Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

HİPSC'lerin kullanımı, çeşitli hastalıkların uyuşturucu taraması ve mekanik çalışmaları için yeni bir stratejiyi temsil etmektedir. Rejeneratif bir perspektiften hiPSC'ler, eklem kıkırdağı ^{1 , 2} gibi sınırlı iyileştirme kabiliyetine sahip hasarlı dokuların değiştirilmesi için potansiyel bir kaynaktır.

Doğal eklem kıkırdağının rejenerasyonu birkaç on yıl için zor olmuştur. Artiküler kıkırdak, yumuşak beyaz bir dokudur ve kemiklerin ucunu sürtünmeden korur. Bununla birlikte, zarar gördüğünde kendini yenilemek neredeyse imkansız kılan sınırlı rejeneratif kabiliyete sahiptir. Bu nedenle, kıkırdak yenilenmesine odaklanan araştırma, onlarca yıldır devam etmektedir.

Daha önce, in vitro olarak kondrojenik soya diferansiyasyon, genellikle diz eklemi 3'ten izole edilen BMSC'ler veya doğal kondrositler ile gerçekleştirildi. BitmişKondrojenik potansiyelleri, BMSC'ler ve doğal kondrositler, kondrojenezde kullanımlarını destekleyen çok sayıda avantaja sahiptir. Bununla birlikte, sınırlı genişleme ve kararsız fenotip yüzünden, bu hücreler eklem kıkırdak defekti rekonstrüksiyonu konusunda çeşitli sınırlamalarla karşı karşıya kalmaktadır. In vitro kültür koşulları altında, bu hücreler 3-4 geçitten sonra kendi özelliklerini kaybetme eğilimindedir ve bu da sonuçta onların farklılaşma yeteneklerini etkiler ⁴ . Ayrıca, doğal kondrositler durumunda, bu hücreleri elde ederken diz ekleminde ek hasar kaçınılmazdır.

BMSC'lerin veya doğal kondrositlerden farklı olarak, hiPSC'ler in vitro olarak sınırsız olarak genişleyebilir. Uygun kültür koşullarıyla, hiPSC'lerin kondrojenik farklılaşma için yedek bir kaynak olarak büyük potansiyeli vardır. Bununla birlikte, hiPSC'lerin içsel özelliklerini değiştirmek zordur ⁵ . Dahası, birkaç karmaşık in vitro süreç gerektirirPs hiPSCs'in kaderini belirli bir hücre türüne yönlendirmek için. Bu komplikasyonlara rağmen, yüksek kendiliğinden yenilenme kabiliyetleri ve kondrositleri de içeren hedeflenen hücrelere ayırma kapasiteleri nedeniyle hiPSC'lerin kullanımı hala önerilmektedir.

Kondrojenik farklılaşma, genellikle MSC benzeri progenitör hücreler kullanılarak pelet kültürü veya mikromüzk kültürü gibi üç boyutlu kültür sistemleri ile yapılır. HiPSC kullanıyorsa, MSC benzeri öncü hücreler üretmek için protokol mevcut protokollerden farklıdır. Bazı gruplar, fenotipi doğrudan MSC benzeri hücrelere dönüştürmek için hiPSC'lerin tek katmanlı kültürü kullanır ⁷ . Ancak, çoğu çalışma MSC ^{8 , 9 , 10 , 11'e} benzeyen hücre büyümesi üretmek için EB'ler kullanır.

Kondrojayı indüklemek için çeşitli büyüme faktörleri kullanılır.Nesis. Genellikle, BMP ve TGFβ ailesi proteinleri tek başına veya kombinasyon halinde kullanılır. Farklılaşma, GDF5, FGF2 ve IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} gibi diğer faktörlerle de indüklenmiştir. TGFβ1'in MSC ^16'da doza bağımlı bir tarzda kondrojenez uyarısı yaptığı gösterilmiştir. Diğer izotip ile karşılaştırıldığında, TGFβ3, TGFβ1, kıkırdak öncesi mezenşimal hücre yoğunlaşmasını arttırarak kondrojeneze neden olur. TGFβ3, mezenkimal hücre çoğalmasını önemli ölçüde arttırarak kondrojeneze neden olur17. Bununla birlikte, TGFβ3 araştırmacılar tarafından TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19'dan} daha sık kullanılır. BMP2, insan kondrojenik matris bileşenleri ile ilgili genlerin ekspresyonunu arttırırEklem kondrositlerinde in vitro koşullar altında ²⁰ . BMP2, TGFβ proteinleri ²¹ ile kombinasyon halinde MSC'lerde kıkırdak oluşumu için kritik olan genlerin ekspresyonunu arttırır. Ayrıca, BMP2'nin Smad ve MAPK yolakları yoluyla TGFβ3'ün etkisini sinerjik olarak arttırdığı gösterilmiştir ²² .

Bu çalışmada CBMC-hiPSC'ler düşük ekli bir Petri kabında EB ortamı kullanılarak EB'lere toplandı. Gelişen hücreler, EB'leri jelatin kaplı bir çanağa tutturarak indüklenmiştir. Hücreleri kullanarak kondrojenik farklılaşma pelet kültürü ile gerçekleştirildi. Hem BMP2 hem de TGFβ3 ile yapılan muamele, hücreleri yoğun bir şekilde yoğunlaştırdı ve kondrojenik pelet oluşumu için hücre dışı matris (ECM) protein birikimine yol açtı. Bu çalışma, CBMC-hiPSC'leri kullanarak basit fakat etkin kondrojenik bir farklılaşma protokolünü önermektedir.

Bu protokol, Katolik Üniversitesi'nin kurumsal gözden geçirme kurulu (KC12TISI0861) tarafından onaylandı. Yeniden programlama için kullanılan CBMC'ler doğrudan Seul St. Mary Hastanesi Kordon Kan Bankası'ndan alındı.

1. iPSC'lerden kondrojenik türev

1. CBMC-iPSC üretimi
   1. Önceki çalışmamızda gösterilen protokolü kullanarak CBMC-hiPSC'ler üretin ²³ .
   2. 15 mL konik tüp içinde kan hücrelerini toplayın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
   3. 3 x 10 ⁵ hücre hazırlayın ve 515 xg ve RT'de 5 dakika süreyle santrifüjleyin. Süpernatantı emilerek boşaltın ve hücreleri 0.5 mL kan hücresi ortamında tekrar süspanse edin.
   4. Hücreleri, kaplanmamış 24 delikli bir tabakın bir çukuruna aktarın ve üreticinin tavsiyelerine göre Sendai virüs karışımını ilave edin.
   5. Plakayı 1150 xg ve 30 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
   6. kıçtaEr santrifüjleme, hücreleri gece boyunca (O / N) 37 ° C'de% 5 C02'de inkübe edin.
   7. Ertesi gün, transduced hücreleri bir matris kaplı kuyuya aktarın. 30 ° C'de 1150 xg'de plakayı santrifüjleyin.
   8. Santrifüjden sonra, süpernatantı çıkarın, 1 mL iPSC ortamı ilave edin ve% 5 CO _2'de 37 ° C'de hücre O / N'yi muhafaza edin.
   9. Ekli hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO _2'de muhafaza edin. Ortamı günlük olarak değiştirin, onu yeni iPSC ortamı ile değiştirin.
      NOT: Koloniler, transdüksiyon sonrası 14-21. Günde ortaya çıkacaktır.
2. EB üretimi
   1. HiPSC'leri 37 ° C'de ve% 5 CO _2'de muhafaza edin. Ortamı günlük olarak değiştirin ve onu yeni Temel 8 (E8) orta ile değiştirin.
   2. E8 ortamında, vitronektin kaplı, 100 mm'lik bir çanakta 2 x 10 ⁶ hiPSC hazırlayın.
   3. Kültür çanak E8 orta çıkarın ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
   4. 1 ekleML 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile inkübe edin ve 37 ° C'de ve% 5 C02'de 2 dakika inkübe edin.
   5. Hücreleri 3 mL E8 ortamı ile hasat edin ve yeni bir 15 mL konik tüp aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 250 xg'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
   6. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin ve hücreleri 5 mL E8 ortamında tekrar süspansiyon haline getirin.
   7. Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın ve her 100 mm Petri kabı için 2 x 10 ⁶ hücre hazırlayın. Hazırlanan hücreleri 10 uM ko-ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü ile E8 ve EB ortamı (1: 1) içeren 10 mL'lik bir karışımda tekrar süspanse edin.
   8. 37 ° C'de ve% 5 C02'de agregasyon için hücreleri O / N inkübe edin.
   9. Ertesi gün, pipetleme yapılarak toplu EB'leri toplayın. Hücreleri 250 xg'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve 10 mL taze E8 ortamı içinde EB'leri tekrar süspanse edin.
   10. Oluşturulan EB'leri 5 gün boyunca büyütün, fres ile günlük değişiklikler yapınH E8 orta. Daha fazla olgunlaşma için, kültür ortamını E7 ortamına değiştirin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 5 gün boyunca EB'leri muhafaza edin, taze E7 ortamıyla günlük orta değişimler yapın.
       NOT: E7 orta FGF2 içermeyen E8 ortamıdır.
3. EB'lerden büyümekte olan hücre indüksiyonu
   1. 100 mm'lik bir tabağa 6 ml% 1 jelatin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO _2'de inkübe edin.
   2. Jelatı alın ve kullanmadan önce 2-3 saat boyunca tamamen kurutun.
   3. EB'leri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. EB'lerin konik borunun altına yerleşmesine izin verin. EB'leri rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın.
   4. EB'leri 10 mL Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile tekrar süspanse edin. EB'leri jelatin kaplı 100 mm'lik tabağa aktarın. 10 uM ROCK inhibitörü ekleyin.
   5. 37 ° C'de ve% 5 C02'de 7 gün boyunca hücreleri inkübe edin ve muhafaza edin. Temayı değiştirDiok her gün ROCK inhibitörü eklemeden.
4. Kondrojenik pelet oluşumu
   1. Çanak kültür ortamı aspire ve PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
   2. 1 ml 1 mM EDTA uygulayın ve 37 ° C'de inkübe edin ve 2 dakika süreyle% 5 CO ₂ .
   3. % 20 FBS ile 5 mL DMEM kullanarak hücreleri hasat edin ve yeni bir 15 mL konik tüp aktarın.
   4. Hücreleri 250 xg ve RT'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve% 20 FBS ile 10 mL DMEM içinde pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
   5. 40 μm hücre süzgeç kullanarak filtre ve hücre kümeleri atın ve tek hücreleri hasat. Hemocytometer kullanarak tekli hücreleri sayın.
   6. Hücreleri 250 xg ve RT'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve her pelet için 3 x 10 ⁵ hücre 300 mL'lik kondrojenik diferansiyasyon ortamı (CDM) ile 15 mL'lik konik bir tüp içine alın.
   7. Pelet oluşumu için, hücreleri 5 dakika süreyle santrifüjleyin.680 xg ve RT.
      NOT: Peletler, kondrojenik pelletlerin farklılaşması sırasında 15 mL konik tüplerde muhafaza edilir.
   8. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
   9. CDM'yi 2-3 günde bir değiştirin. Peletler 3 gün içinde düzleştirilmiş sfero morfolojileri sergileyecektir. Pelletleri, 37 ° C'de ve% 5 C02'de 21 gün boyunca muhafaza edin.

2. Boyama ile Kondrojenik Pellet Karakterizasyonu

1. Kondrojenik gömme
   1. Gömülmeden önce, 58 ° C'de parafin hazırlayın ve eritin.
   2. 1,5 mL'lik bir tüpte oda sıcaklığında 2 saat boyunca 1 mL'lik% 4'lük paraformaldehit içinde topakları düzeltin.
      Dikkat: Paraformaldehit oldukça toksiktir. Göz, cilt veya müköz zarlarla temasından kaçının. Pozlamayı en aza indirin ve hazırlarken teneffüs etmeyi önleyin.
   3. Kasete bir kat tül yerleştirin ve sabit peletleri bir pipet yardımıyla aktarın. Topağı katlayarak örtün.E gazlı bez ve kaset kapağını kapatın.
   4. 100 mL% 70 etanol (EtOH) içinde iki kez, her biri 10 dakika dehidrasyon başlatın. Peletleri% 80 ve% 95 EtOH içinde sıralı 10 dakikalık yıkamalarla kurutun.
   5. Pelletleri 10 dakika boyunca% 100 EtOH'a aktarın. Taze EtOH ile üç kez tekrarlayın.
   6. "Temizleme" için, çözeltiyi 100 mL, 1: 1 EtOH ve ksilen karışımı, ardından her biri 10 dakika süreyle 1: 2 EtOH ve ksilen karışımı ile değiştirin. Kalan EtOH'yı, her biri 10 dakika süreyle% 100'lük ksilen içerisinde iki kez kuluçkalayarak temizleyin.
   7. Parafin infiltrasyonu için, peletleri sıralı ksilen ve parafin karışımlarında inkübe edin. Bütün parafin sızma işlemini 58 ° C'de gerçekleştirin. Pelletleri 100 mL, 2: 1 oranında ksilen ve parafin karışımı içinde 30 dakika inkübe edin.
   8. Çözeltiyi 100 mL 1: 1 ksilen ve parafin karışımıyla değiştirin ve 30 dakika inkübe edin.
   9. Çözeltiyi 100 mL 1: 2 ksilen ve parafin karışımıyla değiştirin ve 30 dak.
   10. Nihai sızma için, peletleri ilk% 100 parafin banyosuna aktarın ve 2 saat inkübe edin.
   11. Peletleri% 100 parafinin ikinci banyosuna aktarın ve O / N, 58 ° C'de inkübe edin.
   12. Ertesi gün, cımbız kullanarak pelletleri bir kalıba yavaşça aktarın. Parafin dağıtıcıdan kalıba parafin ekleyin. Parafin, 4 ° C'de 30 dakika süreyle katılaştınlır.
   13. Kesitleri 7 μm'de kesin ve kesitleri slaydın üzerine aktarın. Slaytların bir gece kurumasını bekleyin ve kullanıma hazır oluncaya dek slaytları oda sıcaklığında saklayın.
2. Slayt hazırlığı
   1. Slaytları, 100 mL,% 100,% 90,% 80 ve% 70 EtOH ile sırayla 5 dakika boyunca hareket ettirerek çözünmesini sağlayın.
   2. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 5 dakika boyunca durulayın.
3. Alcian blue lekesi
   1. Slaytları 30 dakika boyunca 50 mL% 1 alc blue solüsyonunda inkübe edin.
      DEĞİLE: Alcian blue,% 3 asetik asit solüsyonunda seyreltilir. Asetik asit kullanarak pH'ı 2.5'e ayarlayın.
   2. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 2 dakika boyunca durulayın.
   3. Slaytları deiyonize suda (DW) durulayın ve 2 dakika nükleer hızlı kırmızı solüsyonla kontrastlayın.
   4. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve 1 dakika musluk suyu ile durulayın.
   5. 2.3.5) Slaytları kurutun ve adımları 2.6'da takın.
4. Toluidin mavisi boyama
   1. Slaytları 4 dakika boyunca 50 mL tolüidin mavisi solüsyonunda inkübe edin.
   2. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 5 dakika boyunca durulayın.
   3. Adım 2.6'da sallamaları gidermek ve takmak için ilerleyin.
5. İmmunohistokimyasal boyama
   1. Slaytları, endojen peroksidaz blokajı için 15 dakika boyunca% 3 H202'de inkübe edin.
   2. Tris-bu ile 1: 100 oranında seyreltilmiş 200 uL birincil antikor uygulayın (anti-COL1A1 ve -COL2A1)Slaytlara% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 5 normal keçi serumu (TBS) içeren fferled salin (TBS) ve 4 ° C'de O / N inkübe edin.
   3. Ertesi gün, slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve her biri 5 dakika boyunca üç kez% 0.1 polisorbat 20 (TBST) içeren 50 mL TBS ile yıkayın.
   4. Slaytlara, 200 mcL sekonder antikor (keçi anti-tavşan IgG antikoru, 1: 200 oranında TBS içinde seyreltilmiş TBS ve% 5 NGS) uygulayın ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
   5. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve 50 mL, her biri 5 dakika ile üç kez yıkayın.
   6. Sinyal amplifikasyonu için, HRP-konjuge streptavidin solüsyonunu slaytlara uygulayın ve 10 dakika inkübe edin.
   7. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve 50 mL, her biri 5 dakika ile üç kez yıkayın.
   8. DAB-peroksidaz substrat solüsyonunu karıştırın, her slayta 200 μL solüsyon uygulayın ve 1 dakika inkübe edin.
   9. Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 5 dakika boyunca durulayın.
   10. Counterstain1 dakika boyunca Mayer'in hematoksilen ile.
   11. Slaytları DW ile yıkayın.
   12. Adım 2.6'da sallamaları gidermek ve takmak için ilerleyin.
6. Dehidrasyon ve montaj
   1. Slaytları 100 mL% 70,% 80,% 90 ve% 100 EtOH, 30 saniye boyunca sırayla hareket ettirerek suyunu alın.
   2. Slaytları her biri 1 dakika süreyle iki değişik ksilende daldırın.
   3. Lamelleri 50 mcL montaj solüsyonu ekleyin ve slaytlar üstüne koyun.

Bu çalışmada, EB'lerden büyümekte olan hücreleri indükleyerek CBMC-hiPSC'lerden kondrojenik peletler oluşturduk. Kondrojenik farklılaşma, doğrulanmış yüksek pluripotensiteli CBMC-hiPSC'ler kullanılarak indüklendi. Protokolümüzün basit bir şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir . Farklılaştırmadan önce, iPSC kolonileri genişletildi ( Şekil 1B ). Genişletilmiş iPSC'ler, farklılaşmayı başlatmak için EB'ler olarak toplandı ( Şekil 1C ). Oluşturulan EB'ler jelatin kaplı tabaklara ekim büyümesi hücrelerini uyarmak için tutturuldu ( Şekil 1D ). Daha sonra, büyümekte olan hücreler toplandı ve kondrojenik peletler oluşturmak için kullanıldı. 21 günlük farklılıktan sonra küçük boncuk benzeri kondrojenik peletler elde edildi ve daha ileri karakterizasyon için kullanıldı ( Şekil 1E ). İn vitro üretilen chonun kalitesiDrojeneik pelletler çeşitli deneylerle teyit edildi.

Gün 21'de kondrojenik pelletlerin kalitesini histolojik olarak değerlendirdik. Pozitif kontrol olarak BMSC kondrojenik peletler kullanıldı. Farklı kondrositler tarafından salgılanan ECM proteinlerinin birikimi, Şekil 2A'daki als mavisi ve toluidin mavisi boyaması ile teyit edildi. Lacuna ve proteoglikan üretimi gibi sağlıklı kıkırdağın temel özellikleri, farklılaşma süreci 21 gün boyunca devam ettikçe artmıştır. CBMC-hiPSC'lerden üretilen kondrojenik peletler, sağlıklı kıkırdakta ana ECM bileşeni olan COL2A1'yi ifade etmiştir ( Şekil 2B ). CBMC-hiPSC türevi pelletlerin COL2A1 ekspresyonu, BMSC türevi peletlerinkinden daha yüksekti. Fibrotik kıkırdak için bir markör olan tip I kollajeninin ekspresyonu, COL2A1'in ekspresyonuna kıyasla CBMC-hiPSC'den türetilmiş pelletlerde düşüktür.

Gün-21 kondrojenik pelletlerde kıkırdak ECM proteinlerinin gen ifadesi, gerçek zamanlı PCR ile teyit edildi. CBMC-hiPSC türevi pelletlerin aggrecan (ACAN) ekspresyonu, BMSC türevi pelletlerin agrega (ACAN) ifadesine benzerdi ( Şekil 3A ). COL2A1 ifadesi, CBMC-hiPSC türevi peletlerde ( Şekil 3B ) önemli derecede yüksekti. Cinsiyet belirleyici bölge Y-box 9'un (Sox9), bir kondrojenik progenitör belirteçinin ekspresyonu da değerlendirildi. CBMC-hiPSClerden üretilen peletler yüksek düzeyde Sox9 ifade etmiştir ( Şekil 3C ). Bu genlerin CBMC-hiPSC kondrojenik topaklarda 21. günde BMSC kontrol topaklarla karşılaştırıldığında belirgin şekilde yukarı doğru düzenlendiğini teyit ettik. Bir hipertrofik markör COL1A1'in ekspresyonu değerlendirildi ( Şekil 3D ). CBMC-hiPSC türevi pelletlerde COL1A1 ifadesi, BMSC-deri'ye kıyasla azaldıVed topakları. Farklılaşma etkinliği, COL2A1'in COL1A1'e oranı ile analiz edildi ( Şekil 3E ). CBMC-hiPSC türevi pelletlerde oran artışı, COL1A1'e kıyasla COL2A1'in nispeten yüksek ekspresyonunu ortaya koymuştur. Sonuç olarak, CBMC-hiPSC'lerin kondrojenik farklılaşma kapasitesini teyit ettik. Üretilen CBMC-hiPSC türevi kondrojen peletlerin kalitesi, BMSC'lerin kalitesiyle uyumlu bir kaliteye sahiptir.

Şekil 1: hiPSC'lerin kondrojenik farklılaşması. ( A ) hiPSC'lerden kondrojenik pelet üretimi şeması. ( B ) Oluşturulan CBMC-hiPSC'nin morfolojisi. ( C ) oluşturulan EBs Morfolojisi. ( D ) Jelatin kaplı bir kültür tabakına tutturulmuş EB'lerden türetilen gelişme hücreleri. ( E ) t Görüntüsü 21 günlük farklılaşmadan sonra kondrojenik pelet. Aralıkların birimleri milimetre olarak gösterilir. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Kondrojenik pelletin histolojik analizi. ( A ) Güneş 21'de kondrojenik peletlerin histolojik değerlendirmesi, alian mavi ve toluidin mavi boyama. ( B ) COL1A1 ve COL2A1 antikorları ile boyanan kondrojenik peletlerin immünohistokimyasal görüntüsü. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

1" >
Şekil 3: Kondrojenik pelletin gen ekspresyonu. ( A ) ACAN'ın göreceli gen ifadesi. ( B ) COL2A1'in göreceli gen ifadesi. ( C ) SOX9'un göreceli gen ifadesi. ( D ) COL1A1'in göreceli gen ifadesi. ( E ) COL1A1'in gen ekspresyonu. ( F ) COL10A1'in gen ekspresyonu. ( G ) COL2A1: COL1A1 gen ifadesinin oranı. Peletler toplandı ve 21 gün farklılaştıktan sonra analiz edildi. Veriler, gerçek zamanlı PCR kullanılarak elde edildi ve numune başına üçlü deneylerin ortalama standart hatası olarak gösterildi (n = 3). Gen ifadesi bir iç kontrol olarak GAPDH'ye normalize edildi. (* P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).K "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

	Hücre numarası	Gelişen hücre verimi	Topak verimi
hiPSCs	2 x 10 6	2-5 x 10 7	70-150
MSC	2 x 10 6	-	6

Tablo 1: MSC ve hiPSC'lerin verim karşılaştırması.

Hedef Adı	yön	Primer Dizisi	Boyut
	ileri	TTCCGCGACGTGGACAT	77 bp
Ters	TCAAACTCGTTGACATCGAAGGT
ACAN	ileri	AGCCTGCGCTCCAATGACT	107 bp
Ters	TAATGGAACACGATGCCTTTCA
COL2A1	ileri	GGCAATAGCAGGTTCACGTACA	79 bp
Ters	CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA
COL1A1	ileri	CCCCTGGAAAGAATGGAGATG	148 bp
Ters	TCCAAACCACTGAAACCTCTG

Tablo 2: Gerçek zamanlı PCR'de kondrojenik belirteçlere karşı primerler dizileri.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.