Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Perisitler perivasküler multipotent hücreler olup, farklı organlarda hatta aynı dokuda heterojenlik gösterirler. İskelet kaslarında, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve ayırdedici özelliklere sahip en az iki perisit alt popülasyonu (tip I ve tip II olarak adlandırılır) bulunur. NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transgenik fareler kullanılarak, tip I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) ve tip II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) perisitler başarıyla izole edilmiştir. Bununla birlikte, bu çift transgenik farelerin mevcudiyeti bu saflaştırma yönteminin yaygın kullanılmasını engeller. Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna izin veren alternatif bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, floresanla aktive hücre ayırma (FACS) tekniğini kullanır ve Nestin-GFP sinyaliyle birlikte NG2 yerine PDGFRβ'yı hedef alır. İzolasyondan sonra, I ve ty yazınPe II pericyitler farklı morfolojilere sahiptir. Buna ek olarak, çift transgenik farelerden izole edilenler gibi bu yeni yöntemle izole edilen tip I ve tip II perisitler sırasıyla adipojenik ve miyojeniktir. Bu sonuçlar, bu protokolün perisit alt popülasyonlarını iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan izole etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Giriş
Kas distrofisi şimdiye kadar etkili bir tedavisi olmayan bir kas dejeneratif bozukluğudur. Doku yenilenmesini teşvik eden terapilerin gelişimi daima büyük ilgi gördü. Hasar sonrası doku rejenerasyonu ve onarımı yerleşik kök hücrelere / progenitör hücrelere bağlıdır 1 . Uydu hücreleri, kas yenilenmesine 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 katkıda bulunan miyojenik prekürsör hücrelere adanmıştır. Bununla birlikte, bunların klinik kullanımı, sınırlı göç ve enjeksiy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Wildtype ve Nestin-GFP transgenik fareler, Minnesota Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde barındırıldı. Tüm deneysel prosedürler, Minnesota Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak hazırlandı.
1. Kas Diseksiyonu ve Tek Hücreli İzolasyon
- Tribromoetanol (250 mg / kg, ip) ile erişkin fareler (6-10 hafta, hem erkek hem de kadın) euthanize edin ve karın cildini% 70 etanol ile sterilize edin.
NOT: Anestezi / ötenazi için ketaminin yerine ketamin yerine tribromoetanol kullanıldı, çünkü ketamin NM....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lazer yoğunluğu ve kanal dengelemesi de dahil olmak üzere FACS parametreleri, lekesiz kontrol ve tek renkli kontrollerin sonuçlarına dayanarak düzeltilir. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü, PDGFRβ-PE + popülasyonu için kapıyı ayarlamak için kullanılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE - hücreleri arasında, Nestin-GFP + ve Nestin-GFP'yi temsil eden iki popülasyon açıkça ayrılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE +.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Perisitler kılcal damarların 21 , 26 abluminal yüzeyinde bulunan çok-enerjili perivasküler hücreler 22 , 23'tür . İskelet kaslarında, perisitler adipogenik ve / veya miyojenik yolaklarda 19 , 20 , 24 arasında ayrım yapabilir. Son çalışmalar, farklı markör ekspresyonu ve belirgin farklılaşma potansiyelleri ol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarların ifşa ettikleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, kısmen Myotonic Distrofi Vakfı (MDF-FF-2014-0013) ve Amerikan Kalp Derneği'nden (16SDG29320001) Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi'nden bir Fon A Üyesi Ödülüyle desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre Sıralayıcı | Sony | SH800 | |
| Otomatik Kurulum Boncukları | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin ve nbsp; | Sigma | T48402 | |
| Perisit Büyüme Ortamı | ScienCell | 1201 | |
| MSC Bazal Orta (Fare) | Kök Hücre Teknolojileri | 5501 | |
| Adipojenik Stimülatör Takviyesi (Fare) | Kök Hücre Teknolojileri | 5503 | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 16000 | |
| At Serumu | Sigma | H1270 | |
| Kollajenaz Tip 2 | Worthington | LS004176 | |
| %0.25 Tripsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penisilin / Streptomisin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFR ve beta; -PE Antikoru | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antikoru | Sigma | P1998 | |
| S-Miyozin Antikoru | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-tavşan antikoru ve nbsp; | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-fare antikoru | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| DAPI Vektör Laboratuvarları ile Montaj Ortamı | H-1200 | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G İğneler | BD | 305196 | |
| 10 mL Serolojik Pipet | BD | 357551 | |
| OneComp eBoncuk | eBiyobilim | 01-1111 |
Kaynaklar
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispens....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
