Yöntem makalesi

Ultrahigh çözünürlük fare optik koherens tomografi göz içi enjeksiyon Retina gen terapisi araştırma yardımcı olmak için

DOI:

10.3791/55894

⸱

2 Kasım 2018

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada biz kendi alansal kapsama değerlendirmek ve photoreceptor canlılık karakterize subretinal boşluğa gen terapisi ajanların teslim yardımcı olmak üzere yüksek çözünürlüklü spektral alanlı optik koherens tomografi (HR-SD-Ekim) kullanarak yeni bir yaklaşım göstermek.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-Ekim canlı fare modelleri photoreceptor dejenerasyon ilerlemesini izlemek için terapötik ajanlar teslim subretinal boşluğa değerlendirmek ve toksisite ve etkinliği vivo içindedeğerlendirmek için kullanılmaktadır. HR-SD-Ekim kızılötesi ışık (800-880 nm) kullanılır ve özellikle optik var benzersiz optik fare göz ile alt-2-mikron Aksiyel kararlılık için tasarlanmış. Transgenik fare modelleri (photoreceptor) dış Retina dejenerasyonu ve denetimlerin hastalık ilerleme değerlendirmek için görüntüsü. Çekti cam microneedles adeno ilişkili virüs (AAV) ya da nano tanecikleri (NP) yolu ile alt retinal enjeksiyonlari trans-scleral ve trans-choroidal bir yaklaşım sağlamak için kullanılmıştır. Dikkatli iğne subretinal boşluğa konumlandırma sıvı alt retinal uzaya sunar bir kalibre edilmiş basınçlı enjeksiyona önce gerekli oldu. Gerçek zamanlı subretinal ameliyat bizim Retina görüntüleme sistemi (RIS) yapılmıştır. HR-SD-Ekim gösterdi bir toksik mutant insan mutant rhodopsin (P347S) ifadesi nedeniyle ilerici Tekdüzen Retina dejenerasyonu (RHOP347S) transgene farelerde. HR-SD-Ekim Retina katmanların sıkı miktar sağlar. Dış nükleer tabaka (yalnız) kalınlığı ve photoreceptor dış segment uzunluğu (OSL) ölçümleri photoreceptor canlılık, dejenerasyon veya kurtarma ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. RIS iletim sistemi gerçek zamanlı görselleştirme subretinal enjeksiyonları içinde yenidoğan sağlar (~ P10-14) ya da yetişkin fareler ve HR-SD-Ekim hemen teslim başarısını belirler ve alansal ölçüde eşler. HR-SD-Ekim subretinal cerrahi başarı farelerde, ayrıca photoreceptors içinde vivocanlılığını ölçme için değerlendirebilir güçlü bir araçtır. HR-SD-Ekim de Retina dejenerasyonu, toksisite ve preklinik gen terapisi araştırma çalışmaları tedavi kurtarma ölçüde değerlendirmek için tek tip hayvan tabur tanımlamak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırmacılar gen terapileri Retina ve Retina Dejeneratif hastalıkları çeşitli roman tedavi tedaviler için insan hastalık1,2,3,4 dönüştürerek httpd'ye umutları ile gelişmekte olan , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. saat alan veya spektral etki alanı optik koherens tomografi (SD-Ekim) hastalık12,13,14 belirli fare modellerinde dış Retina dejenerasyonu yönleriyle araştırmak için kullanılmıştır . HR-SD-Ekim, ancak, henüz kapsamlı bir şekilde oranı ve Retina dejenerasyonu kayma tekdüzelik belirlemek için fare modelleri değerlendirilmesi en iyi duruma getirme bağlamında kullanılan veya gen preklinik değerlendirilmesi bağlamında therapeutics örnek, e dayalı kurtarma, toksisite veya vektör teslim8,15,16kayma ölçüde değerlendirmek. Bir kez bir fare modeli tam olarak karakterize, HR-SD-Ekim veri kurtarma veya fare modelleri Retina dejenerasyonu17toksisite uygulamak için tedavi etkisini ölçmek için bilgilendirici ve güvenilir bir kaynak olarak hizmet verebilir. Birçok grup subretinal enjeksiyon vektör teslimat photoreceptors ve retina pigment epiteli (RPE) hücreleri transducing, verimlilik nedeniyle bir yöntem olarak kullanıyorsunuz. Genellikle özgür-el cerrahi ile kornea yüzeyinden yapılır ve genellikle katarakt, kanama ve sadece arka manipülasyon tarafından meydana gelen istenmeyen Retina dekolmanı ile dolu olduğunu ancak, bu ana, zor bir yöntem kalır vitreus. Birçok grup hala subretinal enjeksiyonları körü körüne girişimi ve nispeten geniş çaplı paslanmaz çelik iğneler (34 G)8,17,18ile,19 el ile enjeksiyonlar kullanarak virüs göndermek ,20,21,22ve vektör uygun teslimat retina8,17, onaylamak için Imaging birkaç kullanır optik koherens tomografi (OCT) 20 , 22. bazı iyileştirmeler yönteminin son zamanlarda micromanipulator22tarafından tahrik microscale iğneleri kullanarak tarif edilmistir.

Biz AIDS iğne konumlandırma entegre bir yaklaşım mevcut ve enjeksiyonları laboratuarında fare17, küçük göz içinde görüntülenmesi için özel olarak tasarlanmış özel yönlendirilmiş stereo ophthalmoscope tarafından kolaylaştırdı 23. çekti cam mikro iğne stereotaksik micromanipulator ile birlikte kullanımı önce iğne yerleştirme gerekli (Yani, konjonktivayi ve bağ dokusu) hiçbir cerrahi kesme ile daha iyi kontrol sağlar enjeksiyon. Basınç kullanımı Mikro enjektör yardımcı olur teslim tutarlı enjeksiyon birimleri düzenlenmekte ve çok daha fazla istikrar, hassas ve el ile enjeksiyonlar böylece azalan bir el şırınga tarafından gerçekleştirilen daha yavaş ile enjeksiyon yapılabilir göz içine enjeksiyon kabarcık oluşumu. Daha küçük iğne iğne çekilme yolu kendinden contalı olduğundan takip kaçağı önlemek yardımcı olur. Enjeksiyon/teslimat ölçüde değerlendirmek için birçok araştırmacı grupları bulma ve retina (vektör tarafından teslim ifade yapısı) gelişmiş yeşil floresans protein (EGFP) ifade alansal ölçüde deneysel sonunda değerlendirme itimat (ötenazi) başarılı enjeksiyonları11,19,20,24onaylamak için gelin. Bütün hayvanlar (bilinmeyen) cerrahi hataları ile muhafaza edilmesi, kadar tekrarlayan önlemler takip gerekiyor beri cerrahi başarı kaynakları çok büyük miktarda cerrahi yordam zaman ve hayvanlar, atıkların doğrulamak için bu yaklaşım (OCT kullanmak değil) ötenazi ve göz hasat zaman (EGFP ölçülür). Retina yerleştirmeye konumunu teyit enjeksiyon (yani subretinal alanı) retina doğru katmanları arasında yer alır göstermek için HR-SD-Ekim kullanarak geliştirilebilir. HR-SD-Ekim hemen başarısız denemeleri (gerçek cerrahi zamanında yaklaşım geliştirmek için ilgili değişkenleri tanımlamak için cerrahi hataları) betimlemek için kullanılabilir. HR-SD-Ekim sayısız avantajı preklinik gen terapisi çalışmaları dış Retina dejenerasyonu, hızlı kantitatif değerlendirilmesi izin vererek kimlik/deneysel ( ölçütlerine uymayan çalışma hayvanların itlaf izin sağladığını bulduk Örneğin, yanlış subretinal enjeksiyon) ve nerede vektör teslim edildi (preklinik etkisi büyük olasılıkla nerede) bölgeye göz izleme görüntüleme doğrudan yanı sıra bölgeler değil teslim edildi her nerede vektör kontrol için. Gelişimi beri SD-Ekim kullanımı kabul olması ve Oftalmoloji araştırmacılar tarafından kullanılan devam etti ve şimdi fare veya kemirgen modelleri13,25Retina bilimsel çalışmalarda Retina Görüntüleme standartları olarak kabul edilir. HR-SD-Ekim ve yazılım yeteneklerini başarılı kantitatif gen tedavisi sürecinde hayvan modeli seçimi, seçilmiş dejenerasyon karakterizasyonu dahil olmak üzere her aşamada fare modellerinde amacı daha fazla için benzersiz entegre şekilde kullanılmıştır hastalık modelleri, tedavi teslim, eşleme vektör teslim ve toksisite/etkinlik değerlendirme. HR-SD-Ekim kullanımı daha etkili uyuşturucu bulma işleminin her düzeyde sağlar. Burada kullanılan bu yaklaşımlar RNA ilaç keşif programımızda açıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan iletişim kuralları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitelerinin VA WNY HCS ve SUNY Buffalo Üniversitesi tarafından onaylanmış. Hayvanlar dernek hükümlerine göre araştırma vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) ve Helsinki Deklarasyonu için kullanılmıştır.

1. fare modelleri

  1. Denetimleri de dahil olmak üzere değerlendirilecek fare modelleri tanımlayın.
    Not: Görüntüleme için bir C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT gerçekleştirilen / mWT, kısmen insanlaşmış fare Retina dejenerasyonu manken insan mutant RHOP347S hC1 allelleri vahşi-türü (WT) için homozigoz fare RHO+/ + genotip26 , 27, hC1 BL/6(J), kısmen insanlaşmış manken mutant insan RHOP347S hC1 alleli WT fare RHOüzerinde tek bir kopyası ile x+ / + genotip (hC1 /-/ / mWT/mWT) (hC1/hC1 / / mWT crossing tarafından elde edilen/mWT C57BL/6 () ile J) fareler). Otozomal dominant retinitis pigmentosa (adRP) C57BL/6(J) özgeçmişlerine modellerdir. Homozigoz iki fare RHO nakavt arka plan üzerinde insan WT RHO gen kopyası için bir fare modeli de kullanılan28,29oldu. Bu çizgi üzerinde 129Sv arka plan var. Bu fare RHO nakavt ile 129Sv özgeçmişlerine çizgiyi, insan RHO tek bir doz fare RHO arka plan ortaya çıkar.
  2. Deneysel tasarım için uygun koşulları aşağıdaki hayvanları korumak.
    Not: Hayvanlar içinde hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi birimi (VMU) VA WNY HCS yönü muhafaza. Fareler beslenen Standart laboratuvar chow ve yetişkin altında 12 h:12 h ışık: yumuşak floresan yükü ile karanlık devir beyaz ışıkları ile yaklaşık 300 Lüks yaklaşık 72 ˚F, kafes düzeyinde.

2. fare göz jeli

  1. Retinal görüntüleme30 ve cerrahi işlemler için kullanılan optik jel hazırlayın.
  2. 2 mg/mL w/v yüksek molekül ağırlıklı (4 x 106 g/mol Karbomer fosfat Buffered Saline (PBS) x steril 1. birleştirin
  3. Oda sıcaklığında mix jel viskoz bir optik şeffaf jel oluşturur kadar.
  4. Jel küçük steril şişe aktarmak ve sallanan bir kova Masa Üstü Santrifüj sıkışmış hava kabarcıkları kaldırmak için 350 x g, santrifüj kapasitesi.
  5. Jel doğrudan kornea fare kornea ve bir sigorta primi kapak cam (18 x 18 mm) arasında bir arabirim oluşturmak için uygulanır.

3. insan kaynakları-SD-Ekim görüntüleme

  1. HR-SD-Ekim aygıt (Şekil 1) bakın.
  2. Anestezi uygun doz belirlemek için hayvan tartın. Sonra 25 µL/g % 2.5 çözüm tamponlu 2,2,2-tribromoethyl alkol (Avertin) çözüm yolu ile mayi enjeksiyon (IP) vücut ağırlığının kullanarak fare anestezi ve hayvan immobilize sonra öğrenciler genişletmek için göz damlası ekleyin.
  3. Hayvan tam bir ayak çimdik tarafından anestezi onaylayın ve hayvan tepki emin olun.
  4. Bıyık düzeltme ve HR-SD-Ekim kızak üzerine fareyi getirin.
  5. Fare göz doğrudan başlığın objektif önünde konumlandırın ve kornea ve Iris bulunmaktadır kadar aşama denetimleri işlemek. Suni gözyaşları uygulayarak sulu kornea tutun.
    Not: Hassas ayar micromanipulators İK-SD-Ekim kızak üzerinde öyle ki öğrenci diyafram merkezli ve odaklı fare konumlandırmak için kullanılır. Optik başlığın sonra retina görünür hale gelir ve hayvan daha fazla olası en iyi resmi elde etmek için ayarlanır kadar gelişmiş.
  6. İlk olarak, yazılım programı "Fare" açın ve hasta/sınav "'ı" tıklatın. İkinci olarak, "hasta Ekle" seçeneğini tıklatın ve yeni hasta pencerede hayvan tanımlamak için uygun bilgileri girin ve "Kaydet ve çık". Üçüncü olarak, "sınav"başlangıç sınav tarafından"takip Ekle" seçeneğini tıklatın. Dördüncü olarak, "özel tarama Ekle" seçeneğini tıklatın ve "dikdörtgen birimi", OD veya işletim sistemi görüntüsü göz için seçin, sonra "sınav Ekle" seçeneğini tıklatın. Son olarak, araç hedefleyen ve bölgenin ilgi almak için hayvan konumlandırma başlar. Doğru bölge bulma göz yüzeyden daha fazla görüntü kalitesini arttırmak için bir steril pamuklu aplikatör hemen önce resim alma uçlu kullanarak herhangi bir aşırı sıvı kaldırın, sonra "anlık görüntü", Başlat ve iyi bir görüntü elde ettiğinizde tıklattıktan sonra "Kaydet tarama".
    Not: 900 a-taramalar/b-inceden inceye gözden geçirmek ve 90 b-taramalar/resim dikdörtgen HR-SD-Ekim görüntüler için tipik parametreleridir. 1.4 mm x 1.4 mm edinsel görüntülerdir. Yansıma retina bölgenin belirli deney üzerinde bağlıdır, ancak çoğu görüntü optik sinir başı (ONH) ortalanır.

4. varlığı, hızı ve Model dış Retina dejenerasyonlar tekdüzelik değerlendirilmesi

  1. HR-SD-Ekim tarafından dış Retina dejenerasyonu modeli değerlendirilmesi
    1. Yaş için denetim ve durum, hızı ve dış Retina dejenerasyonu tekdüzelik değerlendirmek için deneysel konularda geniş bir yelpazede hayvanlarla edinin.
    2. HR-SD-Ekim görüntüleme her yaştan itibaren her iki tabur (hastalık ve normal), birden çok hayvanlar üzerinde gerçekleştirin. OCT görüntü elde etmek 3.1.6 içinde açıklanan yöntemi kullanın.
      Not: Veri geniş bir zaman (1 yıl) aralığını kapsayan Doğum günü dağıtılan, hayvanlar tek seferde büyük bir kohort toplanabilir veya hayvan küçük bir kohort benzer sonuçları elde etmek için süre (1 yıl) uzun bir süre içinde birden fazla resim toplamak için kullanılabilir.
    3. Kaydedilen HR-SD-Ekim dikdörtgen birim yansıması açın ve ölçülecek ilk b tarama tanımlamak (ideal olarak ONH veya diğer kişisel Simgesel Yapı içerecektir) üzerinden fotoğraf topluluğu. Yakınlaştırma özelliği yazılımımı ekranı kaplayacak şekilde büyütmek.
    4. Çap pergeli istediğiniz sayıyı b-tarama görüntü üzerinde sağ tıklayarak ve daha sonra "Kumpasları" tıklayarak ve nihayet istenildiği kadar Çap pergeli tıklayarak açın (1 ile 10 arasında numaralandırılır). Çap pergeli resmin alt sağ köşesinde ortaya emin olun. "Halife yapılandırma" özelliğini kullanarak atama onları bütün olarak "dikey" açı blok sütun ve "görüntü Kaliper Tekdüzen yerleşim arasında retina kolaylaştırmak ve nihayet, tıkırtı için yeri" açmak içinde geçerlidir.
      Not: 1st Kaliper oculus dexter (OD) sağ gözü işlerken görüntü sol tarafta yer almalıdır ve 1st Kaliper oculus uğursuz (OS) sol gözünü görüntülerin işlenmesi sırasında görüntünün sağ tarafında yer almalıdır. Bu bir burun içinde sol ve sağ gözler için tüm verilerin geçici yönlendirme için komplo oluşur.
    5. Bilgisayar fare hareket ettirmek istimal her Kaliper istediğiniz konuma (2.0 mm apart) b-tarama, bir kumpas dahil b taramalı görüntüler optik sinir başının ortasına yerleştirmek emin olmak arasında (Bu kumpas sıfır olarak küme). Sonra fareyi tıklatın ve Kaliper bölgenin ilgi span uzunluğa sürükleyin için kullanın. Keyfi değil ölçülebilir maksimum uzunluğu b taramaya bölgelerinde yer paylaşımı, ve veri çözümleme sırasında göz ardı Çap pergeli ayarlayın.
    6. Yanında duvar ilanı Kaliper üst dış sınırlayıcı membran (ELM) ve Dış pleksiform tabaka (OPL) altındaki gövde altında Kaliper araçlarını kullanarak dit kalınlık ölçer. Bu 0.2 mm aralıklarla, retina arasında her Kaliper için yineleyin. Ölçümler kaydedin.
    7. Tüm kaliperleri yerleştirilmiş ve boyutunu için sonra resmin üzerine sağ tıklayın ve "Kaliper verileri kaydet"'i tıklatın.
    8. Sonraki b-(her 10th tarama işleri de) inceden inceye gözden geçirmek aynı dikdörtgen biriminden gelen üstün bölgeler için aşağı tüm retina kapsayan OCT görüntü üzerinde ölçümler yineleyin. Çap pergeli, açık ve x ekseni aynı konumda kalmalıdır. X yönünde hareket ettirmeden Kumpasları uzunluğunu ayarlayın.
    9. İşlenmiş b tarama yanındaki küçük dosya simgesini tıklatarak veri dosyalarını görüntü ve "Data git" düğmesini tıklayıp kayıt açın. Tıklatın "kaydedilen zamanına göre sırayla dosyaları düzenlemek ve ölçülen her b tarama için tüm dosyaları açmak için tarihi değiştirildi.
    10. Her b-tarama ham verileri tek bir dosya için en yüksek temel çerçeve numarası üzerinde sırayla en düşükten derlemesi. "Halife adı", "Uzunluk" ve "Merkezi X" de dahil olmak üzere veri sütunları seçin.
    11. Merkezi X tüm b-işlenen her dikdörtgen birim OCT yansıması için ölçülen inceden inceye gözden geçirmek için aynı olduğundan emin olun. Ölçümleri kaydetmek için kullanılan değildi Çap pergeli tüm verileri silmek ve sıfır olarak optik sinir başı merkezinde bulunan Halife ayarlayın.
    12. X için verileri birden çok Y veri kümesi dit genel kalınlığı çizilecek bir 3D çizim işlev elde etmek için vs çizmek ya da başka bir Retina tabakası ölçülen.
    13. Denetim ile ilgili yaş oranı ve herhangi bir potansiyel Retina dejenerasyonu tekdüzelik belirlemek için deneysel hayvan arasında dit ölçümlerin karşılaştırıldığında.
    14. Aynı b-tarama görüntüleri kullanarak OSL ölçüleri için tekrarlayın. Çap pergeli karaağaç ve Bruch'ın membran (BM) arasında yerleştirerek dışında dit, ölçmek için kullanılan aynı yöntemi izleyin.
      Not: Kaliper yerleştirmek nasıl bir örnek (Şekil 3B) temsilcisi sonuçları bölümünde gösterilir. Bu hata azaltmak için bir içinde yakınlaştırılmış görüntü üzerinde yapılmalıdır.
    15. Veri analizi için birden fazla hayvan her Doğum günü için hem deneysel ve denetim tabur için yineleyin.
  2. Kapsamlı ölçüm ve 3D mapping yazılım Çap pergeli aracını kullanarak dit veya OSL kalınlıkta
    1. Yazı enjeksiyon OCT resimleri gözden geçirin ve herhangi bir tanımlanabilir tarihi yerler, ONH veya kan damarlarının retina gibi not edin. Sonra bir izleme SD-Ekim aynı bölgeden elde etmek ve aynı olarak tanımlanabilir işaretlerini eklemeyi unutmayın için fareyi getirin.
      Not: Retina görüntülü ve Retina dekolmanı söz konusu bölgenin posta enjeksiyon SD-Ekim Albümdeki tanımlanır emin olun. Bir dikdörtgen birimi SD-Ekim görüntü kaydetmek ve kaydedin.
    2. Yukarıda açıklanan adımlardaki gibi kaydedilen görüntüleri işlemek 4.1.3. için 4.1.14. Kaliper veri ve yukarıda açıklandığı gibi arsa kaydedin.
      Not: Sonuçta elde edilen dizinin dit ölçümlerin dit kalınlığı resmeden bir 3D çizim oluşturmak için kullanılır. Çap pergeli x ekseni boyunca konumunu bir grafiğin x ekseni boyunca kökenli (0), optik sinir yerleştirerek replot izin verir. Y ekseni b-tarama numarası kullanılarak çizilir ve optik siniri daha sonra bir düzgün y ekseni köken, optik sinir pozisyonu sağlar başlangıç noktasını tanımlamak için kullanılır. Optik sinir içinde her bir veri kümesi tanımlama güvenilir bir şekilde hizalanmasını takip görüntüleri sağlar.
  3. Enjeksiyon yeri fundus resim üzerine ölçüde eşleme
    1. Yazı enjeksiyon dikdörtgen birim OCT enjeksiyon başarısı onaylamak için gerçekleştirin. Açıklanan yöntemi takip 3.6.
    2. B-inceden inceye gözden geçirmek tüm OCT resim kapsayan bir dizi müstakil retina dönüm noktası sınır belirlemek için yazılımda Kaliper özelliğini kullanın. Çap pergeli açıklanan açmak için yöntemini kullanın 4.1.4.
    3. Fundus görüntüleri OCT b-inceden inceye gözden geçirmek ve karşılık gelen Kaliper konumdaki konumuna karşılık gelen fundus görüntü üzerinde eşlenen konumla kaydetmek.
    4. Fundus görüntülerin tüm enjeksiyon izi fundus bileştirir (örnekte temsilcisi sonuçları bölümü, Şekil 5A) kesin bir harita, sonuçları Kaliper pozisyonları dahil olmak üzere bir kompozit görüntü, içine derleyin.

5. göz içi enjeksiyonları

Not: RIS kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi daha fazla bir son çalışma23' oluşturulmamıştır.

  1. Cam enjeksiyon iğneler hazırlanıyor
    1. Otoklav filamentler kuru döngüsü kullanılarak küçük gruplar halinde ile kılcal tüpler.
    2. Bir pipet puller ve set-up bir cam ucu keskin açı ve çapı 2-5 µm yelpazesi ile üretecek bir program kullanın.
      Not: Bizim pipet çektirme üzerinde etkili iğneler üretilen örnek 5 adım programının bir Tablo 1' de gösterilen.
    3. Çekti cam iğne oda sıcaklığında pipet steril iğne kavanozda saklayın.
  2. Enjeksiyon iğneyi enjeksiyon için istenen çözüm ile doldurmak
    1. İğne iğne bağı, yaklaşık 5/8 sahibi sonu çıkıntılı "bırakarak içine monte.
      Not: A mesafe 5/8" zor ulaşmak-ecek yapmak o daha az iğne doldurmak için enjeksiyon çözüm iğne bağı 0.2 mL tüpler açılış içine kolayca uymuyor çünkü. Ayrıca, 5/8" önemli ölçüde daha büyük salınım veya gerçek zamanlı görüntüleme yapraklar ipucu odak düzlem veya görüş alanı (FOV), göz ponksiyon çalışırken bu yana zor yapım belgili tanımlık uç, devinim sonuçlarında daha fazla çıkıntı iğne sahip.
    2. Enjeksiyon çözüm bir steril 0.2 mL Tüp hazırlayın. 1:10 Ekle seyreltme floresein 1 mg/mL, son bir konsantrasyon elde etmek için enjeksiyon çözüm için steril floresein sülfatın (10 mg/mL 1 x PBS).
      Not: Kullanılan tam boya kullanıcıya özeldir ve toksik olmayan ve çıplak gözle RPE ve subretinal alanı düzeyinde iğne ucu kesin yerleşimini kolaylaştırmak için beyaz ışık aydınlatma altında herhangi bir şey olabilir.
    3. İğne ile stereo mikroskop iğne iğne doldurmak için kullanılacak enjeksiyon solüsyon içeren tüp merkezi ile uyumlu şekilde konumlandırmak için 3 eksenli micromanipulator kontrol düğmeleri kullanırken gözünün önüne getir.
    4. Dikkatli iğne ucu sıvı batık kadar iğne ucu 0.2 mL tüp içine sür. Tek bir enjeksiyon için gerekli iğne içine enjeksiyon sıvısı (Örneğin 1 µL) istenen sesini çizin. Buzun içine yerleştirilen tüp içinde kalan çözüm korumak.
  3. Hayvan enjeksiyon için hazırlanıyor
    Not:     RIS mikroskop temiz tutulur ve temassız sistemidir. Isıtma yüzeyi temiz adsorbent bir yastık ile kaplıdır ve iğneler çekti önce autoclaved. Sonra kendi kendine sterilizing bir ısıtmalı metal şerit tarafından alınır, onlar çekti cam iğneler tutmak için tasarlanmış bir kapalı steril odasında tutulur. İğneler yalnızca eldivenli ellerini kullanarak işlem görür ve bakım yuvasına montaj sırasında iğne ucu dokunmadan önlemek için kullanılır. Enjekte çözümleri steril tekniği kullanılarak hazırlanır ve kirlenme için bir örnek virüs hazırlıkları LB ağar kaplamalar üzerine çizgiler ve onları üzerinden 37 ˚C geceleri kuluçka tarafından test edilir.
    1. Anestezik analjezik uygun doz belirlemek için hayvan (g) tartmak.
    2. Anestezik (% 2.5 çözüm tamponlu 2,2,2-tribromoethyl alkol (Avertin)) üzerinden mayi enjeksiyon (IP) yönetmek için.
    3. Hemen antikolinerjik ilaçlar (Örneğin, cyclopentylate) öğrenciler genişletmek için her iki gözde uygulanır.
    4. Hayvanın bıyık düzeltme ve kulak yumruk veya başka bir yöntemi kullanarak hayvan sayısı.
    5. Göz ve çevresi seyreltilmiş betadin ile yıkayın.
      Not: Bu kasıtsız boğulma neden olabileceğinden burun etrafında herhangi bir çözüm almamak.
    6. Fare doğru iğne enjekte edilir önceden şekillendirilmiş standart Modelleyici'nın kil fare tutucu gözle 39 ˚C, tutulan ısıtma yastığını yerleştirin.
    7. Fareyi kullanarak bir tutam test arka ayak yanıt vermemesine neden olur emin olun.
  4. Subretinal enjeksiyon gerçekleştirme
    1. Steril künt Iris forseps çifti proptosis dünyanın 7 ve 10: 00 pozisyonlar iterek süre göz kapaklarının üzerinde pensler uçları Açık ve aşağı doğru aynı anda yanında duvar ilanı nazikçe ikna etmek için kullanın.
    2. Forseps enjeksiyon işlemi sırasında yerinden tutmak için göz küre altında göz kapakları koaksiyel için kullanın.
      Not: Hayvanlar 10-14 gün eski kez göz yuvasından büyük hayvanlar daha kolay yapacak.
    3. Yaklaşık 1-1.5 mm aşağıda kornea limbus kenarı iğne ucu doğrudan ve dikkatle iğne sklera dokusuna nüfuz eder ve göz manipülasyon sağlar gibi bir scleral depresyon oluşturur kadar konjonktiva gözünden içine götürmek.
    4. Aşağı doğru gözle scleral depresyon ile dilate pupil RIS stereo mikroskopla görselleştirmek için micromanipulator döndürün.
    5. Steril göz jeli veya 1 x PBS çözüm ve steril coverslip kapaklı bir damla uygulanır.
    6. İğne (2-5 µm), disk ve iğne ileri retina formları enjeksiyon yerinde keskin zirvesine kadar ucu tarafından oluşturulan scleral depresyon odaklanmak.
    7. İğne ucu ile sklera sıkar ve iğne floresein RPE hücre monolayer hemen yakınında retinada altında görünür kadar tutucu kullanarak döndürün.
    8. Yani dünyanın teğet iğne ucu sürücü ve ayak pedalı anahtarı ile enjeksiyon pompası etkinleştirin.
    9. Sonra istediğiniz birimin teslim (0.5-1 µL) iğne subretinal boşluğa, çekilme ve kontrol bleb stabil ve o sıvıyı ilk ölçüt başarılı bir enjeksiyon enjeksiyon yeri dışında kaçak değil.
      Not: Uygun uç çapı Bakımı (2-5 µm çapı) enjeksiyon sitesinden kaçağı önlemek için önemlidir.
    10. Hayvan OCT enstrüman görüntüleme platformu üzerinde yerleştirin. Bir dikdörtgen birim görüntü kaydetmek için HR-SD OCT görüntüleme için yönergeleri izleyin.
    11. Enjekte sıvının subretinal uzayda ve bleb kapsamını belirlemek için görüntüleri kaydet bulunduğu olduğunu doğrulayın.
    12. Hayvan tutucusunu kaldırmak ve antibiyotikli bir krem bol miktarda enjekte gözler için geçerlidir.
    13. Bu tamamen kurtarır, sonra geri geldiği yere özgün kafes içine yerleştirin kadar hayvan ısıtma yastığını üzerine koyun.
      Not: Bizim hayvanlar genellikle sütten kesme önce enjekte edilir, bu nedenle hayvanların annesi ile kafes geri gerekir.
  5. OCT enstrüman yazılım araçları kullanılarak subretinal bleb ölçüde eşleme.
    1. Bleb daha önce açıklanan yöntemleri kullanarak bir dikdörtgen birim OCT resmi elde etmek ve tanınabilir bir dönüm noktası ONH gibi göz içinde içerecek şekilde konumlandırın.
      Not: 90 b-inceden inceye gözden geçirmek kayıt çalışır bleb eşlemek için fakat istenen çözünürlüğü bağlı olarak kullanılabilir.
    2. Ve nerede retina RPE ve koroid ayırır dönüm noktasında yer tek bir kumpas şekil için ekleyin.
      Not: Yazılım karşılık gelen bir nokta temsil eden Halife ve değerlendirilen b tarama fundus resim üzerine bir çizgi otomatik olarak eşleştirir.
    3. Kumpasları yerleşimini aşağıdaki ekran yakalama ve görüntüleri etkili enjeksiyon bleb hassas enjeksiyon site haritaları fundus görüntü üzerine kenarlığını eşlemek için derleyin. Başvuru sırasında izleme görüntüleme faiz bölgelerinde bulunmasına yardım etmek için derlenmiş resmi kaydedin.
      Not: Alternatif olarak, Kaliper veri kaydedilebilir, uyulması ve çizim 3D veri kümeleri için dit kalınlıkta benzer bir yöntemle çizilen.
  6. Intravitreal enjeksiyon
    1. İğneyi tamamen sklera ile pars plana yaklaşık 0,25 mm kornea limbus arkasında ve vitre içine tahrik dışında alt retinal enjeksiyon, benzer bir cerrahi yaklaşım kullanarak iğne ucu yerleştirin.
    2. İğne yerleşim ayak pedalı ile enjeksiyon darbe uygulayın.
      Not: Dilate pupil diyafram ile floresan doldurma floresein boya kadeh vitre boyunca hızlı bir difüzyon görülmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Varlığı, hızı ve Model dış Retina dejenerasyonu tekdüzelik değerlendirilmesi
LNIZCA ölçümleri OPL araç yazılım sağlanan Kaliper aracını kullanarak dit sınırlarını tanımlama karaağaç için kaydedildi. Kısmen insanlaşmış adRP fare modeli dış Retina dejenerasyonu ilerlemesini eşlemek için hedefi oldu. Bir denetim C57BL/6(J) fare ve bir hC1/hC1 / / mWT karşılaştırılabilir görüntüleri/mWT fare modeli, iki kopya mutant insan çubuk opsin (RHOP347S) genlerin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-Ekim hayvan modellerinin potansiyel potansiyel therapeutics test kullanışlılığı belirlemek için insan hastalık karakterizasyonu için basit bir yöntem sağlar. Tedavi edici ilaç keşif (Örneğin, yerine gen tedavisi, ribozyme veya shRNA devirme gen tedavisi, kombine gen terapisi) işlemi için kritik hızla ve güvenle potansiyel bir hayvan model insan hastalığı karakterize etmek için yeteneğidir. HR-SD-Ekim karakterize ve hemen hemen her fare modelinde Retina dejenerasyonu ilerlemesini izlemek için kullanılan Ret...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ticari ilişkiler: MCB: None; JMS: yok. Retina görüntüleme sistemi (RIS)23 Bu çalışmada kullanılan fareler, kemirgenler, ya da küçük hayvan gen terapisi teslim çalışmalarda yapmak isteyen herhangi bir grup için önemli kullanım roman bir cihazdır. Yazarlar bu cihaz ile ilgili olarak şu anda bildirmek için çakışma varken, SUNY Buffalo - ve Gaziler İdaresi üniversitede fikri mülkiyet haklarına sahip ve gelecekte bu araç ticari isteyebilir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu malzeme, kısmen, Gaziler Bakanlığı işleri (VA), Gaziler Sağlık İdaresi, Office araştırma ve geliştirme (Biyomedikal Laboratuvarı araştırma ve geliştirme) tarafından desteklenen çalışma üzerine kurulmuştur (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS, kısmen, personel hekim-bilim adamı olarak, göz hastalıkları, VA WNY tarafından istihdam edilmektedir; MCB kısmen, VA WNY tarafından istihdam edilmektedir. Çalışma yapılan ve kısmen Gaziler yönetim Western New York sağlık sistemi, (Buffalo, NY) desteklediği. İçeriği Department of Veterans Affairs veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini temsil etmemektedir. Ayrıca desteklenen, büyük bölümünde NIH/NEI R01 tarafından EY013433 vermek (PI: JMS), NIH/NEI R24 vermek EY016662 (UB görme altyapı Merkezi, PI: M katliam, yönetmen - Biophotonics modülü: JMS), sınırsız ödenekle için bölümü, göz hastalıkları/Üniversitesi nde Araştırma Buffalo'dan önlemek körlük (New York, NY) ve Oishei Vakfı (Buffalo, NY) hibe. Hediye hC1 transgenik RHOP347S hat ve exon 1 fare RHO nakavt Dr Janis Lem (Tufts New England Tıp Merkezi, Boston, MA) üzerinden ve NHR-E transgene modeli Heterozigoz devlet hediye üzerinde anıyoruz fare exon 2 RHO nakavt kökenli Drs. G. Jane Farrar ve Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL6 (J)Jackson Laboratuvarları664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Oküler Koherens Tomografi Cihazı (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
Retina Görüntüleme Sistemi (RIS)Kurum içiN/A
Stemi 2000C MikroskopZeiss000000-1106-133
P-97 Alevli/Kahverengi mikropipet çektirme SutterInstrument Cop-97
MMN-33 mikro manipülatör Narishige USAMMN-33
PLI-100  mikro enjektörHarvard Aparatı64-1736
Mikropipet Tutucu (Döner)Şirket İçiN/A Mikropipet
Depolama KabıWorld Precision Instruments Inc.E210
  Borosilikat cam kılcal borular 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Aparatı30-0053
2,2,2-TribromoetanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amil AlkolSIGMA Aldrich240486-100ML
Atropin Sülfat Oftalmik Çözelti, USP %1Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Siklopentolat Hidroklorür Oftalmik Çözelti, USP & nbsp;% 2Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Gentamisin Sülfat Merhem USP, %0.1PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratuvarları, Inc.9006619-1013
Tetrakain HidroklorürBausch ve LombNDC 24208-920-64
Oftalmik Çözelti, USP% 0.5Bausch ve LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Yaşam Teknolojileri14190-136
Virüs HazırlıklarıViGene / UNCN / A
Altın nanoçubuklarNANOPARTzD12M-850-1.75
Floresein Sülfat AK-FLUOR %25Akorn Inc.NDC 17478-250-20
LamellerFisher Scientific12-548-A
ForsepsMilton18-825
İğneler 30 guageBeckton Dickenson   W11604
ŞırıngalarBeckton Dickenson   
Bioptigen yazılım PaketiBioptigenN/A
Proparakain Hidroklorür Oftalmik Solüsyon, USP %0.5AkornInc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
TartıMettler
MakasDünyası Hassas Aletler
Kulak yumrukNat ' l band
CL 100 Işık kaynağıWelch AllynCL100
Azot GazıJackson Kaynak KaynağıN/A
Isıtmalı Su banyosuNeslabRTE-140
Evde Isıtma plakasıN/A
Isıtma matıCincinnatti Sub Zero273
Kil fare tutucuPlast.i.kil Amerikan Sanat Kil A.Ş.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Pamuk Uçlu AplikatörlerAmerikan SağlıkCtag
EtOH %70Fisher ScientificBP2818-100
Eldiven NitrilVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome cihazıDiagnosys Inc.D125
Kontakt lenslerŞirket İçiN/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 yazılımıOriginLab Corp.N/A
Referans elektrotlarıOcuscienceF-İplik Elektrot (DTL) 24"
309659 Hizmeti

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Subretinal EnjeksiyonFare G z G r nt lemeD N kleer TabakaFotoresept r DejenerasyonuAdeno li kili Vir sGer ek Zamanl G rselle tirmeTransskleral Yakla mRetinal G r nt leme Sistemi

İlgili makaleler