Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize
Bu makalede
Özet
Özet
MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.
Giriş
Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA'ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Puromycilation koşullar belirlenmesi
Not: Bu teknik MRC-5 hücre adezyon işlemi 5 sırasında yerelleştirilmiş çeviri değerlendirmek için kullanılan yöntemi tanımlar. Puromycilation herhangi bir hücreyi yapılabilir gibi bu tedavi koşulları açısından puromisindir konsantrasyon ve istenen her hücre satırı için özdeş değil çünkü puromycilation koşulları kullanılmak üzere belirli hücre hatları için optimize etmek önemlidir kuluçka süresi. Bu koşullar nasıl tanımlandığını göstermek için üç örnek hücre hatları (Yani, HeLa, MRC-5 ve ha-7) için farklı kuluçka süreleri puromisindir konsantrasyonları artan ile tedavi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Doğru bir şekilde puromisindir birleşme kullanarak çeviri olayları gözlemlemek için her farklı puromisindir birleşme Kinetik (şekil 1)9,11 gösterir çünkü her hücre satırı için en uygun koşulları belirlemek için önemlidir ,12,18. Bu nedenle, puromisindir birleşme doğrulamak için istenen hücre kültürünü puromisindir konsantrasyonları.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA'ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.
De novo protein çeviri değerlendirmek için çeşitli yön.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Hücre görüntüleme birimi teknik yardım için araştırma merkezinin teşekkür ediyoruz. M.-É. Huot olan bir Junior 1 araştırma bilim adamı Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Bu eser Kanada kurumları, Sağlık (sayı CIHR, paspas-286437 M.-É için hibe. araştırma tarafından desteklenmiştir Huot).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Tripsin | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antikoru 12D10 | EMD milipore | MABE343 | western blot seyreltme 1: 25.000 İmmünofloresan seyreltme 1: 10.000 |
| Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı Antikor | hücre sinyali Teknoloji | 7076 | Western Blot Seyreltme 1:8.000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-fare IgG (H + L), F (ab') 2< / sub> Fragman (Alexa Fluor 488 Konjugat) | hücre sinyalizasyon teknolojisi | 4408 | immünofloresans seyreltme 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immünofloresan seyreltme 1:400 |
| Sikloheksid | Sigma | C1988-1G | 50 ve mikro; g / ml nihai konsantrasyon |
| DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) | İnvitrojen | D1306 | nihai konsantrasyon 1 & mikro; g / ml |
| Puromisin | biyo-Temel | PJ593 | 2.5 ve mikro; g / ml ila 10 ve mikro; g/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, yüksek, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 hücreleri | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa hücreleri | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 hücreleri | Dr. Mazroui'den (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | konfokal görüntüleme sistemi | |
| Fiji yazılımı | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehit %37 Çözelti | biyo-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Biyoreaktifleri | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Biyoreaktifleri | BP337-500 |
Kaynaklar
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
