Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Çoğu çiçekli bitkiler, zigot ve embriyo anne dokuda derin gizlenir ve böylece uzun nasıl dinamik olarak geliştirmek bir gizem olmuştur; Örneğin, nasıl vücut eksen kurmak için zigot polarizes ve nasıl embriyo organ oluşumu sırasında çeşitli hücre kaderi belirtir. Bu el yazması bir vitro ovule kültür yöntemi zigotları ve embriyoların Arabidopsis thalianageliştirme canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için açıklar. En iyi duruma getirilmiş ekimi orta zigotları veya erken embriyo bereketli bitkiler büyümek için izin verir. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar dizi aygıtı ile birleştirerek, ovule aynı konumda sıvı ortamda tutulur. Bu fiksasyon bir mikroskop altında aynı ovule geç embriyo aşamasına zygotic bölümden birkaç gün gözlemlemek çok önemlidir. Elde edilen canlı hücre görüntüleme zigot polarizasyon, nükleer geçiş ve sitoiskeleti düzenlenmesi ve aynı zamanda hücre bölünmesi zamanlama ve hücre kader belirtimi embriyo desenlendirme sırasında gibi gerçek zamanlı dinamikleri izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu ovule yetiştirme sistemi çeşitli faktörlerin etkilerini embriyo gelişimini incelemek için önleyici tedaviler ile ve hücre-hücre iletişim rolü incelemek için lazer bozulma gibi optik manipülasyonlar ile birleştirilebilir.
Giriş
Bir organizmanın temel vücut planı tek hücreli bir zigot geliştirir. Çoğu çiçekli bitkilerde bir apikal ve ateş ve kök, sırasıyla1geliştirmek bir Bazal Hücre zygotic bölümü oluşturur. Bu nedenle, bitki vücut embriyogenez sırasında nasıl oluştuğunu anlamak önemlidir, ancak değil onlar derin çiçek geliştirmek çünkü doğrudan oturma zigotları ve embriyo dinamiklerini gözlemlemek için etkili bir araç olmuştur. Mısır ve pirinç, gibi birçok monocot türü bir vitro fertilizasyon yöntemi kurulan2,3olmuştur. Bu yöntemde, izole sperm ve yumurta hücreleri elektriksel olarak veya kimyasal ol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlık In Vitro Ovule kültür orta
- yapmak sıvı ortamı içinde vitro ovule kültür için (" N5T orta ") 1 x Nitsch Bazal tuz karışımı, %5 (w/v) trehalose dihydrate, 0,05 içeren % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit (MES)-KOH (pH 5,8) ve 1 x Gamborg ' s vitamini çözüm.
- KOH ile 5.8 için pH ayarlama.
- Orta (121 ° C, 20 dk) veya bir 0,22-µm filtresi filtre tarafından ısıyla sterilize.
Not: Steril orta için 2-3 ay 4 ° C'de saklanabilir.
2. PDMS Micropillar dizi aygıtı hazırlanması
- kesme bıçağı, jilet veya cam parçası bir 35 mm cam alt çanak (14 mm φ) sığa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu ovule yetiştirme sistemi kullanarak, bu yöntem zigot polarizasyon ve embriyo desenlendirme yaşam dinamikleri izleyebilirsiniz. Daha önce yoktu çünkü gerçek zamanlı davranışı anne dokuda derin gizli olan zigot ve embriyo, görselleştirmek için hiçbir teknik bir başarı 's. Şekil 3A ve tamamlayıcı Video 1 genç zigot içinde mikrotübüller (MTs) subapical bölge10enine bir halka olarak birikir göster. Zigot apikal yönde his.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu el yazması zigotları ve embriyo geliştirme canlı hücre görüntülemede etkilidir bir basit vitro ovule ekimi protokol tanıttı.
PDMS aygıt tasarım optimizasyonu embriyo sahne göre gerekebilir. Bir microcage dizi yönlendirmesini ayarlamak için ve ovules9konumunu düzeltmek için ilk geliştirilen cihaz olduğunu ve o zaman micropillar aygıt ovules daha verimli bir şekilde yakalamak için inşa edilmiş8. Ayrıca, micropillars daha ince ve yumuşak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu çalışmada mikroskobu Enstitüsü, dönüştürücü biyo-molekülleri, (TEFE-ITbM) Nagoya Üniversitesi yapıldı ve Japonya gelişmiş bitki bilim şebeke tarafından desteklenmesi. Bu eser bilim promosyon için hibe Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (ERATO T.H. ve M.U. projeye) ve Japonya toplum tarafından desteklenmiştir: yenilikçi alanlar ('ları üzerinde bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid JP24113514, JP26113710, JP15H05962 ve JP15H05955 M.U. ve Nos için. JP16H06465, JP16H06464 ve JP16K21727-T.H için), bir Grant-in-Aid genç bilim adamları (B, Nos. JP24770045 ve JP26840093 M.U. için) ve bir Grant-in-Aid zorlu araştırmacı araştırma (No. M.U. için JP16K14753).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Nitsch bazal tuz karışımı | Duchefa | N0223 | |
| trehaloz dihidrat | Wako Saf Kimyasal | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg ' s vitamin çözeltisi | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35 mm cam tabanlı çanak | Matsunami Cam | D111300 | |
| 35 mm kültür kabı | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 > 26 mm sürgülü cam | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 > 18 mm sürgülü cam | Matsunami Cam | C018181 | |
| iğne (ölçü 0,40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Daldırma ortamı Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Elektrikli | Özelleştirilmiş bir ekipmandır ve bu nedenle Katalog Numarası mevcut değildir. | |
| CV1000 | Yokogawa Elektrikli | CV1000-SP84 |
Kaynaklar
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
