin ve herhangi bir kanalda bir daire çizin. Daire seçilirken sağ tıklayın ve "Özellikler" i seçin. "Profil" sekmesinde, "all T" yı kontrol ederekFloresan yoğunluğu zamanın bir fonksiyonu olarak.
    1. Bir sonraki adıma geçmeden önce bu eğrisin denge olduğunu gösteren bir platona ulaştığından emin olun.
  16. Akışı durdurmak için tampon çözeltisini cihaz olarak eşit bir zemine indirin.
  17. Zaman atlamalı dosyayı kaydedin.

6. PI (4,5) P 2 ihtiva eden SLB'ler ile PLC-δ1 PH alanı etkileşiminin test edilmesi

  1. Seyreltici olarak çalışan tamponu kullanarak PH alanının seyreltiklerini hazırlayın.
    NOT: Cihazın içinde sekiz kanal olduğundan, boş kontroller için bunlardan en az ikisini kullanın. Her iki taraftaki uzak uçları seçin ve kalan kanalları protein seyreltmeleri için kullanın. Aşağıdaki PH alanı konsantrasyonları test edildi: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ve 2.50 uM. Her dilüsyondan yaklaşık 200 mcL, 30 dk içinde denge elde etmek için yeterliydi.
  2. Bir seferde bir tane, her çıkış tüpünü sökün ve her bir protein seyreltisinin 200 μL'iniBir pipet kullanarak çıkış kanalı. Herhangi bir baskı uygulamayın, yerçekimi işi yapın. Ucunu pipetten ayırın ve mikroakışkan aygıta tutturun.
  3. Her kanal için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve bu işlem sırasında hava kabarcıklarının kanallara girmediğinden emin olun.
  4. Mikro kanallar yoluyla proteinin akmasını sağlamak için giriş borusunu mikroakışkan cihazın altındaki bir zemine indirin. Borunun serbest ucunu atık kabına bantlayın. Protein seyreltmelerini 30 dakika boyunca akıtır.
    NOT: Bu, akışın tersine çevrilmesi ve proteinin kanallara dahil edilmesine izin verir. Dengeleme zamanı ve gerekli protein seyreltik hacmi, etkileşimin afinitesine bağlı olacaktır.
  5. Yazılımın sol panelinde, "Time Lapse" sekmesinde, tekrar görüntülemeye başlamak için "Start" düğmesine tıklayın.
  6. Dengeye ulaşıldığından emin olmak için adım 5.15'i tekrarlayın. Deneme tamamlandığında, zamandan tasarruf edindosya.

7. Membran Akışkanlığını Değerlendirme

NOT: SLB'lerin akışkan olduğundan emin olmak için Flüoresan Geri Kurtarma Sonrası Fotobloklama (FRAP) deneyleri her yeni SUV grubuyla ve temizlenmiş cam lamellerle gerçekleştirilmelidir.

  1. Mikroplaşmış PDMS blokları (2.1-2.5) imal etmek, SUV'ları (3.1-3.8) hazırlamak, mikroakışkan cihazı (4.1-4.5) monte etmek ve daha önce olduğu gibi SLB'leri (5.1-5.17) oluşturmak için cam lamelleri temizlemek için (1.1-1.6) tanımladı.
  2. Mikroskopu iki tabakaya odaklayın, maruz kalma süresini 200 ms'ye ve bölmeyi 1'e ayarlayın.
  3. Fotoğraf çamaşır suyu, 532 nm, 2 mW lazer ışını (13 μM yarıçapı) kullanarak dairesel bir nokta. Fotoblokajdan hemen sonra, ilk 45 saniyede bir her 3 saniyede bir bir dizi görüntü yakalamaya başlayın, ardından kalan süre için 30 saniye ara verin (toplam süre 15 dakika). Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra zaman aşımı dosyasını kaydedin.
  4. Ağartıcıyı seçin veZamanın bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluk değerlerini çıkarmak için daire çizim aracını kullanmayı öğrenin. Buna ek olarak, yakındaki iki tane daha alan seçin; biri suni olmayan bir bölgeye ve biri de herhangi bir SLB içermeyen bir bölgeye karşılık gelir.
  5. Aşağıdaki denklemi kullanarak flüoresans iyileşmesini ( y ) hesaplayın:
    figure-protocol-1
    NOT: Burada F t , zamanın bir fonksiyonu olarak ağartılmış bölgenin yoğunluğunu temsil eder, F i ağartmadan önce flüoresans yoğunluğunu temsil eder (bu durumda normalleştirilmiş bir değer olarak "1" kullanınız); F 0 arka plan yoğunluğudur.
  6. Bir FRAP eğrisi oluşturmak için zamanın (x ekseni) bir fonksiyonu olarak floresan geri kazanımını (y ekseni) çizin. Ardından verileri aşağıdaki gibi tek bir üstel fonksiyona uydurun,
    figure-protocol-2
    NOT: Burada A mobil fraksiyonu ve t 1/2 ) hesaplamak için kullanılan mobil fraksiyon için kinetik sabittir:
    figure-protocol-3
  7. Difüzyon sabitini ( D ) hesaplamak için t 1/2 değerini kullanın:
    figure-protocol-4
    NOT: Buradaki R , lazer ışını yarıçapını (13 um) temsil eder. Bir akışkan çift-katlı difüzyon sabit ≥1.0 um2 / s olmalıdır.

8. Verileri İşleme

NOT: Veri analizinin rutini, kullanılan mikroskop, görüntü işleme yazılımı ve eğri uydurma yazılımına bağlı olacaktır.

  1. PH etki alanını titreşimden önce (adım 5.17'den) ve sonra (6.6. adımdan) zaman aşımı dosyalarını açın. Her zaman atım dosyasının son karesine gidin ve fluoresc elde etmek için tüm mikro kanallar boyunca bir çizgi taraması yapınPiksel cinsinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak yoğunluk verilerini gösterir ( Şekil 6A ). Verileri bir elektronik tablo yazılımına aktarın.
  2. Her mikrokanal için (PH alan eklemeden önce ve sonra), kanal ve bazal çizgiyi temsil eden kanalın her iki yanındaki bazı verileri örnekleyin ( Şekil 7A ).
    NOT: Boş kanal floresan yoğunluğu değişmeden kalmalıdır. Diğer tüm kanallar boş kanala normalize edildiğinden, iki boş kanala sahip olmak ve floresan yoğunluğunun birbiriyle tutarlı olmasını sağlamak çok önemlidir.
  3. Veriyi boş kanala normalleştirmek için aşağıdaki formülü uygulayın; Şekil 7B'de örnek bir hesaplama yapılmıştır.
    figure-protocol-5
    NOT: Burada ΔF proteini , protein kanalının arka plan çıkarılan floresan yoğunluğunu, ΔF boşluğu , boş kanala ait arka plan çıkarılan floresans yoğunluğunu, öncesi ve sonrası , protein titrasyon adımlarından önce ve sonra ifade eder ve α , protein kanalı ve boş kanala ait flüoresan yoğunluklarının oranı olan düzeltme faktörünü temsil eder ([ F proteini / F boşluğu ] pre ) bir ön-protein titrasyon adımında. Floresan yoğunluğu PH alan konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak düştüğünden, normalleştirilmiş veriler değer açısından negatif olacaktır.
  4. Eğri uydurma bir yazılım (bkz. Malzeme Tablosu ) kullanarak, normalleştirilmiş flüoresan PH alan konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir ve bir Langmuir izoterma uyarlar ( Şekil 6C ):
    figure-protocol-6
    NOT: Burada ΔF fluo'daki maksimum değişime göre floresan yoğunluğundaki değişimi temsil ederproteinin bir doyma konsantrasyonu, bu (Af max) olduğu zaman Kd ise, uygulama dökme protein konsantrasyonu ([PLC δ1 PH]) 'ye eşittir, sabit, endojen temsil eder, yoğunluk rescence olan% 50 kapsam (en Membrana bağlı kompleks) elde edilir. Bu denge tabanlı bir bağlama ölçümüdür, böylece normalize edilmiş veriler görünen bir deneysel parametre Kd , app çıkarmak için basit bir Langmuir izoterma uymaktadır. Uydurma yazılımı Kd, PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşim için uygulama göre 0.39 ± 0.05 nM (Şekil 6B) 'dir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir PIP-on-a-chip mikrocihazda içinde (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 1), PLC-δ1 PH-PI çalışma pH modülasyon deneyi kullanılmıştır. Ayrıntılı bir protokol aracılığıyla, mikroakışkan aygıt bileşenlerini hazırlamak ve bir araya getirmek, küçük tek katmanlı vezikülleri (SUV'ler) yapmak ( Şekil 2 ), bir aygıt içinde SLB'ler oluşturma ( Şekil 3 ) ve PIP içeren SLB'lere protein bağlanmasını test ett...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her bir PIP varyantı, düşük konsantrasyonlarda olsalar da, organel membran 1'in eşsiz bir fiziksel bileşimi ve fonksiyonel özgünlüğünün tesis edilmesine katkıda bulundukları belirli organellerin sitosolik yüzeyi üzerinde bulunur. PIPs en önemli kullanım alanlarından biri, belirli bir hücre içi lokalizasyonu ve / veya aktivasyonunu 6, 7 gerektiren protein sayıda için belirli bir yerleştirme platformu gibidir. Hücresel fizyoloji ve hast...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DS ve MSK, kısmen hibe AI053531 (NIAID, NIH) tarafından desteklendi; SS ve PSC hibe N00014-14-1-0792 (ONR) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lamel < / güçlü >
Cam Lameller: DikdörtgenlerFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, No. 1 1/2; Borosilikat Cam
7X TemizlemeSolüsyonu MP Biomedicals976670Deterjan
PYREX Kristalleştirici KapCorning3140-190Düz tabanlı borosilikat cam tabak; Çap x Yükseklik (190 x 100 mm); Distribütör: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Fırın
NameCompanyKatalog NumarasıYorumlar
PDMS
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning4019862Polidimetilsiloksan (PDMS); Distribütör: Ellsworth Yapıştırıcılar
PYREX KurutucuVWR89134-402Vakum Anma Biyopsi
punchHarris15110-10Harris Uni-Core; 1.0 mm çap; Miltex Biyopsi Pistonlu Punch (Kat. No. 15110-10) alternatif olarak kullanılabilir
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Device
Plazma Temizleme SistemiPlasmaEtchPE25-JW2 kademeli Doğrudan Tahrikli Yağ Vakum Pompası, O2 hizmeti (Krytox Ücretli)
Dijital Sıcak PlakaKarşılaştırmasıH3760-HDenville Scientific aracılığıyla satın alındı (Cat. 1005640)
Buzlu Mikro SlaytlarVWR48312-003Buzlu, Seçilmiş ve Önceden Temizlenmiş; İsviçre camından yapılmış; Kalınlık: 1 mm; Boyutlar: 75 x 25 mm; GR 144
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Mold
AutoCAD Autodeskv.2016Fotoğraf maskesi tasarımı için çizim yazılımı
PhotomaskCAD/Sanat HizmetleriN/ASiyah arka plana ve net özelliklere sahip tasarım, CAD/Sanat Hizmetleri tarafından şeffaf bir maske (5 x 7 inç) üzerine 20k dpi çözünürlükte basılmıştır
Silikon GofretlerÜniversite Gofret1575Prime Grade, Tek Tarafı Cilalı; 100 mm (4 inç) Çap; 525 um Kalınlık
SU-8 50MicroChem Corp.YokNegatif Tonlu Fotorezist; Penn State Nanofabrikasyon Tesisi Mülkiyeti
SU-8 Geliştirici: MicroChem Corp.N / APenn State Nanofabrikasyon Tesisi Mülkiyet
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
SUV
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolinAvanti Polar Lipidler850457CPOPC
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfatAvanti Polar Lipidler840045XPI4P
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfatAvanti Polar Lipidler840046XPI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolaminAvanti Polar Lipidler850757CPOPE; oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sülfonil Klorür (karışık izomerler)gereklidirThermoFisher ScientificL-20oSRB-POPE
pH Duyarlı Floresan Lipid Probu (oSRB-POPE)KurumKurum İçi Sentez (Huang D. et al. 2013)
Cam Sintilasyon ŞişesiVWR66022-06520 mL hacim kapasitesi
Aquasonic 250DVWRN/AUltrasonik Su Banyosu
Çekirdek Parça Kazınmış MembranlarWhatman110605Polikarbonat Membran; Çap: 25 mm; Gözenek Boyutu: 0.1 um; Distribütör: Sigma-Aldrich
KloroformVWRCX1054-6HPLC sınıfı
LIPEX EkstruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Termobarrel Ekstruder
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADinamik Işık Saçılımı; Penn State X-Işını Kristalografi Tesisi Property
Name<strong>Company<strong>Katalog NumarasıComments
Veri Analizi
GraphPad PrismGraphPad Yazılımıv.6Veri analizi için eğri uydurma yazılımı
Name< / strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
Mikroskop< / strong>
Axiovert 200M Epifloresan MikroskobuCarl Zeiss MikroskopiN/AMikroskop
AxioCam MRm KameraCarl Zeiss MikroskobuN/AKamera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/AIşık Kaynağı
Alexa 568 Filtre SetiCarl Zeiss MikroskopiN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 YazılımCarl Zeiss MikroskopiN/AGörüntü İşleme Yazılımı
NameCompany Katalog NumarasıComments
Diğer
TipsVWR10034-132200 uL pipet ucu; Protein solüsyonunu mikroakışkan kanala uygulamak için ince ve pürüzsüz uç
UçlarVWR53509-07010 uL pipet uçları; Vezikül çözeltisini mikroakışkan kanala uygulamak için ince ve pürüzsüz uç
Orion Star A321 pH metreThermo ScientificSTARA3210pH metre
Orion mikro pH probuThermo Scientific8220BNWPmikro pH probu
N- (2-Hidroksietil) -Piperazin-N'- (2-Etansülfonik Asit)VWRVWRB30487HEPES, Serbest Asit
Sodyum KlorürVWRBDH8014-2.5KGRNaCl
Boru MüttefikTel ve KabloTFT-200-24 Nİç Çap: 0,020-0,026 inç (0,051-0,066 cm); Duvar Kalınlığı: 0.010 inç (0.025 cm); Esnek Politetrafloroetilen İnce Duvarlı Boru; Doğal Renk
Nitrojen Gazı - EndüstriyelPraxairN/AYerel Sağlayıcı
Oksijen Gazı - EndüstriyelPraxairN/AYerel Sağlayıcı
Sıvı NitrojenPraxairN/AYerel Sağlayıcı
. sentezi için sentezi için gereklidir İçi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ip zerinde PIP AnaliziDestekli Lipid ift KatmanlarpH Mod lasyon AnaliziFosfolipaz C PH AlanFosfatidilinositol 45 bisfosfatMikroak kan Cihaz retimiK k Tek Katmanl Vezik llerFloresan iddeti l mG r n r Disosiyasyon Sabiti

İlgili makaleler