Yöntem makalesi

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

DOI:

10.3791/55870

⸱

19 Haziran 2017

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, miRNA'nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA'ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNA ve siRNA gibi küçük antisens RNA'lar, hücresel fizyoloji ve patolojide önemli rol oynar ve dahası, çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötik ajanlar olarak kullanılabilir. MiRNA / siRNA tedavisi için yeni, yenilikçi stratejilerin geliştirilmesi, temel mekanizmalar hakkında kapsamlı bir bilgiye dayanmaktadır. Yeni veriler, küçük RNA'ların hücreler arasında bir boşluk bağlantısına bağlı bir şekilde değiştirildiğini ve böylece alıcı hücrede gen düzenleyici etkilere yol açtığını düşündürmektedir. Moleküler biyolojik teknikler ve akış sitometrik analizi, miRNA'nın hücrelerarası alışverişini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler moleküllerin boşluk birleşim akışını incelerken gerekli olan yüksek zamansal çözünürlüğü sağlamazlar. Dolayısıyla, miRNA / siRNA'nın hücreler arası sinyal molekülleri olarak etkisini araştırmak için, bu küçük RNA'ların hücresel seviyede analiz edilmesine izin verecek yeni araçlar gereklidir. Bu protokol, apKardiyak hücreler arasındaki miRNA moleküllerinin boşluk birleşimine bağımlı değişimini aydınlatmak için photobleaching (3D-FRAP) mikroskopisi sonrası üç boyutlu flüoresan iyileşmesinin plikasyonu. Önemlisi, bu basit ve non-invaziv canlı hücre görüntüleme yaklaşımı, yüksek zaman zamanlı çözünürlük ile gerçek zamanlı olarak floresanla işaretlenmiş küçük RNA'ların boşluk birleşimsel geçişinde görselleştirme ve miktar tayini yapılmasına olanak tanır. 3D-FRAP tarafından elde edilen veriler, küçük hücrelerin içinde hücrelere sinyal düzenleyici moleküller olarak etki eden hücreler arası gen düzenlenmesinin yeni bir yolunu teyit etmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük kodlamayan RNA'lar hücresel gen düzenlemesinde önemli oyunculardır. Bu moleküller, belirli bir hedef mRNA'ya bağlanan 20-25 nükleotidden oluşur, bu da translasyonun bloke edilmesine veya mRNA parçalanmasına yol açar 1 , 2 . MiRNA ve siRNA gibi küçük RNA'lar tarafından üstlenilen gen düzenleyici süreç, birçok farklı türde 3 bulunmuş olan oldukça korunmuş bir mekanizmadır. Özellikle miRNA molekülleri çoğalma, farklılaşma ve rejenerasyon 4 , 5 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçler için çok önemlidir. Buna ek olarak, miRNA ekspresyonunun düzensizliği, bir çok patolojik bozukluğa atfedilir. Buna uygun olarak, miRNA'ların teşhis için biyolojik belirteç olarak ve gen terapisi için terapötik ajanlar olarak uygun olduğu gösterilmiştir 6,7 .

Boşluk kavşakları (GJs), iki bitişik hücrenin plazma zarında, 1 kD'ye kadar bir molekül ağırlığına sahip moleküllerin difüzyonel değişimini sağlayan özel protein yapılarıdır. Dokuların gelişimi, farklılaşması, hücre ölümleri ve kanser veya kardiyovasküler hastalık 8 , 9 , 10 gibi patolojik bozukluklar için önemli oldukları gösterilmiştir. Birkaç molekül, iyonlar, metabolitler ve nükleotidler de dahil olmak üzere GJ kanallarını geçebilecek nitelikte olarak tarif edilmiştir. İlginç bir şekilde, GJ'lerin küçük RNA'ların hücre içi hareketi için bir yol sağladığı 11,12 bulundu. Dolayısıyla, miRNA'lar yalnızca üretildikleri hücrede değil, aynı zamanda alıcı hücreler içinde de hareket edebilir. Bu, hücrelerarası sinyal iletim sisteminde miRNA'ların rolünü vurgular. Aynı zamanda, veriler gösterilenBu boşluk bağlantılı hücresel-iletişim, miRNA fonksiyonuyla yakından ilişkilidir. MiRNA ve GJ'lerin doku homeostazı, patoloji ve teşhis üzerindeki belirgin etkisi nedeniyle, GJ'lerin ve miRNA'nın ilgili hücre içi dinamikleri hakkında kapsamlı bir anlayış, miRNA'ya dayalı hastalıkların mekanizmalarını aydınlatmaya ve yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır. MiRNA terapileri.

Boşluk bağlantılı bağlanmanın derecesine bağlı olarak, miRNA moleküllerinin hücreler arasında aktarılması çok hızlı bir işlem olabilir. Bu nedenle, bu düzenleyici sinyal moleküllerinin hızlı hücresel hareketi görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesine izin veren bir yöntem gereklidir. Genellikle, akış sitometrisi ve moleküler biyolojik teknikler küçük RNA'ların 11 , 12 , 13 , 14'ün geçişini göstermek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, FRAP mikrolarına karşıBu yaklaşımlar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip değildir, bu da GJs yoluyla miRNA değişimini analiz ederken zorunludur. Ayrıca, FRAP mikroskopisi daha az invazivtir ve bu nedenle birkaç hücre tipinde 15 , 16 , 17 moleküllerin GJ'ye bağlı değişimini değerlendirmek için güçlü ve yeni bir canlı hücre görüntüleme tekniğini temsil eder.

Burada, kardiyomiyositler arasındaki miRNA'yı değerlendirmek için 3D-FRAP uygulamasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Bu amaçla kardiyomiyositlere flüoresan etiketli miRNA transfekte edildi. Bu miRNA ile işaretlenmiş bir hücre fotobleached edildi ve bitişik hücrelere ait boşluk birleşimsel miRNA re-influx'a zamana bağlı bir şekilde kaydedildi. FRAP deneylerinin yüksek zamansal çözünürlüğü, yaşayan hücreler arasında miRNA ve siRNA'nın hücreler arası transferinin hassas değerlendirilmesi için kinetik çalışmalar yapma imkanı sunar. MoreoKüçük RNA'lar farklı mekanizmalar vasıtasıyla çok farklı kinetiklerle değiştirilebildiğinden FRAP mikroskopisi, GJ'lerin ilgili kepçme süreçlerinde ne dereceye kadar yer aldığını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir 18 . Ek olarak, 3D-FRAP, GJ geçirgenliğinde fizyolojik ve patolojik değişiklikler ve bunun küçük RNA transferi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir 15,19.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yenidoğan farelerini içeren bu protokolün tüm basamakları, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi hayvan bakımına ilişkin etik kurallara göre gerçekleştirildi.

1. Hücre Kültürü Tabletlerinin Hazırlanması ve Kardiyomiyosit Kültürü için Orta

  1. PBS içinde% 0.1 jelatin ile bir hücre kültürü plaka kaplayın ve 37 ° C'de 4 saat süreyle inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Jelatı çıkarın ve steril laminer hava akımı altında kurumasına izin verin.
  2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş 50 mL DMEM'den oluşan hücre kültürü ortamı hazırlayın. 37 ° C'ye kadar ısıtın.

2. Yenidoğan Kardiyomiyositlerinin İzolasyonu

  1. Yenidoğan farelerini (1-2 günlük) steril makaslarla kesilerek kurutun ve göğsü göğüs kafesi boyunca açın. Toraksı hafifçe bastırırken forseps kullanarak kalbi çıkarın ve kalbi, buz gibi HBSS içeren 24 yuvalı bir plakaya aktarın(Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan).
  2. Steril forseps kullanarak kalp dışı dokuları ve daha büyük damarları çıkarın. Temizlenmiş kalpler buz soğukluğunda HBSS içeren 1.5 mL tüp içine aktarılır. Enzimatik sindirim için tüp başına maksimum 5 kalp kullanın.
  3. Küçük makaslarla kalpleri <0,5 ila 1 mm³ parçaya kesin.
  4. Öğütülmüş kalpler HBSS ile 1 mL mikrolitrelik pipet kullanılarak aspirasyon / ilave HBSS ile iki kez yıkanır. Enzimleri eklemeden önce HBSS'yi tamamen çıkarın.
  5. Yenidoğan kalplerindeki enzimatik sindirim için, piyasada bulunan bir kit kullanın ve üreticinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakın ). 35 ° C'de 37 ° C'de enzimlerle inkübe ederken kıyılmış kalpleri içeren tüpü her 5 dakikada sallayın.
  6. Tohum, kardiyomiyosit fraksiyonunun yapışmasına izin vermek için 1.5-2 saat boyunca hücre kültürü ortamı içeren kaplanmamış hücre kültürü kaplarında hücreleri askıya aldı. Yüksek saflık varsa bu adımı tekrarlayınKardiyomiyositlerin tedavisi gereklidir. Arzu edildiği takdirde, kardiyomiyositsiz fraksiyonu daha da kültürleyin.
    NOT: 15 kalp içeren bir hücre süspansiyonu için, ön kaplama adımı 75 cm2'lik hücre kültürü şişeleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Genellikle, bir yenidoğan kalpten yaklaşık 5 x 105 hücre elde edilir.
  7. 15 mL konik tüp içinde süpernatantı toplayın ve 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. 1 mL hücre kültürü ortamında hücreleri tekrar süspanse edin.
  8. Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın.
  9. Plaka, kardiyomiyositleri 6 yuvalı plakalarda 3 x 10 5 hücre / cm² yoğunlukta izole etti. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
    NOT: İsteğe bağlı olarak hücreler de bu noktada transfekte edilebilir. Bununla birlikte, hücreler elektroporasyona tabi tutulmadan önce bir gün kültüre alındığında canlılığın arttığı gözlenmiştir.

Floresanla Etiketli miRNA ile Transfeksiyon

  1. öncesiSıcak bir hücre kültür ortamı (adım 1.2'ye bakın) ile 37 ° C'ye kadar bir su banyosu veya eşdeğer bir cihazda inkübe edin.
  2. RNaz içermeyen steril suda flüoresan miRNA'nın 20 uM stok solüsyonu hazırlayın.
  3. 90 mM Na2HPO4, 90 mM NaH2PO4, 5 mM KC1, 10 mM MgCl2 ve 10 mM sodyum süksinat içeren elektroporasyon tamponunu hazırlayın ve pH'ı 7.2'ye ayarlayın; Elektroporasyon tamponu birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
  4. 5 dakika süreyle% 0.05 tripsin kullanarak kültür çanak hücrelerini çıkarın. Hücre kültürü ortamı ilave ederek tripsini inaktive edin.
  5. Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın. Hücreleri 300 xg'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  6. 100 uL başına 4 x 10 5 hücre konsantrasyonu elde etmek için elektroporasyon tampon hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
  7. Bir tüpte flüoresan miRNA (son konsantrasyon: 0.25 uM) ile hücre süspansiyonunun 100 uL'sini karıştırın veKarışımı bir elektroporasyon küvetine yükleyin.
    1. Ampirik olarak hücre türüne bağlı olarak uygun miktarda miRNA belirler.
  8. "G-009" programını kullanarak bir elektroporasyon cihazı (bkz . Malzeme Tablosu ) kullanılarak elektroporasyon gerçekleştirin .
  9. Önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı 500 mcL ekleyin ve 4-iyi cam-alt oda slayt bir kuyuya tüm hücre süspansiyonu (4 x 10 5 hücre) aktarın. 37 ° C'de 1 gün boyunca hücreleri% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin.
    NOT: FRAP analizi için ~% 80'lik bir hücre yoğunluğu en uygunudur. Etiketli miRNA transfeksiyonu sadece elektroporasyon ile yapılmalıdır. Etiketli miRNA moleküllerinin homojen dağılımı FRAP ölçümü için yararlı olduğu için reaktif temelli transfeksiyon önerilmez.

4. 3D-FRAP Mikroskopi Uygulaması (3. Gün)

  1. Mikroskop inkübatörünü 37 ° C'ye ısıtın; C ve FRAP ölçümünden önce en az 2 saat konfokal mikroskop sistemi üzerinde geçiş yaparak bir termal denge kurun ve kayma olasılığını azaltın. Mümkünse% 5 CO2 atmosferi uygulayın.
  2. Oda slaydını sahne örneği tutucusuna yerleştirin.
  3. Transfekte edilmiş kardiyomiyositlerin bir kümesini 1.4 NA yağ hedefi (400X büyütme) ve düşük lazerli güçte 561 nm lazer uyarma ışığı kullanarak, 570-680 nm'lik bir algılama aralığıyla bulun.
    NOT: FRAP ayarlarının tanımı, görüntü elde etme ve analiz, mikroskop spesifik yazılımı kullanılarak yapılmıştır (bkz . Malzeme Tablosu ).
  4. "Kurulum Yöneticisi" nde "z-Stack", "Zaman Serileri", "Ağartma" ve "Bölgeler" düğmelerini etkinleştirin.
  5. FRAP parametrelerini tanımlayın.
    1. "Acquisition Mode" menüsündeki görüntü toplama ayarlarını, "frame size"4; 512 x 512, "satır adım" 1 ve "tarama süresi" <1 sn.
    2. "Kanallar" menüsünde, minimum lazer uyarımından maksimum flüoresan elde etmek için lazer gücü, ofset ve kazanç ayarlarını yapın ( örn., Lazer gücü:% 1-5); Yoğunluk doygunluğundan kaçınmak için ayarlayın. "İğne deliği boyutu" nu 2 μm olarak ayarlayın.
    3. Ardından, "Bölgeler" menüsünde "ROI çizim aracı" nı seçin ve hedef hücrenin, referans hücrenin ve arka plan alanını işaretlemek için imleci kullanın. Gerekirse, photobleaching için birkaç hedef hücre seçin.
    4. "Ağartma" menüsünde ( örneğin, yinelemeler: 9-14, ışıkla temizleme için lazer gücü:% 100, görüntü yakalama aralığı: 60 s, devir sayısı: 15) foto-ağartma ayarlarını yapın. 3 ilk taramadan sonra ağartmanın başlangıcını tanımlayın.
    5. "Z-Stack" menüsünde, hücrelerin kalınlığına bağlı olarak z-stack alımının sınırlarını tanımlayın. "Sayı o" ayarlayınF z-katmanları "yı 12 - 15'e ayarlar.
    6. FRAP denemesini başlatın ve flüorür iyileşmesini kaydedin.
      NOT: Bir FRAP deneyinin ayarları hücrenin türüne, flüoresan boyaya ve mikroskop sistemine bağlı olduğundan, FRAP için en uygun parametreleri belirlemek için pilot denemeler yapmak en iyisidir. Ağartma, ilk floresan yoğunluğunu en az% 50 azaltmak için yeterli olmalıdır. Tipik olarak, floresan iyileşmesi, plato fazına erişilinceye kadar 30-60 saniyede bir kaydedilmelidir.

5. Veri Analizi

  1. Elde edilen z-yığınlarının maksimum projeksiyonlarını oluşturun ve ağartılmış hedef hücrelerin, referans hücrenin ve arka planın flüoresan yoğunluk değerlerini elde edin. Mikroskopa özgü yazılımı kullanarak, "İşleniyor" → "Maksimum yoğunluk projeksiyonu" → dosya seçin → "Uygula" yı tıklayın.
    1. Alternatif olarak, eşdeğer bir görüntü analiz aracı ( örneğin ImageJ).
  2. Hedef hücre, arka plan ve referans hücrenin tüm zaman noktalarında bulunan flüorens yoğunluk verilerini bir elektronik tabloya kopyalayın.
    1. Edinme işlemi sırasında oluşan photobleaching'i düzeltmek için hedef hücrenin yoğunluk değerlerinden referans hücrenin arka plan yoğunluğunu ve yoğunluğunu çıkartın. Her zaman noktası için arka plan ve referans hücre düzeltmeleri yapın.
    2. Düzeltilmiş FRAP verilerini, ilk flüoresan ile her bir değeri bölerek ağartmadan önce ilk flüoresans yoğunluğuna göre normalize edin.
    3. FRAP eğrilerini elde etmek için, her bir zaman noktasının yoğunluk değerlerinden çıkararak çamaşır suyu bittikten hemen sonraki flüoresan yoğunluğuna taban çizgisini ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yenidoğan kardiyomiyositlerde flüoresan miRNA'nın boşluğun junctional geçişini incelemek için non-invaziv bir teknik olarak 3D-FRAP mikroskobisini sunuyoruz. İzole edilen kardiyomiyositlerde, tipik olarak çizgili α-aktinin paterni görüldü ve hücreler arası hücre sınırları boyunca yüksek Cx43 plakları bulundu ( Şekil 1A , beyaz ok başları), bu da moleküllerin yüksek hücre içi akılarına izin verdi. İzole edilen kardiyomiyositlerin saflığı, α-actinin po...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAlar, hücresel fizyolojideki kilit aktörlerdir ve hücrelerarası değişim için bir yol olarak GJ'leri 11 , 12 , 22 kullanarak - diğerlerinin yanında - kullanarak sinyal molekülleri olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mevcut protokol , hücre kümelerinde flüoresan miRNA'lar kullanarak bu GJ'ye bağımlı mekikleşmeyi karakterize etmek için bir in vitro canlı hücre görüntüleme tekniği sunmaktad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Federal Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), AB Yapısal Fonlarıyla Devlet Mecklenburg-Batı Pomerania (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ve ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12). Buna ek olarak, RD, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889001), DAMP Vakfı ve BMBF (VIP + 00240) FORUN Programı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
yenidoğan NMRI fareleriCharles River
JelatinSigma AldrichG7041PBS'de% 0.1 çözelti, sterilize
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco ve akut; s modifiye edilmiş ortamPan BiotechP04-03550
Penisilin / StreptomisinThermo Fisher Scientific15140122100 U / mL, 100 mikro; g/mL
Fetal sığır serumuPan BiotechP30-3306
Hücre kültürü plastikTPP
Primer Kardiyomiyosit İzolasyon KitiThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281primer kardiyomiyosit izolasyon kitine dahildir
Tripan mavisiThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 etiketli mikroRNA MimicDharmaconCP-004500-01-05RNAse serbest suda çözülür, stok çözeltisi 20&mikro; M
Sodyum fosfat monobazikSigmaS3139
Sodyum fosfat dibazikCarl RothT877.2
Potasyum klorürSigmaP9333
Magnezyum klorürServa28305.01
Sodyum süksinatCarl Roth3195.1
%0.05 Tripsin/EDTA çözeltisiMerckL2153
4 kuyulu Cam alt hazne kızaklarıIBIDI80827%0.1 jelatin çözeltisi içeren
kaplama Amaxa Nucleofector IILonzaprogramı G-009 Elektroporasyon için kullanıldı 
LSM 780 ELYRA PS.1 sistemiZeiss
Excel yazılımıMicrosoft
α-aktinin antikoruAbcamab9465seyreltme 1:200
Connexin43 antikoruSanta Cruzsc-9059seyreltme 1:200
keçi anti-fare Alexa 594 antikorThermo Fisher ScientificA-11005seyreltme 1:300
keçi anti-tavşan Alexa 488 antikoruThermo Fisher ScientificA-11034seyreltme 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724son konsantrasyon 250 nM
Yakın IR Canlı/Ölü Hücre Leke KitiThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Kırmızı-TuruncuThermo ScientificC34851
DAPI nükleer lekeTermo BilimselD1306

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884(2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001(2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166(2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282(2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gap Kav ak TransferimiRNA De i imi3D FRAP MikroskopisiFloresans Geri Kazan mKardiyomiyosit K lt rElektroporasyon Prosed rConnexin43 EkspresyonuCanl H cre G r nt lemeFloresan RNA zlemeFotobele ing Analizi

İlgili makaleler