Method Article

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

DOI:

10.3791/55982

⸱

October 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel 2D hücre kültürü 3D hücre kültürü için yükseltmek için biz microfabrication macroporous microscale cryogels (microcryogels), 3D microtissues oluşturmak için hücre tipleri çeşitli ile yüklenen üretmek için cryogelation teknolojisi ile entegre etmiş. Burada, biz çok yönlü 3D microtissues ve rejeneratif terapi ve ilaç tarama uygulamaları imal etmek protokol mevcut. Boyut ve şekil kontrol edilebilir microcryogels hasat çip dışı enjekte edilebilir rejeneratif tedavi için tek tek hücre yüklü taşıyıcıları olarak veya daha fazla monte üstünde-küçük parça içine 3D microtissue diziler yüksek üretilen iş için olmak bir dizi yonga üzerinde fabrikasyon uyuşturucu tarama. Bu microscale cryogels yüksek elastik yapısı nedeniyle, 3D microtissues minimal invaziv hücre tedavisi için büyük injectability enjeksiyon sırasında mekanik kesme kuvvetlerinden hücreleri koruyarak sergi. Bu gelişmiş hücre hayatta kalma ve fare uzuv iskemi modelinde tedavi etkisi sağlar. Bu arada, derleme bir standart 384-multi-iyi biçimde 3D microtissue dizilerin ortak laboratuvar olanakları ve donanımları, yüksek-den geçerek uyuşturucu bu çok yönlü 3D hücre kültür platformda eleme etkinleştirme kolaylaştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüzeylerde düzleştirilmiş iki boyutlu (2B), bir kültür yemek veya çok iyi Kaplamalar, gibi geleneksel hücre kültürü pek hücre davranışları onların yerli Birleşik yakın temin. Çeşitli hücre tipleri, hücre dışı Matrisler ve biyoaktif çözünür faktörler üç boyutlu (3D) mimarileri1,2,3 oluşturan yerel hücresel microenvironments doğru tekrarlama ,4, biomimicking doku vitro doku Mühendisliği, rejeneratif tıp uygulamalarında oluşturmak için gerekli temel Biyoloji Araştırma ve ilaç keşif5,6,7 ,8,9.

2D hücre kültürü, yerine 3D hücre kültürü biomimetic mikro mimari ilerlemek için yaygın olarak kullanılan ve işlevsel özellikleri hücre vitrokültürlü. Bir popüler 3D hücre kültür toplama pulcuklarının7,8,9,10hücrelere yapılandırmaktır. Hücresel pulcuklarının yaralı dokulara gelişmiş hücresel saklama ve hayatta kalma ile karşılaştırıldığında enjeksiyon dağınık hücrelerinin enjekte. Ancak, üniform olmayan küresel boyut ve hücre enjeksiyon sırasında sıvı kesme zorla dayatılan kaçınılmaz mekanik yaralanma kötü hücre tedavi edici etkileri11,12,13için neden. Benzer şekilde, doğal olmayan-tekdüzelik pulcuklarının toplama sırasında zorlu10eleme 3D hücre tabanlı yüksek üretilen iş uyuşturucu onların çeviri yaptı.

3D hücre kültürü için başka bir yöntem genellikle sulu hydrogels veya gözenekli iskele hücreler kapsüller Biyomalzeme, yardımı ile elde edilir. 3D mimarileri oluşturarak büyük esneklikleri izin veren bir yayın. Terapi için toplu iskele içinde kapsüllü hücreleri genellikle hayvan vücudu invaziv ve travmatik, bu nedenle geniş kendi çeviri başucu için kısıtlama cerrahi implantasyon yoluyla teslim edilir. Öte yandan, sulu hydrogels hayvan cesetleri, situ jelleşme üzerinden termo-, kimyasal veya enzimatik crosslinking11izin içine hidrojel habercisi çözümde askıya hücreleri enjekte edilerek minimal invaziv tedavi etkinleştirin. Whilst hidrojel öncüleri hala sulu bir durumda hücreleri teslim gibi Ancak, onlar da mekanik makas için enjeksiyon sırasında maruz kalır. Sadece öyle değil, kimyasal veya enzimatik crosslinking hidrojel in situ jelleşme sırasında da içindeki hücreleri hasar empoze olabilir. Uyuşturucu tarama için biomaterial destekli hücre kültürleri tekdüzelik, kontrol edilebilirlik ve işlem hacmi ile sorunlarla karşı karşıya. Hydrogels kullanarak, hücreleri genellikle sırasında jelleşme, hangi hücre canlılığı ve işlev süreci etkileyebilir katılmaktadırlar. Hücre tohum sırasında jelleşme Ayrıca kullanımı en yüksek üretilen iş ekipmanı tarafından hidrojel jelleşme tohum hücre önce önlemek için buz üstünde tutulması gereken ve hidrojel için doğruluğunu sağlamak için genellikle çok ince losyonlu ipuçları jam beri engellemektedir yüksek işlem hacmi tarama. Önceden biçimlendirilmiş iskele potansiyel olarak hücre kültürü, biomaterial imalat işlemleri ancak çoğu iskele bazlı ürünler elde edilebilir aynı derecede hacim materyalleri ile nispeten daha düşük işlem hacmi14ayrı.

Bazı geçerli 3D kültür yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelmek için bir kapalı ve kullanıcı-dostça microcryogel dizi çip15imal etmek bir microfabrication-cryogelation entegre teknoloji geliştirdi. Bu protokol için jelatin Biyouyumlu, parçalanabilir, düşük maliyetli, ve daha fazla değişiklik hücre eki için gereklidir gibi microcryogel imalat tekniği örneklemek için seçilir. Doğal veya sentetik kaynaklarının diğer polimerler için imalat, uygulamaya bağlı olarak da kullanılabilir. Bu teknoloji ile kontrol edilebilir boyut, şekil ve düzen ile minyatür ve yüksek derecede elastik microcryogels imal. Çeşitli hücre türleri ile yüklendiğinde, 3D microtissues çeşitli uygulamalar için oluşmuş. Bu benzersiz özellikler sonra enjeksiyon vivo içinde Gelişmiş tedavi edici etkileri için istenen injectability, hücre koruması ve site yönettiği saklama sağlar. Sadece öyle değil, microcryogels daha fazla ortak labaratuar donanımları ve yüksek üretilen iş hücre kültürü çok yönlü uyuşturucu tarama ve diğer hücresel deneyleri için gerçekleştirmek için aletleri ile uyumlu 3D microtissue dizileri oluşturmak için işleme. Burada, microcryogels ve tedavi sonrası kendi bireysel 3D microtissues veya 3D microtissue diziler için iki önemli uygulamaları, hücre tedavisi ve uyuşturucu taraması, sırasıyla10,15 olarak imalat süreci ayrıntılı .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hayvan deneyleri takip sıkı protokol hayvan Etik Komitesi üzerinde merkezi Biyomedikal analizi, Tsinghua Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Etik Kurulu onayı altında insan yağ dokusu, bölümü, plastik cerrahi, Pekin Birliği hastaneden ile aydınlatılmış onam hastalardan elde edildi.

1. fabrikasyon 3D Microcryogels

  1. Tasarım ve imalat microstencil dizi fiş
    1. Kullanım ticari yazılım tasarım diziler daire gibi belirli geometrileri için elipsler, üçgenler veya yonca 14, sonraki uygulamaya bağlı olarak.
      Not: Bölüm 2 rejeneratif tıp Protokolü'nün şu anlamlara ve uyuşturucu taraması Sökülüp takılması için iletişim kuralının 3 bölüm.
    2. Tasarım lazer oyma makine eşlik eden yazılım oyma lazer alın. Lazer oyma makinesi için lazer ayarlarla fabrika öneriler göre lazer-basık Poli (methymethacrylate) (PMMA) üzerine alınan Tasarım sayfaları.
    3. Microstencil dizi cips lazer oyma Enkazı temizlemek için deiyonize su ile yıkayın. Aylardır cips 60 ° C. mağaza oda sıcaklığında mühürlü bir torba kuru microstencil dizi.
  2. Microcryogel dizi cips imalatı
    1. yer 4 microstencil dizi örnek tepsi üzerindeki fişlere ve plazma temizleyici yerleştirin. Süpürge kapıyı kapat ve vakum pompası 2 min için açmak, sonra en fazla RF (microstencil dizi cips plazma temizleyici 3 dk hydrophilicity artırmak için oda sıcaklığında tedavi etmek için 18 W) açın.
    2. Ekle 0,06 g jelatin 1 mL deiyonize su formuna için % 6 (wt/vol) jelatin öncü çözüm (5 chips için yeterli). Sıcak bir su banyosunda yeterli erimeye 60 ° C'de. 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
    3. Oxazolidin % 0,3 son bir konsantrasyon jelatin öncü çözüm içine eklemek 3 µL. İyice karıştırın.
    4. Oxazolidin microstencil dizi çip üst yüzeyinin pipet 200 µL öncü çözüm.
      Not: 200 µL bir 75 mm × 25 mm yonga tasarım ne olursa olsun için yeterlidir. Artmak belgili tanımlık miktar orantılı olarak çip yüzey alanı arttı.
    5. El ile dağıtmak çözüm eşit çipi geri kazıma ve ileri bir bükülmüş cam çubuk ile 2-3 kat.
      Not: Her mikro-şey microstencil çip ile öncü çözüm hidrofilik onların doğası gereği plazma tedaviden sonra dolu olabilir.
    6. Hemen cryogelation için 16 h için-20 ° C dondurucuda öncü çözüm dolu dizi çip yerleştirin.
    7. Ayarla-40 ° c 30 dakika süreyle lyophilizer lyophilizer cryogelation sonra dizi cips yerleştirin ve 2 h vakum dizi patatese lyophilize.
      Not: buz lyophilizer cryogelation sublimes sırasında oluşan çünkü jelatin microcryogels birbirine bağlı macropores ile oluşurlar.
    8. Bölüm 2 kritik uzuv iskemi (CLI) tedavisinde ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3 bölüm için devam.

2. Form enjekte edilebilir 3D Microtissues için bireysel Microcryogels tedavi CLI için hasat

  1. hasat bireysel microcryogels
    1. Tasarım altında (75 mm × 25 mm), her biri 400 µm çapı, 600 çemberin içinde diziler ticari yazılım enjekte edilebilir 3D microtissue inşaat için. Microstencil dizi küçük parça imalatı ayrıntılı olarak açıklandığı Bölüm 1.1 olarak için 300 µm kalınlık PMMA kullanın.
    2. İmal microcryogel dizi fiş olarak bölümde 1.2.
    3. PDMS fırlatma Pin dizi adım 2.1.1 Standart yumuşak litografi 16 , tarafından 17 olduğu gibi aynı tasarımı ile imal.
    4. Microcryogel dizi çip üstünde tepe-in her microcryogel dizi üzerinde bir fırlatma iğne ile hizalama PDMS fırlatma Pin dizi yerleşimi. Microcryogel dizi çip PDMS fırlatma pin dizi bireysel microcryogels hasat için üzerinde microcryogels microwells çıkıntılı pimleri ile dışarı itmek için fırlatma pin dizi doğru basın.
    5. Microcryogel suya hasat ve hücre süzgeçler yardımıyla koleksiyon yapıyorum. Microcryogels (Yani, 600 microcryogels) bir küçük parça--dan toplamak için bir süzgeç kullanın.
    6. Yıkama microcryogels 0.1 M NaBH 4 buz herhangi bir uncross-bağlantılı aldehid kalıntı gidermek 20 dk için. 5 mL 0.1 M küçük parça başına NaBH 4 de kullanın. NaBH 4 atmak ve her zaman için 3-5 kez, 15 dk 5 mL deiyonize suyla yıka.
    7. Hücre süzgeç üzerinden su atın ve hücre süzgeç başına bir küme içine microcryogels toplamak ve tek bir küme bir 35 mm eğimli bir cımbız kullanarak kabında yer. 50-70 deiyonize µL her küme için su ve Petri kabına kapak kapak ekleyin. Böylece hiçbir microcryogels microcryogels monolayer Petri kabına yüzeyinde oluşturmak için başka bir microcryogel üstüne yalan Petri kabına seviyeye tüm microcryogels, dışarı masa üzerinde hafifçe dokunun.
    8. S (bkz. Adım 1.2.7) 2 için lyophilizing önce hasat microcryogels 4 ile 16 h için-20 ° C'de dondurmak. Microcryogels bir vakum oda sıcaklığında kadar daha fazla kullanılmasını depolamak.
  2. Microcryogels karakterizasyonu
    1. elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme tarayarak microcryogels gözeneklerin değerlendirmek.
      1. Immobilize üzerine bir örnek sahibi tarafından çift taraflı yapışkan bant ve 90 için bir sputter coater altınla paltoyla hasat ve liyofilize microcryogels s, görüntüleme SEM 11 tarafından önce. Değerlendirmek ve yedi farklı SEM görüntüleri görüntü analiz yazılımı kullanarak microcryogel gözenek çapı dağılımı analiz.
    2. 35-mm Petri kabına kurutulmuş jelatin microcryogels (GMs) ağırlığı için 600 liyofilize microcryogels oluşan bir küme tartın. 60 µL deiyonize su microcryogels liyofilize kümeye ekleyin ve 30 için bekleyin s tam olarak su emer ve güzel microcryogels için. Şişmiş microcryogels tartın.
      1. Belirleme denge şişme oranı ve microcryogels, gözeneklilik bu kurutulmuş jelatin microcryogels ve ağırlık microcryogels sulu microcryogels olan için yapılan su oranını şişmiş microcryogels ağırlığına oranı olarak, sırasıyla 13.
    3. Microcryogels dijital bir kuvvet ile entegre bir programlanabilir şırınga pompa kullanarak ölçü injectability ölçmek 14. Microcryogels Trypan tarafından
      1. leke 600 adet mavi ve homojen dağılımı elde etmek için 600 µL % 15 jelatin çözümde askıya alma. 1 mL microcryogel süspansiyon 1 mL şırınga yükleyin. Programlanabilir şırınga pompa akışı 1 mL/dk. hızında çalıştırarak 1 mL şırınga bağlı 27 lik bir iğne aracılığıyla karışımı enjekte
      2. Monitör gerçek zamanlı enjeksiyon kuvvet dijital güç tarafından test ölçmek ve kuvvet-zaman eğrisi çizmek. Enjeksiyon sonra microcryogels mikroskop altında bütünlüğünü gözlemlemek.
        Not: % 15 (wt/vol) jelatin çözümde askıya GMs olabilir sorunsuz enjekte ve enjeksiyon sonra sağlam kaldı.
    4. Microcryogels çözünebilirlik karakterize.
      1. İlk olarak, bir küme içinde 35-mm Petri kabına kuru ağırlığı 600 liyofilize microcryogels ağırlığını ölçmek. O zaman, 600 liyofilize microcryogels 2 mL % 0,025 (vol/vol) tripsin/EDTA içinde kaybolmanızı.
      2. Toplamak microcryogels çözümden farklı zaman noktalarda bir hücre süzgeç kullanarak (örneğin, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ve 70 dk). Wick bir doku ile dış görev aşırı çözüm. Microcryogels farklı zaman noktalarda ağırlığını ölçmek ve bozulma derecesi olarak microcryogel microcryogel zaman sıfır olan için belirli bir zaman noktasında ağırlığını oranını hesaplamak.
  3. Autoloading hücre içine formu 3D microtissues için microcryogels
    1. microcryogels vac altında 12 h gaz giderme tarafından takip adım 2.1.8 etilen oksit sterilizasyon sistemi 12 h gaz pozlama ile tarafından Sterilizevardır.
    2. Fare iskemik hindlimb tedavisi için insan yağ kaynaklı Mezenkimal stromal hücreler (hMSCs) seçin. Aşağıdaki yordamlar tarafından izole hücreler daha önce bildirilen 18.
    3. Kültür hMSCs büyüme orta içeren % 2 fetal sığır serum (FBS), 10 -8 M deksametazon, 10 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 ng/mL trombosit-türevi büyüme faktörü bb (PDGF-bb), 1 X insülin transferrin Selenyum (ITS) -4 M askorbik asit 2-fosfat, 100 U/mL penisilin ve DMEM/F12 100 µg/mL streptomisin. Senaryo Özeti oranı 1:3 konfluent ne zaman geçiş. Hücreleri geçiş 3-5 aşağıdaki deneylerde kullanın.
    4. Hasat tripsin ile hMSCs ve Fuchs-Rosenthal sayım odası kullanarak cep numarasını ölçmek ve 8 x 10 6 hücre/mL hMSCs büyüme orta yoğunluğunun resuspend.
      5. 2.1 bölümünden bir 35 mm tabak
    5. pipet 60 µL hMSCs süspansiyon üzerine 600 microcryogels monolayer çapında 400 µm. Hücreleri otomatik olarak gözenekli mikro-yapıların microcryogels absorbe.
    6. Oksijen odasında koru ve hücreleri eklemek izin vermek 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. Kuluçka 2 h sonra 2 mL kültür orta ekleyin. Orta 2 günde değiştirin. Kültür hMSCs yüklenen microcryogels 3D microtissues oluşturmak 2 gün.
      7. Kültür,
    7. sonra 2 gün iyi bir 96-şey plaka üzerinde başına 100 hMSCs yüklenen microcryogels pipet, üreticiye göre hazırlanan resazurin çalışma çözüm 120 µL eklemek ' s öğretim her kuyuya. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya Hücrelerin içinde bir uyarma ışık dalga boyu 560 nm ve emisyon ışık dalga boyu 590 ile Mikroplaka okuyucu tarafından metabolize resazurin
      1. Algıla Floresans nm. Cep numarasını floresan yoğunluğu gelecekteki deney seti protokolü 13 göre cep numarasından getirmek için hMSCs kullanarak Floresans vs standart bir eğri kurmak.
    8. HMSCs 0 günden microcryogels açıklandığı gibi 2.3.7 0 günden güne 4 adım resazurin kullanarak 4 gün içinde sayısını değerlendirmek.
    9. Leke microcryogels Calcein AM 1:500 seyreltme ve Propidium iyodür (canlı/ölü boyama olarak bilinen) 1:250 seyreltme fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde hücreleri ve floresan mikroskop veya confocal floresan mikroskop altında dikkat.
  4. 3D microtissues vivo içinde fare modeli CLI tedavisi için enjeksiyon
    1. kritik hindlimb iskemi kadın BALB/c çıplak fareleri bildirilen 11 , kurmak 3D microtissue tabanlı terapi tedavi edici etkisini belirlemek için 19.
    2. Microtissues adım 5 mL pipet bir hücre süzgeç kullanarak 2.3.6 aktarmak ve uzak kültür orta filtre.
    3. 100 microcryogels 100 µL çözüm başına yoğunluğu, % 15 jelatin çözümünde hMSCs yüklü 3D microtissues resuspend.
    4. Ameliyatından önceki otoklav tarafından cerrahi .aletleri sterilize ve bir hayvan tesisi merkezi bir hayvan ameliyathanede ameliyatı.
    5. % 1-3 isoflurane 1 L/dak Uygula eritromisin kurutma önlemek için fareyi göze akış hızında % 100 oksijen içeren anestezi indüksiyon odasına fareyi getirin. 1 cm uzunluğunda cilt kesi, femoral arter ve dalları ile 5-10 ipek dikiş ligate ve tüketim 19.
    6. Enjekte indocyanine yeşil (ICG) (100 µg/mL 0.1 mL) kuyruk ven yoluyla kan akışını izlemek için enjeksiyon. ICG Floresans görüntüleme bir floresan görüntüleme sistemi kullanarak gerçekleştirmek (burada, ev yapımı sistem) yansıma geometri 11.
    7. İntramüsküler gracilis kas 23'lik iğne ile 1 mL şırınga kullanarak artere kesi çevresinde üç siteleri içine microtissues enjekte.
    8. Ameliyattan sonra fare kurtarma kafes içinde ısıtmalı bir yastık ile sıcak tutmak. Subkutan Meloksikam ağrı gidermek ve sürekli uyanık kadar izlemek için enjekte.
    9. Sonra 28 gün, 11 Imaging Floresans tarafından 3D bacak microtissue tedavi tedavi edici etkinliği izlemek.
      Not: subkutan Meloksikam fare spontan ekstremite amputasyonu gösterdiğimde ağrı gidermek için enjekte.
    10. İle karbon dioksit deneylerin tamamlanmasından sonra Euthanize fareler.
      Not: Burada, ötenazi karbon dioksit ile gerçekleştirilen hayvan Etik Komitesi üzerinde merkezi Biyomedikal analizi, Tsinghua Üniversitesi tarafından onaylanmış kesin protokolüne göre.

3. Microtissue dizi çip uyuşturucu yüksek üretilen iş süzmek için Meclisi

  1. microcryogel dizinin üstünde-küçük parça hücre kültürü için derleme
    1. Değiştir Bölüm 1.1 geleneksel çok iyi plakası boyutları göre tasarımında Yani, 384-multi-da biçimi için tasarım bir dizi 16 × 24 Wells (satır sütununa göre), her biri 2 mm çap ve 4.5 mm Merkezden merkeze aralığı.
    2. Lazer basık bir 500 µm kalınlığında PMMA levha üzerine 1.1 bölümünde anlatıldığı gibi.
      3. 384-multi-da dizi çip elde edilen Bölüm 1.2 kullanımında açıklandığı gibi
    3. Fabricate microcryogels 3.1.2 adım. Bu microcryogel içeren dizi microcryogel dizi kozu olarak atanır.
    4. Microcryogel dizi chip yıkama 50 mL 0.1 M NaBH 4 ile uncross-bağlantılı herhangi bir kalıntı aldehid gidermek için, sonra art arda 3 kez, 2s için 50 mL deiyonize su ile her zaman durulayın.
    5. Su atın, adım 1.2.7 göre lyophilizing daha önce microcryogel dizi çip 4 ile 16 h için-20 ° C'de dondurmak.
    6. Adım 3.1.1 16 × 24 içerecek şekilde değiştir 384-multi-da dizi tasarım kuyuları, her biri 3 mm çapında ve 4.5 mm Merkezden merkeze aralığı.
    7. Destek bir tarafı bir ultra-ince (10 µm) Biyouyumlu çift taraflı yapışkan bant sayfasından kaldırmak ve bir parça 3 mm kalınlığında PMMA sayfanın bir tarafına yapıştırın. Lazer Tasarım Bölüm 1.1 göre bu 3 mm kalınlığında PMMA sayfaya 3.1.4. adımdaki basık. Bu dizi rezervuar dizi olarak atanır.
    8. Hizala microcryogel dizi chip rezervuar dizi çip ile ve birlikte uygun 3D microcryogel dizi küçük parça üstünde-küçük parça hücre kültürü için sıkı bir şekilde birleştirmek için. 1 h. için ultraviyole radyasyon tarafından sterilize
    9. Mağaza 3D microcryogel dizi cips daha fazla deneyler için oda sıcaklığında vakum.
  2. 3D microtissue diziler üzerinde uyuşturucu eleme
    1. ıslak bir kutu hücre kültürü için bir nem odası olarak hizmet için 25 mL steril de-iyonize su ile doldurunuz. Oksijen %5 ön ısı CO 2 kuluçka 37 ° c
    2. Hasat sigara küçük hücreli akciğer kanseri hücreleri (ncı-H460) ve Hepatosellüler karsinom hücrelerden (HepG2) doku kültürü plakaları standart protokolüne göre ve kültür medya 1.0 x 10 6 hücre/mL son yoğunluğunun yeniden askıya alma. İyice karıştırın.
      Not: RPM1640 %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ncı-H460 için kullanılır. Kullanmak DMEM %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin için HepG2.
    3. Kuluçka Gelişim makinesi nem odası kaldırın. Cımbız adım 3.1.9 nem odasında dikkatlice yere monte 3D microcryogel dizi çip için kullanın. Microcryogels odasında su ile ıslak değil dikkatli.
    4. Hücre süspansiyon karıştırın iyice, sonra aliquot 3 µL hücre süspansiyon doğrudan üzerine her kuyuya microcryogel.
      Not: Pipet ucu hafifçe hücre süspansiyon kovma önce microcryogel yüzeye dokunun. Otomatik yüklenen içine emme tarafından microcryogel hücrelerdir. Hücrelerin periferik Wells tohum değil.
    5. Ekleyin 10 μL medya hücreleri çok kanallı pipet, 96-kanal sıvı işleyicisi gibi kullanarak microcryogel içine seribaşı sonra her şey için. Orta da periferik wells eklenir.
      Not: Kullanım RPM1640 medya ile %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomycin H460 hücreler için. DMEM medya HepaG2 hücreler için %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin kullanın.
    6. Kültür microcryogel hücre dolu dizi chip için oksijen %5 24 h nem odasında CO 2 kuluçka formu 3D microtissue diziye 37 ° C'de.
    7. Erime doksorubisin ve IMMLG-8439 9 Dimetil sülfoksit (DMSO 10 mM hisse senedi bir çözüm oluşturmak için). Kültür 2 10 kat seyreltme konsantrasyon degrade oluşturmak için orta ilaçlarla sulandırmak için 200 µM nM.
    8. Ekleyin 10 µL uyuşturucu çözümleri her şey. (Orta seyreltilmiş) % 0,1 DMSO denetimi olarak kullanın. Oksijen %5 uyuşturucu dolu 3D microtissue dizide kuluçkaya CO 2 kuluçka 37 ° C'de 24 h için
    9. Eklemek 4 µL resazurin hisse senedi çözüm her şey için. 2 h. yer 3D microtissue dizide Mikroplaka okuyucu için 37 ° C'de kuluçkaya ve hücrelerin uyarma ışık dalga boyu 560 nm ve emisyon ışık dalga boyu 590 adlı tarafından metabolize resazurin floresan algılamak nm.
    10. Resazurin temel sinyal daha fazla veri işleme önce bütün kuyulardan çıkarma. Floresan sinyallerini kontrol wells ortalama Floresans sinyalinin tarafından bölünmesi ile hücre canlılığı kesir her iyi hesaplamak.
    11. Doz-yanıt eğrisi içinde çizim yazılımı temel 10 logaritmasını uyuşturucu konsantrasyon olarak x ekseni ve y ekseni olarak hücre canlılığı kesir ile çizmek. % 50 inhibisyon konsantrasyonu (IC50) 0,5 hücre canlılığı kesir katmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microcryogels 3D microtissue oluşumu için malzemelerin ve üretim.

Bu protokole göre microcryogels microcryogel diziler ve bireysel microcryogels veya form 3D microtissues fabrikasyon ve rejeneratif terapi ve ilaç (şekil 1) tarama, sırasıyla uygulandı. Microstencil dizi cips PMMA fabrikasyon olarak micromolds microcryogel dizi patates kızartması için uygulandı. Değişken geometrik tas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rejeneratif tıp ve vitro ilaç tarama için doku Mühendisliği5,6,7,8,9için iki önemli uygulamalar modellerdir. Bu iki uygulama büyük ölçüde farklı ihtiyaçları varken, bunların arasında ortak bir zemin hücre fonksiyonları19geliştirmek için koşulu kültür bir daha fazla biomimetic için ihtiyaç yatıyor. Yalnızca gelişmiş hücre fonksi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser mali Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından desteklenmiştir (hibe: 81522022, 51461165302). Yazarlar tüm Du laboratuvar üyeler genel yardım için kabul etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
JelatinsigmaG7041Diğer tüm reaktifler, aksi belirtilmedikçe Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO) satın alındı.
Gluteraldehit J& K902042Malzemenin hazırlanmasında çapraz bağlayıcı olarak kullanılır.
Cam kapak kayması, (24 x 50 mm)CITOGLASS, Çin10212450CPrcursor solüsyonunu mikroşablon dizi çipleri üzerine kazımak için.
Sodyum  borohidrür, NaBH4Beijing Chemical Works116-8Jelleşmeden sonra kalan glutaraldehiti yıkamak için.
Vakumlu kavanozasperts, ÇinVC8130Mikrojelleri vakum altında korumak için.
Polimetilmetakrilat (PMMA) levhalar Sunjin Electronics Co., Ltd, ÇinSıradan PMMA levhaları.
Rayjet lazer sistemiRayjet, AvustralyaRayjet 50 C30Kuyular oluşturmak için PMMA levhalarını kazımak için.
Plazma TemizleyiciMycro Technologies, ABDPDC-32GPMMA'yı hipofilik yapmak için.
LiyofilizatörBoyikang, ÇinSC21CLMalzemeleri liyofilize etmek için.
Tripan Mavisi çözeltisi (% 0.4)Zhongkekeao, ÇinDA0065Mikrojelleri boyamak için.
Doksorubisin hidroklorürENERJİ KİMYASAL, ÇinA01E08013600102D veya 3D mikrojelde hücrelerin ilaç direncini test etmek için.
Canlı/ölü tahlilDojindo Moleküler Teknolojiler (Kumamoto, Japonya)CS01-10Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için.
Hücre Titresi-MaviPromega (Wisconsin, ABD).G8080Hücre canlılığını test etmek için.
Hücre süzgeciBD Biosciences, ABD352360Mikrojelleri toplamak için.
D-LuciferinSYNCHEM (Almanya)s039Hücreleri yapıştırmak için.
Taramalı elektron mikroskobuFEI, ABDQuanta 200Mikrojel morfolojisini karakterize etmek için.
  Mekanik test cihazıBose, ABD3230Mekanik özellikleri ölçmek için.
Programlanabilir şırınga pompası World Precision Instruments, ABDALADINI 1000Boşalmayı test etmek için.
Dijital kuvvet ölçerHBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., ÇinH-50 Boşalmayı test etmek için.
Etilen oksit sterilizasyon sistemiAnprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NCAN74iMikrojelleri etilen oksit gazı ile sterilize etmek için.
Mikroplaka okuyucuMoleküler Cihazlar, ABDM5Mikro dizide floresan yoğunluğunu ölçmek için.
Konfokal mikroskopNikon, JaponyaA1RsiHücre dağılımını 3D olarak gözlemlemek için.
Ksenojen  Lumina II görüntüleme sistemiCaliper Life Sciences, ABDIVISHayvanlarda hücreyi izlemek için.
Sıvı çalışma durumuKayısı tasarımı, ABDS-pipetOrta veya hücre süspansiyonunu yüksek hacimli yüklemek için.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179(2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141(2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581(2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056(2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D MicrotissuesMicrocryogel FabricationInjectable Regenerative TherapyHigh throughput Drug ScreeningCryogelation TechnologyGelatin MicrocryogelsCell loaded CarriersOn chip AssemblyMouse Limb IschemiaResazurin Assay

Related Articles