Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama
Bu makalede
Özet
Özet
Eksik chimerism varlığı kemik iliği nakli için büyük talasemi veya orak hücre hastalığı hastaların büyük bir kısmı belirtilmektedir. Sonraki terapötik immunomodulation stratejileri-ebilmek geliştirmek klinik sonuç olarak bu gözlem çok büyük etkileri vardır. Geleneksel, Polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analizini kısa tandem tekrarlar donör kaynaklı kan hücrelerinde chimerism tanımlamak için kullanılır. Ancak, bu yöntem çekirdekli hücrelere sınırlıdır ve Disosiye tek hücreli soy arasında ayrım yapamaz. Biz kısa tandem tekrarlar akış sitometrik sıralanmış hematopoetik progenitör hücre analizi uygulanmış ve bu seçili veri bloğu oluşturan biriminden - erythroid koloniler, elde edilen kısa tandem tekrarlar hem kemik toplanan analizi ile karşılaştırıldığında kemik iliği. Bu yöntem ile farklı yayılması ve donör hücreleri erythroid yerde farklılaşma göstermek edebiliyoruz. Bu teknik chimerism ayarlama kök hücre nakli yapılan geçerli izleme tamamlamak uygundur ve böylece uygulanan gelecekte klinik çalışmalar, kök hücre araştırma ve tasarım gen terapisi denemelerin olabilir.
Giriş
Allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) olduğunu aksi takdirde son derece tehlikeye için hastalıksız sağkalım oranları daha--dan %90 ulaşmak, hematopoetik sistem doğuştan genetik bozukluklar çeşitli için yalnızca kullanılabilir şifalı yaklaşım ve hayat-sınırlı hastalar1. Bu önemli tedavi aracı etkinliği öncesi toksisite sınırlayarak optimize edilmiştir- ve sonrası rejimleri2nakli, ama aynı zamanda kararlı greft işlevi sürdürülmesi hedef alan müdahaleler tarafından hangi sayısal yakın izleme tarafından donör kaynaklı hücreler3,4,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. yalıtım, hematopoetik kemik iliği hücreleri çok parametreli Floresans aktif hücre sıralama tarafından
- işlemi başlamadan önce
- örnek boyama, aşağıdaki öğeler gerekir tahsil edilecek ve hazır:
- (GM), 50 mL konik tüpler degrade medya mononükleer hazırlanması için hücreleri
- boyama için 12 x 75 mm akış tüpler hücreleri
- Staining arabellek: fosfat tamponlu tuz (PBS) + % 3 fetal buzağı serum (FCS)
- Pipetler < / l Ben >
- FC blok ve antikor (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences) boyama. Bu fluorochrome birlikte diğer kanallar içine ihmal edilebilir yayılma yoktur ancak diğer uygun fluorochrome k....
- örnek boyama, aşağıdaki öğeler gerekir tahsil edilecek ve hazır:
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hücre FACS sıralama tarafından lymphohematopoietic ataları ayrılması
Burada aşağı akım STR analiz için gerekli hücre popülasyonlarının sıralama sonuçlar gösterilmektedir. Kemik iliği hücreleri V450 Birleşik anti-CD45 FITC Birleşik anti-CD36 ve APC Birleşik anti-CD34 ile lekeli. Faiz nüfusu megakaryocyte erythroid parçalanmayabilir ataları (MEP), hücreleri eritrositler gelişimi için sorumlu olduğunu. Bu hücreler .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çalışmada amacı HKHT hastalarda takip erythroid ataları donör/alıcı chimerism analiz Hemoglobinopati için tedavi için seyirci iki yaklaşımın bir arada sunmaktır: 1.) floresan aktif hücre sıralama hematopoetik progenitör hücrelerin kemik iliği örneklerinde kısa tandem tekrarlar ve 2 analizi tarafından takip.) Koloni oluşturan birim büyüyen kemik iliği hücrelerinin atası çeşitli kolonilerde sınıflandırılması takip kısa tandem tekrar analiz tarafından. Bu yaklaşım yenilik donör/alıcı chimerism bireysel sömürgelerinde değerl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Sağlık | GE17-1440-02 | RBC'yi kaldır |
| 50 mL konik tüpler | Falcon | 14-432-22 | Numune hazırlama |
| 12 x 75 mm akış tüpleri | Falcon | 352002 | FACS ayırma |
| Fosfat tamponlu salin | Gibco | 10010023 | |
| PBS Fetal buzağı serumu | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (ısıyla etkisizleştirilmiş) |
| CD34 APC | BD Biyobilim | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Biyobilim | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Biyobilim | 642275 | FACS-Ab |
| Tripan mavisi | Gibco | 15250061 | |
| Hemositometre | Invitrogen Inc. | C10227 | Otomatik hücre sayma |
| Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi | Gibco | 14025092 | FACS analizinde süspansiyon tamponu |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Süspansiyon tamponunun bileşeni |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Blok FCR FACS |
| Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sıralayıcı |
| Rekombinant ve nbsp; insan eritropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| İzocağı' s Modifiye Dulbecco' s Orta | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-081 | Kültür Ortamının Bileşeni |
| CD34 + manyetik boncuklar | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34 + saflaştırma |
| Rekombinant ve nbsp; insan G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Testi |
| Rekombinant ve nbsp; insan SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Testi |
| Rekombinant insan GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Tahlil |
| Rekombinant insan IL-3 | BD Biyobilim | 554604 | CFU-Test |
| Rekombinant insan IL-6 | BD Biyobilim | 550071 | CFU-Test |
| Metokült H4434 Orta | Kök Hücre Teknolojileri | 4444 | CFU-Test |
| QiAmp DNA Kan çıkarma kiti | Qiagen | 51306 | DNA İzolasyonu |
| Nanodrop ND-1000 spektrum fotometre | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Miktar Tayini |
| DNAaz içermeyen H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Hazırlama |
| AmplTaq Altın DNA Polimeraz | Uygulamalı Biyobilim | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradyanı | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Uygulamalı Biyobilim | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Boyut Standardı | Uygulamalı Biyobilim | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetik Analiz | Cihazı Uygulamalı Biyobilim | 313001R | PCR |
Kaynaklar
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
