Yöntem makalesi

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

7.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55919

⸱

28 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

Bu makalede

Özet

Burada, insan hücrelerinde Moloney fare lösemi virüsü tabanlı retroviral vektörlerin entegrasyon alanlarının genom çapında haritalanması için bir protokolü açıklıyoruz.

Özet

Moloney sıçangil lösemisi (MLV) virüs esaslı retroviral vektörler ağırlıklı olarak asetile arttırıcılar ve yükselticiler ile bütünleşir. Bu nedenle, mLV entegrasyon bölgeleri, aktif düzenleyici elementlerin işlevsel belirteçleri olarak kullanılabilir. Burada, hücreye özgü güçlendiricilerin ve yükselticilerin genom çapında tanımlanmasına olanak tanıyan bir retroviral tarama aleti sunuyoruz. Kısacası, hedef hücre popülasyonu, bir mLV türevi vektör ile transdüser hale getirilir ve genomik DNA sık sık kesme kısıtlama enzimi ile sindirilir. Genomik fragmanları uyumlu bir DNA bağlayıcısı ile bağladıktan sonra, linker aracılı polimeraz zincir reaksiyonu (LM-PCR), virüs konakçı genom kavşaklarının çoğaltılmasına izin verir. Genis çapında mLV entegrasyon profilini tanımlamak için amplikonların seri sıralaması kullanılır. Son olarak, tekrarlayan entegrasyon kümeleri, hücre tipine özgü transkripsiyonel programların aktivasyonundan sorumlu, hücreye özgü düzenleyici bölgelerin tanımlanması için tanımlanır.

ör., Somatik kök hücreler) retrospektif olarak tanımlanması için bir enstrümantal tekniktir.

Giriş

Hücre kimliği, spesifik gen gruplarının ifadesi ile belirlenir. Organizmalar ve arttırıcılar gibi cis düzenleyici elemanların rolü, hücre tipi spesifik transkripsiyonel programların aktivasyonu için çok önemlidir. Bu düzenleyici bölgeler, çeşitli hücre tipleri 1 , 2 , 3'te genom geniş tanımlaması için yaygın olarak kullanılan özel histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörleri ve ko-faktör bağlama ve kromatin erişilebilirliği gibi spesifik kromatin özellikleri ile karakterizedir. Özellikle, histone H3 lizin 27'nin (H3K27ac) asetillenmesinin genom çapındaki profili aktif promotörleri, arttırıcıları ve süper arttırıcıları 4 , 5 , 6 tanımlamak için yaygın olarak kullanılır.

Moloney fare lösemi virüsü (MLV) gen için yaygın olarak kullanılan bir gamma-retrovirüsüdürMemeli hücrelerinde transfer. Bir hedef hücrenin enfekte edilmesinden sonra, retroviral RNA genomu, ön entegrasyon kompleksini (PIC) birleştirmek için viral ve hücresel proteinleri bağlayan çift sarmallı bir DNA molekülüne retro-transkribe edilir. PIC çekirdeğe girer ve konakçı hücre kromatini bağlar. Burada, anahtar bir PIC bileşeni olan viral integraz, proviral DNA'nın konukçu hücre genomuna entegrasyonuna aracılık eder. Genomik DNA'daki mLV entegrasyonu rasgele değil, ancak promotör ve güç arttırıcılar gibi aktif cis düzenleyici elemanlarda, hücreye özel bir biçimde 7 , 8 , 9 , 10 meydana gelir. Bu özel entegrasyon profiline, mLV integraz ile hücresel bromodomain ve ekstraterminal alan (BET) proteinleri 11 , 12 , 13 arasındaki doğrudan etkileşim aracılık eder. BET proteinleri (BRD2, BRD3 veBRD4), konak kromatin ve mLV PIC arasında bir köprü görevi görürler: ekstratik alan, mLV integraz 11,12,13 ile etkileşirken, bromodomainsleri yoluyla yüksek oranda asetillenmiş cis düzenleyici bölgeleri tanımaktadırlar.

Burada, mLV'nin entegrasyon özelliklerine dayalı aktif cis düzenleyici bölgeleri haritalamak için yeni bir araç olan retroviral taramayı tarif ediyoruz. Kısaca hücreler, arttırılmış yeşil floresan protein (eGFP) raportör genini eksprese eden mLV türevi retroviral vektör ile transdüser hale getirilir. Genomik DNA özümlemesinden sonra, mLV vektörünün 3 'uzun terminal tekrarlaması (LTR) ile genomik DNA arasındaki bağlantı noktaları, bağlayıcı aracılı PCR (LM-PCR) ile çoğaltılmakta ve kitlesel sekanslanmaktadır. MLV entegrasyon bölgeleri insan genomuna eşlenir ve mLV tarafından yüksek oranda hedeflenen genomik bölgeler, mLV entegrasyon siteleri kümeleri olarak tanımlanır.

Retroviral taramaNing birçok insan primer hücrelerinde hücreye özgü aktif düzenleyici elementleri tanımlamak için kullanılmıştır 14,15. MLV kümeleri, çoğu H3K27ac gibi aktif histon işaretlerini barındıran ve hücreye spesifik olan, epigenetik olarak tanımlanmış yükselticiler ve eşlenik maddeler ile birlikte eşlendi. Retroviral tarama prospektif olarak saflaştırılmış hücre popülasyonlarında 7 , 14 yanı sıra prospektif izolasyon için etkili belirteçlerden yoksun olan keratinosit kök hücreleri gibi retrospektif olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarında DNA düzenleyici elementlerin genom çapında belirlenmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İnsan Hücrelerinin MLV İletimi

  1. Hedef hücreleri izole edin ve bunları eGFP raportör genini barındıran ve Veziküler Stomatit Virüs G (VSV-G) veya amfotropik zarf glikoproteini 16 ile pseudotiplenen bir mLV türevi retroviral vektör ile transdüseyin.
    1. Aşağıdaki analizler için sahte transduced hücreleri olumsuz bir kontrol olarak tutun. MLV'ye dayalı retroviral vektörler etkili bir şekilde bölünen hücreleri dönüştürdüğünden, hedef hücre popülasyonunu hücre bölünmesini uyaran koşullarda kültürleyin. Transdüksiyon koşulları, çalışılan her hücre tipi için özel olarak optimize edilmelidir. İnsan hematopoietik progenitörleri, T hücreleri ve epidermal hücreler için hücre büyümesi ve transdüksiyon koşulları Referans 7, 14, 15 ve 17'de açıklanmaktadır.
  2. Transdüksiyondan 48 saat sonra, 100,000 hücreyi% 2 fetal sığır serumu içeren fosfat tamponlu salin (PBS) 300 mcL içinde tekrar süspanse edin ve eGFP ekspresyonunu f olarak ölçünDüşük sitometrik analiz (488 nm uyaran lazer). Sahte iletim hücreleri negatif kontrol olarak kullanın. En uygun entegrasyon bölgesi alımı için, GFP + hücrelerini Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) ile arındırın.
  3. Genomik DNA hazırlığı için 0.5 ila 5 milyon hücre toplayın. Entegre edilmemiş provirüsün seyreltilmesi için uzun bir kültür periyodu (> 7 gün) tercih edilir ve iyi nazlı kök hücrelerin uzun vadeli yavrularının analizi yapılırken gereklidir (bkz. Tartışma Bölümü ve referans 15 ). Hücre peletleri derhal dondurulabilir ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklanabilir.

2. Linker aracılı PCR (LM-PCR) ile mLV entegrasyon alanlarının amplifikasyonu

  1. Genomik DNA'nın (gDNA) hazırlanması
    1. Üreticinin talimatlarına göre, kolon bazlı bir DNA özütleme kiti kullanarak gDNA'yı çıkarın ve kültürlenmiş hücreler için protokolü takip edin.
  2. Restriksiyon enzim digestiüzerinde
    1. 1.5 mL tüpler içinde numune başına 4 kısıtlama enzim sindirimi oluşturun. 10 uL'lik bir son hacimde 1 uL Tru9I (10U) ve 1 uL Tampon M ilave ederek her tüpte 0.1 ila 1 μg gDNA'yı özümleyin. Reaksiyonları 6 saat boyunca veya gece boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
    2. Her reaksiyona 1 μL PstI (10U), 1 μL Tampon H ve 8 μL su ilave edin. Reaksiyonları 37 ° C'de 6 saat veya gece boyunca inkübe edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  3. Bağlayıcı ligasyonu
    1. Bağlayıcı artı iplikçiği ve bağlayıcı eksi iplikçik oligonükleotidlerini 100 uM konsantrasyonda karıştırarak 1.5 mL'lik bir tüp içinde 100 uM Tru9I bağlayıcı stok solüsyonu hazırlayın. Tüpü 100 ° C'ye ayarlanmış bir suya koyun ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Tru9I linker stok solüsyonu kullanıma kadar -20 ° C'de saklanabilir.
    2. 1.5 mL tüplerde 8 bağlayıcı ligasyon reaksiyonu oluşturun. Her reaksiyon için aşağıdaki bileşeni ekleyinS ila 10 uL kısıtlama enzimi sindirimi: 1.4 uL 10X T4 DNA Ligaz Reaksiyon tamponu, 1 uL 10 uM bağlayıcı Tru9I, 1 uL (2.000 U) T4 DNA ligazı ve 0.6 uL su. 16 ° C'de 3 ila 6 saat inkübe edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  4. Birinci PCR
    1. 0.2 mL tüpler içinde 48 PCR reaksiyonu (her ligasyon tüpünden 6 reaksiyon) ayarlayın. Her bir PCR için ligasyon reaksiyonundan 2 μL'ye aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 5 μL 10X PCR tamponu, 50 μM magnezyum sülfat 2 μL, 10 μM deoksinükleotit (dNTP) Karışımı, 1 μL 10 uM bağlayıcı primer, 1 μL 10 uM mLV-3 'LTR primeri, 0.3 uL (1.5U) Taq DNA Polimeraz ve 37.7 uL su ilave edildi. Primer sekanslar Tablo 1'de verilmektedir.
    2. Aşağıdaki gibi ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici içinde PCR reaksiyonu yapın: 95 ° C'de 2 dakika; 15 saniye için 95 ° C, 25 ° C'de 30 saniye, 72 ° C'de 1 dakika; 72 °5 dakika boyunca C; 4 ° C'de tutun. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  5. İkinci PCR
    1. 0.2 mL'lik tüplerde 48 PCR reaksiyonu ayarlayın (her biri "birinci PCR" tüpünden 1'dir). Her bir PCR için, ilk PCR reaksiyonunun 2 μL'sine aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 5 μL 10X PCR tamponu, 50 mM Magnezyum Sülfat, 1 μL 10 mM dNTP Mix, 10 uM linker iç içe geçmiş primer 1 uL, 2 μL 10 uM mLV-3 'LTR iç içe astar, 0.3 uL Taq DNA Polimeraz (1.5 U) ve 37.7 uL su ilave edildi. Seçilen spesifik muazzam sıralama stratejisi için tasarlanmış iç içe geçmiş primerler kullanın: (i) Illumina platformuyla uyumlu bağlayıcı iç içe astar ve mLV-3 'LTR iç içe astar; (Ii) Roche platformuyla uyumlu bağlayıcı iç içe astar ve mLV-3 'LTR iç içe astar. Primer sekanslar Tablo 1'de listelenmiştir.
    2. Aşağıdaki gibi ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici içinde PCR reaksiyonu yapın: 95 ° C'de 2 dakika; 2595 ° C'de 15 saniye, 58 ° C'de 30 saniye, 72 ° C'de 1 dakika; 72 ° C'de 5 dakika; 4 ° C'de tutun. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
    3. 48 yuvalanmış PCR reaksiyonlarını 15 mL'lik bir tüpe (son hacim ~ 2.4 mL) doldurun. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  6. Agaroz jel elektroforezi ile LM-PCR ürünlerinin varlığını ve boyutunu belirleyin.
    1. 20 mcL LM-PCR ürünlerine 4 mcL Yükleme Tamponu ekleyin ve 100 bp DNA merdiven ile birlikte% 1 agaroz jel üzerine numune yükleyin. Jel 30 ila 60 dakika boyunca 5 V / cm'de çalıştırın ve etidyum bromid boyama ile PCR ürünlerini görselleştirin.
    2. Olumsuz kontrol olarak taklit transduced örnek bir LM-PCR reaksiyonu çalıştırın.
  7. Amfikonları, 0.1 hacim sodyum asetat çözeltisi (3 M, pH 5.2) ve 2.5 hacim% 100 etanol ekleyerek çöktürün. Karıştırıp -80 ° C'de 20 dakika boyunca dondurun.
    1. Fuarda dönüyorStandart bir mikrosantrifüjde 20 dakika 4 ° C'de hız uygulayacağız. Süpernatantı atın ve pelleti% 70 etanol ile yıkayın. Standart bir mikrosantrifüjde 4 ° C'de 5 dakika tam hızda döndürün.
    2. Süpernatantı atın ve peleti havayla kurutun. 200 μL PCR sınıfı su ekleyin ve DNA'yı tekrar süspanse edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  8. 100 μL LM-PCR ürününe 20 μL Yükleme Tamponu ekleyin ve 100 bp DNA merdiveni ile birlikte% 1 agaroz jel üzerine numune yükleyin.
    1. Jel 30 ila 60 dakika boyunca 5 V / cm'de çalıştırın ve 150 ila 500 bp uzunluğunda amplikon içeren jel kısmını kesin.
    2. LM-PCR ürünlerini kolon bazlı bir jel özütleme kiti ile saflaştırın ve bir UV spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün.
  9. Üreticinin talimatlarına göre bir biyolojik analiz cihazı kullanarak LM-PCR ürünlerinin uzunluğunu değerlendirmek için 1 μL kitaplık kullanın.
  10. Amfikonların Shotgun klonlaması
    1. Saflaştırılmış LM-PCR ürünlerinden 20 ng kullanın ve üreticinin talimatlarına uygun olarak pCR2.1-TOPO vektörüne klonlayın.
    2. Uygun olan örnekleri tanımlamak için klonların% 50'sinde viral genom kavşakları (mLV-3 'LTR iç içe astar dahil) varlığını açığa çıkarmak için M13 Universal primerini ve ardından oluşan dizilerin genomik haritalanmasını takip eden sekanslama reaksiyonları gerçekleştirin Muazzam sıralama için. Bir viral-genom kavşağı örneği:
      figure-protocol-1
      MLV-3 'LTR iç içe astar 454 ve bağlayıcı iç içe astar 454 ( Tablo 1 ) kalın olarak ve viral LTR'nin italik olarak 3' ucunda belirtilmiştir. İnsan genom dizisi kırmızı metinle vurgulanır (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. mLV Entegrasyon Sitelerinin Devasa Dizilimi

NOT: LM-PCR prodTicari platformlar kullanılarak sekanslar sıralanabilir (ikinci PCR reaksiyonunda uygun iç içe geçmiş primer çiftinin seçilmesi, alt bölüm 2.5.1'e bakınız). Roche GS-FLX pirosequencing platformu ile sıralama için, önceki kağıtlara 7 , 14 , 15 bakınız. Bu bölümde, Illumina sıralama platformu için yeni optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır.

  1. Kütüphane hazırlığı
    1. 0.2 mL tüpler içinde numune başına 1 endeksleme PCR reaksiyonu oluşturun. Her bir PCR için 5 μL (150-170 ng) saflaştırılmış LM-PCR ürününe aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 5 μL Index Primer 1, 5 μL Index Primer 2, 25 μL 2X Master Mix ve 10 μL PCR- Düşük su. Her numune için farklı bir indeks kombinasyonu kullanın.
    2. Aşağıdaki gibi, ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyici içinde PCR reaksiyonlarını gerçekleştirin: 95 ° C'de 3 dakika; 30 saniye için 95 ° C, 8 saat 30 saniye boyunca 55 ° C, 30 saniye boyunca 72 ° C; 72 ° C'de 5 miçinde; 4 ° C'de tutun.
    3. Bir katı faz reversible immobilizasyon (SPRI) boncuk izolasyon protokolünü kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın: Yeni 1.5 mL tüplerde, her bir numuneye 56 μL boncuk ekleyin ve üretici talimatlarını takip edin. 25 mcL Tris-HC1 10 mM içinde elute edin. Kütüphaneler kullanıma kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  2. Kütüphane kontrolü
    1. Bir biyolojik analiz cihazı kullanarak kütüphane boyutunu değerlendirmek için 1 uL örnek kullanın.
    2. Üreticinin talimatlarına göre, floresan esaslı bir Gerçek zamanlı PCR testi kullanarak kütüphane molaritesini nicelemek için 1 uL numune kullanın.
  3. Kütüphane seyreltme ve sıralama
    1. Tris-HC1 10 mM kullanarak kütüphaneleri 10 nM'ye seyreltin. Kütüphaneleri bir araya getirmek için, her bir seyreltilmiş kütüphanenin 5 uL'ini yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın ve ardından havuzu, 10 mM Tris-HC1 içinde 4 nM'ye seyreltin.
    2. 5 μL seyreltilmiş havuzu, 5 mcL 0.2 N NaOH ile yeni bir 1,5 mL tüp, kısaca vorteksleyin, aşağı spinleyin ve kütüphaneleri denatürecek şekilde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    3. Tüpleri buz üzerine koyun ve önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponu (HT1) 990 μL ekleyin. Yeni bir 1.5 mL tüp içinde 300 uL denatüre edilmiş havuz alınır ve 10 pM son kütüphane havuzunu elde etmek için 300 μL önceden soğutulmuş HT1 ilave edin.
    4. Buna paralel olarak, 2 mL'lik bir PhiX kontrol kütüphanesi (10 nM) ile 3 mL Tris-HC1 10 mM içeren 1.5 mL'lik bir tüple karıştırın. Seyreltilmiş PhiX denatüre etmek için 5 μL NaOH 0.2 N, kısa bir süre vorteksleyin, spin aşağı indirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü buz üzerine koyun ve 990 μL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin.
    5. Yeni bir 1.5 mL tüp içinde 300 uL denatüre PhiX ilave edin ve 10 pM final PhiX elde etmek için 300 μL önceden soğutulmuş HT1 ekleyin.
    6. Yeni bir 1.5 mL tüp içinde, denatüre edilmiş PhiX kitaplığının 90 uL'si ile denatüre edilmiş kütüphane havuzu 510 uL'yi karıştırın, böylece% 15 PhiX kontrollü bir son 10 pM havuz elde edin.
    7. Bu 600 μL numuneyi pipetleyinÇözülmüş sıralama reaktifi kartuşunun Load Sample deposuna boşaltın ve hemen tek okunan 150 çevrimlik bir çalışma yapmak için devam edin.
      NOT: Bu protokol için gerekli kritik reaktifler ve primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Retroviral tarama prosedürünün iş akışı

Retroviral tarama prosedürünün iş akışı Şekil 1'de şematize edilmiştir. Hedef hücre popülasyonu arıtılır ve bir eGFP raportör geni ifade eden bir mLV türevi retroviral vektör ile transforme edilir. Transgen, viral genomun konak DNA'sına sentezini, ters transkripsiyonunu ve entegrasyonunu sağlayan, iki özdeş uzun terminal tekrarları (5 've 3' LTR...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, kromatin bölgelerini hedefleyen bir epigenetik olarak aktif promotörler ve arttırıcılar olarak işaretlenmiş bir retrovirüs olan mLV'nin entegrasyon sitelerinin genom çapında haritalandırılması için bir protokolü açıkladık. Protokolün kritik adımları ve / veya sınırlamaları şunları içerir: (i) hedef hücre popülasyonunun mLV iletim; (Ii) LM-PCR ile virüs-konakçı bağlantı noktalarının çoğaltılması; (Iii) entegrasyon alanlarının yüksek bir kısmının alınması. MLV tabanlı retroviral vektörler bölerek bölünen hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), İtalya Eğitim Bakanlığı, Üniversiteler ve Araştırma Bakanlığı'nın (Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003'teki FIRB-Futuro) hibeleriyle desteklendi , EPIGEN Epigenomik Flagship Projesi), İtalyan Sağlık Bakanlığı (Genç araştırmacılar Çağrı 2011 GR-2011-02352026) ve Imagine Enstitüsü Vakfı (Paris, Fransa).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031veya eşdeğeri
Fetal Sığır SerumuThermoScientific16000044veya eşdeğeri
0.2 ml tüplergenel laboratuvar tedarikçisi
1.5 ml tüplergenel laboratuvar tedarikçisi
QIAGEN QIAmp DNA mini Kiti ve nbsp;QIAGEN51306veya eşdeğeri
T4 DNA ligaz New England BioLabsM0202T
T4 DNA Ligaz Reaksiyon tamponuNew England BioLabsM0202T
Bağlayıcı Artı Strand oligonükleotidgenel laboratuvar tedarikçisi5'-PO < sub>4< / sub>-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (Arıtma derecesi: SDS-PAGE)
Bağlayıcı Eksi Iplikçik oligonükleotidgenel laboratuvar tedarikçisi5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Arıtma derecesi: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Tampon HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platin Taq DNA Polimeraz Yüksek Sadakat Invitrogen11304011
10 mM dNTP KarışımıInvitrogen18427013veya eşdeğeri
PCR sınıfı sugenel laboratuvar tedarikçisi
96 kuyulu termal döngüleyici (ısıtmalı kapaklı)genel laboratuvar tedarikçisi
bağlayıcı astargenel laboratuvar tedarikçisi5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Arıtma derecesi: PCR sınıfı)
MLV-3' LTR astargenel laboratuvar tedarikçisi5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Arıtma derecesi: PCR sınıfı)
bağlayıcı iç içe astar 454genel laboratuvar tedarikçisi5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG [AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (Saflaştırma sınıfı: SDS-PAGE)
MLV-3' LTR iç içe astar 454genel laboratuvar tedarikçisi5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Saflaştırma sınıfı: SDS-PAGE)
bağlayıcı iç içe astar Illuminagenel laboratuvar tedarikçisi5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Saflaştırma derecesi: SDS-PAGE)
MLV-3' LTR iç içe astar Illuminagenel laboratuvar tedarikçisi5'-GTCTCGTGGCGGAGATGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Saflaştırma derecesi: SDS-PAGE)
Sodyum Asetat Çözeltisi (3M) pH 5.2genel laboratuvar tedarikçisi
Moleküler biyoloji için etanol (mutlak)Sigma-AldrichE7023veya eşdeğeri
Topo TA Klonlama kiti (pCR2.1-TOPO vektör ile)InvitrogenK4500-01
QIAquick Jel Ekstraksiyon kitiQIAGEN28704
AgaroseSigma-AldrichA9539veya eşdeğeri
Etidyum bromür Sigma-AldrichE1510veya eşdeğeri
100 bp DNA merdiveniInvitrogen15628019veya eşdeğeri
6x Yükleme TamponuThermoScientificR0611veya eşdeğeri
NanoDrop 2000 UV-Vis SpektrofotometreThermoScientificND-2000
Nextera XT İndeks kitiIlluminaFC-131-1001 veya FC-131-1002
2x KAPA HiFi Sıcak Başlangıç Hazır Karışımı KAPA BiosystemsKK2601
2 ml tüpler için dinamik standInvitrogen12321Dveya eşdeğeri
Agencourt AMPure XP 60 ml kitiBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5genel laboratuvar tedarikçisi
Agilent 2200 TapeStation sistemi AgilentTechnologiesG2964AAveya eşdeğeri
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582veya eşdeğeri
D1000 ReaktifleriAgilent Technologies5067-5583veya eşdeğeri
Illumina platformları için KAPA Kitaplığı Miktar Belirleme Kiti (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı Biyosistemler4329003
NaOH 1.0 N, moleküler biyoloji sınıfıgenel laboratuvar tedarikçisi
HT1 (Hibridizasyon Tamponu)Illumina MiSeq Reaktif Kitinde
MiSeq Reaktif Kiti v3 (150 döngü)IlluminaMS-102-3001
MiSeq SistemiIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
sağlanır

Kaynaklar

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba lay c arac l PCRGenomik DNA SindirimiRestriksiyon Enzimi SindirimiAk Sitometrisi AnaliziAgaroz Jel ElektroforeziK t phane Haz rlamaDerin Sekanslama

İlgili makaleler