Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Histon proteinleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler), kromatin yapısını ve gen ekspresyonunu düzenleme rolleri için geniş çapta incelenmektedir. Histon PTM'lerine spesifik antikorların seri olarak üretilmesi ve dağıtımı, bu işaretler üzerinde araştırmayı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Histon PTM antikorları, birçok kromatin biyokimya uygulaması için önemli reaktifler olduğundan, doğru veri yorumlaması ve sahadaki ilerlemenin devam etmesi için antikor özgüllüğünün titiz analizi gereklidir. Bu protokol, histone antikorlarının spesifikliğini profillemek için peptit mikrodizilerinin tasarım, imalat ve kullanımı için entegre bir boru hattı tarif eder. Bu prosedürün tasarım ve analiz yönleri ArrayNinja tarafından kolaylaştırılmış ve açık kaynaklı ve etkileşimli bir yazılım paketi, son zamanlarda mikroarray baskı formatlarının uyarlanmasını hızlandırmak için geliştirdi. Bu boru hattı, piyasada bulunan ve yaygın olarak kullanılan histon PTM antibodisinin çok sayıda taranması için kullanılmıştırS ve bu deneylerden elde edilen veriler çevrimiçi ve genişletici bir Histon Antikor Özgüllilik Veritabanı aracılığıyla serbestçe elde edilebilir. Histonların ötesinde, burada açıklanan genel metod, PTM'ye spesifik antikorların analizine genel olarak uygulanabilir.
Giriş
Genomik DNA, kromatin oluşturmak için ökaryotik hücre çekirdeğinin içinde histon proteinleri ile zarif bir şekilde paketlenmiştir. Kromatin tekrarlayan altbirimi, H2A, H2B, H3 ve H4 1 oktamerik bir çekirdek histon proteinleri etrafında sarılan 147 baz çift DNA'dan oluşan nükleozomdur. Kromatin genel olarak gevşek biçimde paketlenmiş ökromatin ve yoğun sıkıştırılmış heterokromatin alanlar halinde düzenlenir. Kromatin sıkıştırma derecesi, protein makineleri, kopyalama, kopyalama ve onarım gibi temel DNA şablonlu işlemleri gerçekleştirmek için altta yatan DNA'ya ne ölçüde erişebildiğini düzenler.
Genetik erişi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. ArrayNinja'nın Kurulumu ve Çalıştırılması
- Www.virtualbox.org adresinden Oracle Virtual Box'u indirip yükleyin.
- ArrayNinja sanal makinesini (VM) http://research.vai.org/Tools/arrayninja adresinden indirin ve açın.
- Sanal Kutuyu açın ve 'Makine'yi,' 'Ekle'yi tıklayarak ArrayNinja VM'yi ekleyin ve ArrayNinja VM'nin kaydedildiği klasörden arrayninja.vbox'ı seçin.
- ArrayNinja'yı Virtual Box içinde seçip yeşil 'start' okunu tıklayarak başlatın.
- Virtual Box, yeni bir pencere açar ve web tarayıcısında localhost: 2080 adresine giderek VM'ye erişilebileceğini bildiren bi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, histone PTM antikor özgünlüğünün analizi için bir peptid mikroarray platformu tasarlamak ve üretmek için kullanılmıştır. Çekirdek ve varyant histon proteinleri 38 üzerinde bulunan PTMS bilinen kombinasyonların birçok temsil - (uzunluğu 40 kalıntıları 20) dizi 300'den benzersiz peptid özellikleri bir kütüphane sorgular. Bu boru hattı, yaygın olarak kullanılan ve piyasada mevcut olan histon PTM antikorlarının taranması için bir çalışmacıdır ve tam v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biyomedikal araştırma uygulamalarında antikor güvenilirliği en iyisi 46 , 47 . Bu, özellikle histamin PTM'lerinin bolluğu ve dağılımını karakterize etmek için geliştirilen teknikler için anahtar araçlar olarak antikorların bulunduğu kromatin biyokimyasında geçerlidir. Burada sunulan protokol, histon PTM antikor özgünlüğünü analiz etmek için peptit mikrodizilerinin tasarım, imalat ve kullanımı için optimize edilmiş bir boru hattı detaylandırmaktadır. Bu boru .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Van Andel Araştırma Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüsünden (CA181343) SBR'e verilen bir araştırma ödeneği ile desteklendi
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Baskı Tamponu | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin kaplı cam mikroskop slaytları | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polipropilen 384 kuyulu plaka | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-floresein | Sigma | 53608 | |
| kontakt mikrodizi yazıcı | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Mikrodizi Yazıcı |
| Kontak Mikrodizi Yazıcı | Gen Makineleri | OmniGrid 100 | OmniGrid Mikrodizi Yazıcı |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Engelleme Tamponu | ArrayIt | SBB | |
| Hidrofobik balmumu kalemi | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP |
| Kalem Silikon Conta | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hibridizasyon Kabı | Thermo Scientific | 267061 | veya benzeri kap |
| Floresan boya konjuge ikincil antikor | Yaşam Teknolojileri | A-21244 | Alexa Fluor 647 (tavşan karşıtı) |
| Floresan boya konjuge ikincil antikor | Yaşam Teknolojileri | A-21235 | Alexa Fluor 647 (fare karşıtı) |
| Balmumu Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Mikrodizi Tarayıcı | Innopsys | InnoScan 1100AL | veya eşdeğeri mikrodizi tarayıcı |
| EipTitan Histon Peptit Mikrodizi | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histon Peptit Mikrodizi | Millipore | 16668 | |
| MODİFİYE HİSTON Peptit Dizisi | Aktif Motif | 13001 | |
| Histon Kodu Peptit Mikrodizileri | JPT | His_MA_01 | |
| Balmumu | Kraliyet Meşe | GulfWax | balmumu yazıcı için |
| Nemlendirilmiş Mikrodizi Slayt Hibridizasyon Odası | VWR | 97000-284 | |
| Yüksek verimli mikroskop slayt yıkama odası | ArrayIt | HTW | |
| Mikroskop slayt santrifüj | VWR | 93000-204 | |
| Antikor 1 | Abcam | 8898 | |
| Antikor 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biyotinillenmiş histon peptit | EpiCypher | 12-0001 | Örnek peptit. Çeşitli modifikasyonlara sahip benzer peptitler, çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Kaynaklar
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
