Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Özet

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Özet

RNA bağlayıcı proteinler (RBPler) RNA'ların kaderini belirler. Bütün RNA biyogenez yollarına katılırlar ve özellikle haberci RNA'ların (mRNA'lar) post-transkripsiyonel gen regülasyonuna (PTGR) katkıda bulunurlar. Son birkaç yılda, maya ve memeli hücresi soylarından elde edilen bir dizi mRNA'ya bağlı proteom, "mRNA etkileşimli yakalama" adı verilen ve mRNA'ya bağlanan proteinlerin (mRBP'lerin) tanımlanmasına izin veren yeni bir yöntem kullanılarak başarıyla izole edilmiştir. Doğrudan bir fizyolojik ortamdan. Yöntem in vivo ultraviyole (UV) çapraz bağlama, oligon (dT) boncuklar ile haberci ribonükleoprotein komplekslerinin (mRNPs) aşağı çekilmesi ve saflaştırılması ve ardından kütle spektrometresi (MS) ile çapraz bağlanmış proteinlerin tanımlanmasından oluşur. Çok yakın bir tarihte, aynı yöntemi uygulayarak, çeşitli Arabidopsis doku kaynaklarına eşzamanlı olarak birkaç bitki mRNA'ya bağlı proteom rapor edilmiştir: etiyole edilmiş fideler, yaprak dokusu,Yaprak mezofil protoplastları ve kültür kökü hücreleri. Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları için optimize edilmiş mRNA etkileşimli yakalama yöntemini sunuyoruz. Bu hücre türü, çeşitli hücresel tahliller içeren deneyler için çok yönlü bir araç olarak hizmet etmektedir. Optimum protein verimi için koşullar, başlangıç ​​dokusu miktarını ve UV ışınlama süresini içerir. Orta ölçekli bir deneyden (10 ⁷ hücre) elde edilen mRNA'ya bağlı proteomda, RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu kaydedilen RBP'lerin aşırı temsil edildiği bulundu ve birçok yeni RBP tespit edildi. Deney ölçeklenebilir (10 ⁹ hücre) ve optimize yöntem, bitkilerdeki mRNA bağlı proteomları geniş ölçüde izole etmek, kataloglamak ve karşılaştırmak için diğer bitki hücre tiplerine ve türüne uygulanabilir.

Giriş

Ökaryotlar, hücresel biyolojik süreçleri korumak için çoklu RNA biyogenez düzenleyici yollarını kullanır. Bilinen RNA türleri arasında mRNA çok çeşitlidir ve proteinlerin ve izoformlarının kodlama kapasitesini taşır ^1. PTGR yolu, pre-mRNA'ların ^{2 , 3'ün} kaderini yönlendirir. Farklı gen ailelerinden RBP'ler RNA regülasyonunu kontrol eder ve PTGR'da spesifik mRBPler mRNA'ları doğrudan fiziksel etkileşimler yoluyla yönlendirerek fonksiyonel mRNA'ları oluştururlar. Bu nedenle, tanımlanması ve mRBPs karakterize ve mRNPs son üç yıl .Over hücresel mRNA metabolizması ² düzenleme anlamak için kritiktir, çeşitli in vitro yöntemler - RNA elektroforetik mobilite kayma (Remsa) analizleri, üstel zenginleştirme deneyleri ile ligandların sistematik evrimi dahil olmak üzere (SELEX), kütüphane türevli yapılara, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radyoaktif işaretlenmiş veya nicelikselFloresan RNA bağlama deneyleri, X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} - esas olarak memeli hücrelerinden RBP çalışmalarına uygulanmıştır. Bu memeli RBP çalışmalarının sonuçları, yayınlanmış gözlemleri toplayan RNA-bağlayıcı Protein Veri Tabanı (RBPDB) vasıtasıyla aranabilir ( ¹⁰⁾ .

Bu in vitro yaklaşımlar güçlü araçlar olmasına rağmen, belirli bir RNA dizisi havuzundan bağlı RNA motiflerini belirler ve bu nedenle yeni hedef RNA'ları keşfetme yetenekleri sınırlıdır. Aynı şey, protein dizisinin ve yapısının ¹⁵ korunmasına dayanan genom çapında RBP'leri öngörmek için hesaplama stratejileri için de geçerlidir. Bunun üstesinden gelmek için, yeni bir deneysel yöntem haBir RBP'nin etkileşime girdiği RNA motiflerinin tanımlanmasına ve bağlanmanın tam yerinin belirlenmesine izin veren bir dizi kurulmuştur. "Çapraz bağlama ve immüno çökeltme" (CLIP) adı verilen bu yöntem, in vivo UV çapraz bağlanma ve ardından immüno çökeltme ^{11'den oluşur} . Erken yapılan çalışmalar, DNA ve RNA nükleotidlerinin fotoaktifleşmesinin, 245 nm'den daha yüksek uyaran UV dalga boylarında oluşabileceğini göstermiştir. ^12: timidin ile reaksiyonu (dT ≥ dC> rU> Re, dA, dG azalma photoreactivity sırasına göre sıralama) tercih görünüyor. 254 nm dalga boyunda (UV-C) UV ışığı kullanarak RNA nükleotidleri ve protein kalıntıları arasındaki kovalent bağların sadece birkaç Angstrom (Å) aralığında oluştuğu gözlemlendi. Dolayısıyla fenomen, RNA ve RBP'nin "sıfır uzunluklu" çapraz bağlanması olarak adlandırılır. Bunu takiben katı bir arındırma işlemi izlenebilir Az arka planla dür ^{13 , 14} .

CLIP'i tamamlayan bir strateji, RBP'lerin manzarasını tanımlamak için protein tanımlaması ile in vivo UV çapraz bağlamayı birleştirmektir. "MRNA etkileşimli yakalama" adı verilen bu yeni deneysel yaklaşımı kullanarak maya hücrelerinden, embriyonik kök hücrelerden (ESC'ler) ve insan hücre çizgilerinden ( örn., HEK293 ve HeLa) izole edilmiş bu tür genom çapında mRNA'ya bağlı proteomlar ^{18 , 19 , 20 , 21} . Yöntem in vivo UV çapraz bağlanma, ardından mRNP saflaştırması ve MS tabanlı proteomiklerden oluşur. Bu stratejiyi uygulayarak, kanonik olmayan RBD'ler içeren birçok yeni "ay ışığı alan" RBP keşfedildi ve daha fazla proteininin önceden tahmin edildiğinden daha fazla RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu netleşti."> 15 ^{, 16 , 17.} Bu yöntemin kullanılması yeni başvurulara ve RBP'leri araştırırken yeni biyolojik soruları cevaplama yeteneğine izin verir Örneğin son zamanlarda yapılan bir araştırma mRNA'ya bağlı proteomun (ana RBP) korunmasını araştırmıştır Proteom) maya ve insan hücreleri arasında ²² .

Bitki RBP'leri, büyümede ve gelişmede ( örneğin , çiçeklenme zamanının transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde, sirkadyere ait saatte ve mitokondriyum ve kloroplastlarda gen ifadesi gibi) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} . Dahası, abiyotik streslere ( örn. Soğuk, kuraklık, sönümlenme) yanıt veren hücresel süreçlerde işlevleri yerine getirdiği düşünülmektedirLinity ve absisik asit (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34'tür} . Arabidopsis thaliana genomunda RNA tanıma motifi (RRM) ve K homoloji (KH) alan dizisi motiflerine dayanan 200'den fazla tahmini RBP geni vardır; Pirinçte yaklaşık 250, ^{35 , 36} olarak kaydedildi. Birçok tahmin RBPS birçok yeni fonksiyonlara hizmet verdiği düşündüren ³⁵ (RRM alanını içeren tahmin Arabidopsis RBPS yaklaşık% 50'ye örneğin hiçbir metazoan ortologlarıyla) bitkilere özgü olduğu söylenemez dikkat çekicidir. Tahmini RBP'lerin çoğu işlevleri tanımlanmamış halde kalır ²³ .

Arabidopsis etiylü fidelerden, yaprak dokusundan, kültür kök hücrelerinden ve yaprak mezofil protoplastlarından mRNA'ya bağlı proteomların izolasyonu,mRNA interaktom yakalama ^{geçenlerde, 39 38} bildirilmiştir. Bu çalışmalar, yakın gelecekte bitkilerde fonksiyonel RBP'lerin sistematik olarak kataloglanmasının güçlü potansiyelini ortaya koymaktadır. Burada, bitki protoplastlarından ( yani, hücre duvarları olmayan hücrelerden) mRNA interaksiyonu yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları, en önemli yaprak hücresi türüdür. İzole edilmiş protoplastlar, UV ışığının hücrelere en iyi şekilde erişilmesine izin verir. Bu hücre tipi, fonksiyonel karakterizasyon için proteinleri geçici olarak ifade eden tahlillerde kullanılabilir ^{40 , 41} . Ayrıca protoplast, birkaç diğer bitki hücre türüne ve tür ^{42 , 43 , 44'e uygulanmıştır} ( örneğin, Petersson ve diğerleri , 2009; Bargmann ve Birnbaum, 2010; ve Hong ve ark ., 2012).

Yöntem toplam 11 basamağı kapsamaktadır ( Şekil 1A ). Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları önce izole edilir (aşama 1) ve sonra çapraz bağlanmış mRNP'leri oluşturmak için UV ışınlarına maruz bırakılır (aşama 2). Protoplastlar denatüre edici şartlar altında parçalandığında (basamak 3), çapraz bağlanmış mRNPler liziz / bağlama tamponunda serbest bırakılır ve oligo-d (T) ₂₅ boncuklar tarafından çekilir (adım 4). Sıkı yıkamalar birkaç tur sonra, mRNPs saflaştırılmış ve daha da analiz edilir. MRBP'lerin denatüre peptitleri, çapraz bağlı mRNA'lar saflaştırılmadan ve RNA kalitesi qRT-PCR ile doğrulanmadan önce proteinaz K ile sindirilir (adımlar 5 ve 6). RNaz işlemi ve protein konsantrasyonundan (7. adım) sonra, protein kalitesi SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve gümüş boyama (adım 8) ile kontrol edilir. Protein band örüntülerindeki fark, çapraz bağlı bir numune (CL) ile çapraz bağlanmamış bir numune (CL olmayan;UV ışınlamasına tabi tutulmayan protoplastlardan gelen negatif kontrol örneği). Proteinlerin tanımlanması, MS tabanlı proteomikler aracılığıyla gerçekleştirilir. CL örneğinden gelen proteinler olası arka plan kontaminasyonunu gidermek için tek boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (1D-PAGE) ile ayrılır, tripsin kullanılarak kısa peptidlere "in-jel ile sindirilir" ve saflaştırılır (adım 9). Nano ters faz sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisine (nano-LC-MS) bağlı olarak, mRNA'ya bağlı proteomdaki kesin protein miktarının belirlenmesine olanak tanır (basamak 10). Son olarak tanımlanan mRNA'lar, biyoenformatik analiz (adım 11) kullanılarak karakterize edilir ve kataloglanır.

Protokol

1. Arabidopsis Yaprak Mezofil Protoplast İzolasyonu

NOT: Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları, Yoo ve diğerleri , 2007 tarafından çeşitli dönüşümleri ⁴⁰ ile tarif edildiği gibi temel olarak izole edilir.

1. Bitkilerde büyüme
   1. Tabakalaşma için yaklaşık 200 Arabidopsis thaliana Col-0 ekotip tohumlarını sterilize edilmiş suda 4 ° C'de karanlıkta 2 gün süreyle bekletin.
      NOT: Bu tohum sayısı bir CL olmayan örnek ve bir CL örneği için yeterlidir (adım 1.3'e bakın).
   2. Kapları% 50 ( v / v ) toprak ve vermikülit karışımı ile hazırlayın ve toprağı ıslatmak için kapları damıtılmış su ile bir tepside bekletin.
   3. Katmanlı tohumları ıslak toprakta toplayın ve dağıtın. Arabidopsis tohumlarının çimlenmeye ışık tutması gerektiği için tohumları ek toprakla kaplamayın.
      NOT: Bitki büyüme koşulları 23 ° C'de 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsüdür,Çiçeklenme öncesi 5 hafta boyunca bir büyüme odasında 100 μmol m ^-2 s ^-1 ışık şiddeti ile. 4 haftalık bitkiler de kullanılabilir ⁴⁰ .
      NOT: Adım 1.2.1 ila adım 3.2.3'teki tüm açıklanan malzemeler ve reaktifler, iki örnek için ( yani bir CL olmayan numune (UV-C ışınlamasına tabi tutulmayan kontrol örneği) ve bir CL örneğinde (araştırma UV-C radyasyona maruz bırakılan numune)).
2. İzotonik enzim çözeltisinin hazırlanması
   1. 80 mL primer izotonik enzim solüsyonu (400 mM manitol, 20 mM KCl ve 20 mM MES tampon (pH 5.7)) haline getirin ve 10 dakika boyunca 60 ° C inkübatörde çözeltiyi hemen ısıtın.
   2. 1.2 g Selülaz R10 ( w / v % 1.5) ve 0.32 g Macerozyme R10 ( w / v % 0.4) tozu, sıcak primer izotonik enzim solüsyonuna ilave edin.
   3. Nazikçe karıştırarak enzim tozu özenle çözeltiye getirin. tıklatmaEnzim solüsyonu açık kahverengi oluncaya kadar, 60 ° C'lik inkübatörde boşa ısıtın, 10 dakika kadar ısıtın.
   4. Çözeltiyi 3 dakika boyunca buzda soğutun ve çözeltiye 800 μL 1 M CaCl ₂ ve 800 μL% 10 ( a / a ) BSA ilave edin.
   5. Pipetleme ve 0.22 um'lik bir filtreyle filtreleme ile çözeltiyi homojen hale getirin. Bu nihai izotonik enzim solüsyonunu iki büyük ölçekli Petri tabağına (150 mm x 20 mm) alın.
3. Arabidopsis rozet yaprak şeritlerinin hazırlanması
   NOT: Her bir Petri kabı için 150 yaprak, bir CL olmayan numune veya bir CL örneği için önerilir.
   1. Yeni ve keskin bir tıraş bıçağı kullanarak 0.5 ila 1 mm arasında yaprak şeritler halinde toplam 300 genişletilmiş ^2. veya ^3. sıra gerçek yaprakları (ortalama: rozet başına 3-4) seçin ve kesin.
   2. Şeritleri hemen izotonik enzim solüsyonuna aktarın ve daldırın.
      NOT: Işıkla temas etmesini önlemek için, daima tO Petri yemekleri alüminyum folyo ile. Yaprakları ezme. Tüm şeritlerin çözeltiye battığını ve yüzeyde yüzmediğini doğrulayın.
4. Arabidopsis yaprak mezofil protoplastlarının izolasyonu
   1. Alüminyum folyo kaplı Petri kaplarını vakum desikatörlerine yerleştirin ve 30 dakika süreyle yaprak şeritlerine vakum altında sızdırın. Ardından, Petri kaplarını 2.5 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanmadan karanlıkta inkübe edin.
   2. Yavaşça ve kısaca bulaşıkları elle yatay olarak sallayın, protoplastları enzim çözeltisine tamamen boşaltmaya çalışın.
5. Protoplastları toplamak ve saymak
   1. Protoplast süspansiyonu 35 ila 75 μm'lik naylon örgü vasıtasıyla filtreleyin. Her numunenin süzüntüsünü iki 50 mL yuvarlak tabanlı tüpe (her tüpte yaklaşık 20 mL filtrat) alete bırakın.
   2. Her bir Petri kabını 10 mL W5 tamponu (154 mM NaCl, 125 mM CaCl _{2, 5 mM KCI ve 2 mM MES tamponu (pH 5.7)) ilave edin ve geri kalan protoplastları enzim solüsyonuna aktarın. Her bir numunenin 10 mL'lik süzüntüsünü tüplere ekleyin. Tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve buz üzerinde tutun.}
   3. Protoplastları peletlemek için dört tüpe 100 xg'de 5 dakika döndürün. Süpernatantı atın ve her tüpteki protoplast pelletlerini yavaşça 10 mL W5 tamponu ile tekrar süspanse edin.
      NOT: Protoplast pelletlerini tekrar askıya alırken, tüpü ters çevirerek hafifçe ters çevirin ve peletler kaybolana kadar tüpü hafifçe elle döndürün. Hücrelerin zarar görmesini önlemek için pelleti doğrudan doğruya pipetle göndermeyin.
   4. Adım 1.5.3'ü bir kez tekrarlayın ve her bir numunenin iki tüpünden alınan protoplast süspansiyonunu bir adet 50 mL'lik yuvarlak tabanlı tüpe birleştirin. Tüpleri buzda tutun.
   5. Bir hemositometre kullanarak protoplastları sayın.
      Not: 25 küpleri içindeki her 20 hücre ml / 2 x 10 ⁵ protoplast eşittir. 150 yaprak yaklaşık 1 x ¹⁰⁷ hücre vermelidir.CL ve CL olmayan örneklerde eşit sayıda protoplasta sahip olacak şekilde modüle edin.
   6. Protoplastları 30 dakika boyunca buzda tutun. Daha sonra tüpleri 100 x g'de 5 dakika döndürün. Süpernatant atılır ve mmg çözeltisinin 20 mL (400 mM Mannitol, 15 mM _MgCl2, 4 mM MES tamponu (pH 5.7)) ile, her bir tüp içinde protoplast tekrar süspansiyon.

2. UV ışınlamayla In Vivo mRNA-protein Çapraz Bağlama

NOT: CL olmayan numune tüpünü buz üzerinde tutun. CL örneği derhal UV radyasyona tabi tutulmalıdır.

1. CL örnek tüpünden 1 x 10 ⁷ hücre içeren protoplast süspansiyonunu yeni büyük ölçekli bir Petri kabına (150 mm x 20 mm) aktarın ve plaka yüzeyini örtmek için 30 mL buz soğuk MMg solüsyonu ilave edin. Nazik pipetleme ile tüm MMg tamponundaki hücreleri yayın. Petri kabını derhal üst kapak olmadan bir UV çapraz bağlama aparatı içine yerleştirin.
   NOT: UV lambası arasındaki yükseklikVe Petri kabı 8 cm'dir.
2. 254 nm dalga boylu UV ışığı ve 0,00875 W / 1 dk, 3 dakika ya da 5 dakika için ^cm2 UV yoğunluğu ile örnek ışın tedavisi. Işınlama sonrasında, hızla iki yeni 50 mL yuvarlak tabanlı tüp içine protoplast süspansiyonu alikotu. Kalıbın alt kısmını, protoplastların geri kalanını toplamak için ilave 5 mL buz soğukluğundaki MMg solüsyonuyla yıkayın ve bu hücre süspansiyonunu bu iki tüpe ekleyin.
   NOT: en uygun koşul olarak 1 dakika seçildi. Açıklama Temsilcilik Sonuçlarında bulunabilir .

Denatürasyon Koşulları Altındaki Protoplast Lizizasyonu

1. Lizizme yönelik protoplast pelletlerinin hazırlanması
   1. CL olmayan numune tüpünü, adım 2'deki iki CL numune tüpü ile birlikte 100 xg'de 5 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın. CL olmayan numune protoplast topağının tüpünü tekrar buz üzerine yerleştirin.
   2. Her CL numune tüpüne 10 mL buz soğuk MMg solüsyonu ekleyin, genPeletleri tekrar süspansiyon haline getirin ve birer 50 mL yuvarlak tabanlı tüpe geri birleştirin. Boruyu 100 xg'de 5 dakika döndürün. Süpernatantı çıkardıktan sonra, CL örnek tüp protoplastı peletini buz üzerinde tutun.
2. Protoplast lizisi ve homojenleştirici protoplast lizatı
   1. 9 mL buzda soğutulmuş liziz / bağlama tamponu (500 mM LiCl,% 0.5 ( w / v ) Lityum Dodesil Sülfat (LiDS), 5 mM Ditiyotreitol (DTT), 20 mM Tris-HC1 (pH 7.5) ve 1 mM EDTA (pH 8.0)) her numunenin hücre pelletine eklendi. Süspansiyon homojen olarak açık yeşil olana kadar yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek protoplastları iyice parçalayın.
   2. Homojenizasyon için dar bir iğne (0.9 x 25 mm ^{x 2)} 50 mL'lik bir cam şırınga yoluyla protoplast lizatı, iki kez geçmek. Lizatı 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Lizatları sıvı nitrojende dondurun ve 3 haftaya kadar -80 ° C'de saklayın.

4. mRNP Çekme ve SaflaştırmaOligo-d (T) tarafından ₂₅ Boncuklar

NOT: Adım 4.1'den adım 4.4'e kadar aşağıda tanımlanan tüm malzemeler ve reaktifler, yalnızca bir örnek ( yani, bir CL olmayan örnek veya bir CL örneği) içindir. Boncuk süpernatantı lizizi / bağlama tamponu atıldıktan sonra protoplast lizat hemen boncuk içeren tüplere eklenmelidir.

1. Oligo (dT) yakalama için oligo-d (T) ₂₅ manyetik boncukların hazırlanması
   1. Donmuş protoplast lizatını oda sıcaklığında çözdürün. Lizat tamamen eritildiğinde, lizat tüpünü buz üzerinde tutun.
   2. Buz üzerinde 6 yeni 2 mL'lik yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüplerine 1.8 mL oligo-d (T) ₂₅ manyetik boncuk (5 mg / mL) ilave edin. Her bir tüpte boncuk süspansiyonunu kısaca yukarı ve aşağı pipetleme ve hafifçe 4 ° C'de 2 dakika döndürerek 600 μL liziz / bağlama tamponu ile homojen olarak yıkayın. Boncukları buzda tutun.
2. bağlayıcı
   1. yerTüm 6 tüp, boncukları manyetik bir rafta 4 ° C'de 3 dakika boyunca tutarak, boncukların manyetik olarak tutulması ve süspansiyonun temizlenmesine neden olacak.
      NOT: Tüpler manyetik rafa yerleştirildiğinde, boncuklar tamamen yakalanana kadar bekleyin, en az 3 dakika.
   2. Süpernatantı atın ve hemen bu 6 tüp içine 9 mL protoplast lizat alikotu. Homojen bir kahverengi süspansiyon görününceye kadar pipetle iyice karıştırın ve boncukları protoplast lizat içerisinde 4 ° C'de hafifçe döndürerek 1 saat inkübe edin.
      NOT: 30 dakikadan 1 saate kadar inkübasyon süresi önerilir.
3. Yıkama
   1. Tüpleri manyetik rafa tekrar 4 ° C'de 3 dakika yerleştirin. Tüm boncuklar tüplerin yan tarafında tutulduktan sonra, protoplast lizatını 6 yeni 2 mL'lik yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüplerine alın ve geçici olarak 4 ° C'de saklayın. Protoplast lisatını derhal ÇIKARMAYIN; Lisatı tutmak4 ° C'de.
   2. Boncuklara 1.5 mL buz soğukluğunda yıkama tamponu 1 (500 mM LiCI,% 0.1 ( a / h ) LiDS, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HC1 (pH 7.5) ve 1 mM EDTA Her tüpte Boncukları tekrar süspanse edin ve 1 dakika boyunca hafifçe döndürün. Tüpleri 4 ° C'de 3 dakika manyetik rafa geri yerleştirin ve süpernatanı atın. Bu yıkama adımını yıkama tamponu ile bir kez tekrarlayın.
   3. 1.5 mL buz soğukluğunda yıkama tamponu 2 (500 mM LiCl, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM EDTA (pH 8.0)) kullanılarak iki kez aynı yıkama basamağını tekrarlayın ve bir kez 1.5 mL buz soğukluğundaki düşük tuzlu tampon (200 mM LiCl, 20 mM Tris-HC1 (pH 7.5) ve 1 mM EDTA (pH 8.0)).
      NOT: Eğer mRNP'ler protoplast lizattan etkin bir şekilde izole edilmişse yıkama tamponu 2 ile yıkama aşaması sırasında CL örneğinde boncuk taneciği çevresinde görülebilecek bir "halo" olmalıdır ( Şekil 1B ).
4. elüsyon
   1. 500 mcL ekleHer tüp içindeki boncuklara elüsyon tamponunun (20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM EDTA (pH 8.0)) eklenmesi. Boncukları yavaşça tekrar süspanse edin ve poli (A) -tailed RNA'ları serbest bırakmak için 3 dakika 50 ° C'de inkübe edin. Pipetleme ile boncukları bir kez hafifçe tekrar süspanse edin. Tüpleri 4 ° C'de 5 dakika süreyle tekrar manyetik rafa yerleştirin.
   2. Tüm eluentları (toplamda yaklaşık 3 mL) buzda temiz, steril RNaz içermeyen, 15 mL'lik konik alt boruya aktarın ve birleştirin.
      NOT: RNA'nın kalitesi ve miktarı bir spektrofotometre cihazı kullanılarak derhal tespit edilebilir.
      NOT: Her numunenin RNA konsantrasyonu yaklaşık 10 ng / μL, A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı 1.9'dur. A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı 1.6 ve 2.0 arasında olmalıdır, çünkü izole poli (A) -tailed RNA'lar genelde% 70'den daha saftır. RNA konsantrasyonu çok düşükse, başlangıç ​​protoplastlarının sayısını maksimum 10 ^9'a yükseltin. NumunelerSıvı nitrojende dondurulabilir ve uzun süreli depolamada 80 ° C'de tutulabilir.
   3. Proteoplast lisatından poli (A) kuyruklu RNA'ları boşaltmak için ek bir iki mermi için adım 4.2 ile adım 4.4 arasında tekrarlayın ve oligo-d (T) ₂₅ boncukları tekrar kullanın.
      NOT: Üç tur çekme prosedüründen sonra, CL veya CL olmayan her numune için toplam 9 mL temizleyici olmalıdır. RNA'nın bozulmasını önlemek için tüm çalışmaları 4 ° C'de gerçekleştirin. Boncukları tekrar kullanmak veya yeniden oluşturmak için adım 4.5 veya adım 4.6'yı izleyin.
5. Yeniden kullanılmış oligo-d (T) ₂₅ boncukların hazırlanması
   1. Boncukları 1 mL buz soğukluğunda elüsyon tamponuyla ve bir kez 500 mL'ye kadar tuz LiCl konsantrasyonunu ayarlamak için 1 mL buz soğukluğunda liziz / bağlama tamponu ile yıkayın.
   2. Adım 4.1'i izleyin, süpernatıttan atın, depolanmış protoplast lizatını her tüpe aktarın ve tüm prosedürü adım 4,2'den adım 4'e ilave bir iki tur daha tekrarlayın.
6. Oligo-d (T) ₂₅ boncukların yenilenmesi
   NOT: Boncuklar depolanabilir ve başka bir deney için kullanılabilir (maksimum tekrar kullanım üç kere).
   1. Adım 4.4'ü uygulayın, boncuklara 1 mL 0.1 M NaOH ilave edin ve 5 dakika oda sıcaklığında döndürerek inkübe edin. Her bir tüp için, dengeleme için% 0.1 Tween-20 içeren 1x PBS (pH 7.4) ile yıkama tamponu 1 ve yıkama tamponu 1 mL ile iki kez yıkayın. Her tüpteki boncukları, 4 ° C'de% 0.1 Tween-20 içeren steril RNaz içermeyen 1x PBS (pH 7.4) 300 μL'de uzun süre saklama için tutun.
      NOT: Bu deneyde Arabidopsis CL örnekleri için kullanılan boncuklar, bir dahaki sefere aynı bitki örnekleri için kullanılabilir.

5. Proteinaz K Tedavisi ve mRNA Saflaştırması

1. Proteinaz K tedavisi
   1. UV ile çapraz bağlanmış proteinleri sindirmek için her bir numunenin 1 mL'lik yıkayıcıya 8 uL Proteinaz K çözeltisi (2 μg / μL) ekleyin. brSanki vorteks.
2. MRNA saflaştırması
   1. Eluenti 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Kalıntı kirleticileri çıkarmak için RNA arıtma kitini kullanarak RNA'yı arındırın.
      NOT: Saflaştırmadan sonra RNA'lar, qRT-PCR testini kullanarak RNA kalite testi için hazırdır.
      NOT: RNA mini kiti ve TRIzol reaktifi gibi diğer kitler de kullanılabilir ¹⁴ .

6. qRT-PCR Testi

1. Ters transkripsiyon
   1. Birinci iplikcik cDNA'sının, ters transkripsiyon sistemi kullanılarak, 1 μg RNA'yı şablon olarak verimli bir şekilde sentezlemesine ulaşın. Numuneyi nükleaz içermeyen su ile 5 ng / μL'ye seyreltin.
2. QRT-PCR kullanılarak cDNA kantifikasyonu
   1. Şablon olarak 10 ng cDNA ile qPCR master karışımı ve gerçek zamanlı PCR cycler kullanarak cDNA'yı genişletin ve ölçün. Aşağıdaki PCR programını kullanın: 95 ° C'de 10 dakika(Evre 1, bir döngü) ve 15 saniye boyunca 95 ° C ve 1 dakika süreyle 60 ° C'de (evre 2, 40 döngü) gerçekleştirildi.
      NOT: Burada kullanılan referans geni, endojen bir iç kontrol geni olan UBQ10 (AT4G05320) idi. UBQ10 ve 18S rRNA için qRT -PCR primerleri Li ve diğerleri , 2014 ve Durut ve diğ ., 2014, sırasıyla ^{45 , 46'da} tarif edilmiştir. Primer sekanslar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

7. RNase Tedavisi ve mRBP Konsantrasyonu

1. RNase tedavisi
   1. RNaz A ve RNase T1 içeren yaklaşık 100 U RNaz kokteylini 8 mL'lik eluent içine ilave edin. Eluent'ın yerini nükleaz içermeyen su ile değiştiren RNase kokteyli ile bir negatif kontrol örneği ekleyin. Kısaca vorteksleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. MRBP konsantrasyonu
   1. RNaz sindiriminden sonra eluent'u konsantre ediniz.G santrifüj filtre üniteleri. Son hacim, 75 μL'dir ve konsantrasyondan sonra her bir örnekteki toplam protein verimi yaklaşık 2 ug'dir. Numuneleri, uzun süreli saklama için -80 ° C'ye yerleştirin.

8. SDS-PAGE ve Gümüş Boyama

1. SDS-PAGE
   1. 15 μL 2x yükleme boya ile 25 μL konsantre eluent (CL örneği) veya kontrol örneği (CL olmayan örnek) karıştırın. Numuneyi 5 ° C'de 95 ° C'de ısıtın ve bir protein markörü de dahil olmak üzere% 5 yığın jeli ve% 12 çözünen jel içeren bir SDS-PAGE jeline yükleyin.
   2. Proteinleri 40 dakika boyunca 60 V'da yoğunlaştırın ve yükleme boyası çözülmekte olan jelin sonuna ulaşana kadar yaklaşık 1 saat 160 V'de ayrın.
2. Gümüş boyama denemesi
   1. SDS-PAGE jelini her seferinde 5 dakika süreyle ultra saf su ile yıkayın. Ticari bir gümüş leke kiti kullanarak proteinlerin gümüş boyasını gerçekleştirin.
      NOT: Protein bantları 5 dakika içinde gösterilmelidir. Şeritler çok hafif renkte 5 dakikanın ötesinde görülebiliyorsa, başlangıç ​​protoplastlarının sayısını en çok 10 ^9'a kadar arttırması önerilir.

9. Protein Bantlarının Trypsin Digest ve Peptid Saflaştırılması

1. Tripsin sindirimi
   NOT: mRBP tanımlaması için her numuneden konsantre mRBP solüsyonundan 25 μL daha alınarak ikinci bir 1D-PAGE jeli çalıştırın; Gümüş boyalı jeller MS analizi ile uyumlu olmadığından kullanılamazlar.
   1. 1D-PAGE jelini çalıştırdıktan sonra, jel sabitleme solüsyonunda (% 50 ( h / h ) metanol ve% 10 ( h / h ) asetik asit) 1 saat süreyle sabitlenir. Jel yumuşak sallama ile 20 dakika boyunca leke çözeltisi (% 0.1 ( w / v ) Coomassie Brilliant Blue R-250,% 50 ( v / v ) metanol ve% 10 ( v / v ) asetik asit) ile leke uygulayın. Destain çözeltisinde jel koyun (% 40 ( h / h ) metanol ve% 10 ( v/ V) asetik asit) ile 1 saat süreyle reaksiyona sokulmuştur. Destinasyondan sonra, jelin% ​​5'lik ( v / v ) asetik asitte muhafaza edilmesini sağlayın.
      NOT: Destination işlemi sırasında arka plan tamamen silinene kadar yeni destain çözümü değiştirilebilir.
   2. Jelden ilgi bantlarını kesin. Daha sonra uygun bir şekilde tripsin emdirme ve peptidlerin ekstraksiyonu için yaklaşık 1 ila ³ mm parçalar halinde daha da bantlar kesilir. 10 dakika boyunca 100 mM amonyum bikarbonat, 50 uL _{(NH4 HCO3)} ile jel parçalarının bütünüyle hidre. Jel parçalarını tamamen örtün.
      1. Dikkatle nemlendirici çözeltisini çıkarın ve 10 dakika boyunca asetonitril _(CH3CN) ile jel parçalarının kurutmak. Asetonitril solüsyonunu dikkatlice çıkarın.
      2. İşlemi hidrasyondan dehidrasyona iki kere tekrarlayın. Son olarak, asetonitril solüsyonunu çıkarın.
         NOT: Jel çalışma süresi deneyin amacına bağlıdır. Uzun süreler proteinlerin iyi ayrılmasına izin verir, bu nedenle lekeli jel yasağıDs daha fazla analiz için kesilebilir. Amaç proteinleri tutmak ve kirleticileri uzaklaştırmak ise, kısa bir çalışma süresi yeterlidir.
   3. 6.6 mM DTT solüsyonu 500 mcL ekleyin ve jel parçaları 10 dakika inkübe edin. DTT solüsyonunu çıkarın ve jel parçaları iki kez% 95 ( v / v ) asetonitril çözeltisi ile 500 mcL ile yıkayın.
      1. Yıkadıktan sonra, asetonitril solüsyonunu çıkarın ve jel parçalarını, karanlıkta 10 dakika boyunca 500 mcL 55 mM iyodoasetik asit (IAA) çözeltisi ile inkübe edin.
      2. İnkübasyondan sonra çözeltiyi çıkarın ve jel parçalarını tekrar% 500 ( v / v ) asetonitril çözeltisi 500 mcL ile yıkayın. Jel parçalarını kurutun.
   4. Jel parçalarını 25 uL sindirim tamponu (50 mM NH ₄ HCO ₃ , 5 mM CaCl ₂ ve 6 ng / μL tripsin) ile tamamen gömün ve tripsin jel içine nüfuz etmek için 45 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Jel parçaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Zimatik sindirim.
2. Peptit arıtımı
   1. Sindirim tamponundaki jel parçalarına 80 mcL 50 mM NH ₄ HCO _{3 ilave} edin ve triptik peptitleri çıkarmak için art arda girdaplayın. Ekstraktı toplayın. % 50 80 uL (h / h) _CH3CN ve% 5 (h / h) formik asit (FA) ile iki kez ekstraksiyon adımı tekrar edin.
      NOT: Toplam nihai ekstrakt yaklaşık 240 μL olmalıdır.
   2. Özü vakum konsantrasyon veya liyofilizasyon ile ekstraktları yaklaşık 10 uL'ye konsantre edin ve% 25'lik ( v / v ) sulu trifluoroasetik asit (TFA) çözeltisi ilave edin. Üreticinin protokolünü izleyerek numuneleri μ-C18 kolonlarla desalze edin.
   3. 4 peptidleri Zehir -% 60, 10 uL _CH3CN ve% 0.1 (h / h) FA (ağırlık / hacim). Peptidleri liyofilize edin (dondurarak kurutun) ve analiz edilinceye kadar -20 ° C'de saklayın.

Başlık "> 10. Nano-LC-MS

1. Nano ters fazlı sıvı kromatografisi
   NOT: LC-MS analizini, bir sıvı kromatografi cihazı ile çevrimiçi olarak birleştirilen bir kütle spektrometresi ile gerçekleştirin. Bu alet bir C18 sütunu (2 um parçacık, 100 Â gözenek boyutu ve 50 μm x 15 cm boyutunda) ile donatılmalıdır.
   1. Solüsyon 16 uL liyofilize peptidleri yeniden süspanse edin (% 2 (v / v) _CH3CN ve% 0.1 (h / h) FA). C18 precolumn (3 μm parçacık boyutu, 100 Â gözenek boyutu, nanoviper ve 75 μm x 2 cm boyutta) üzerinde 5 μL / dak'lık bir akış hızında 5 μL peptit çözeltisi enjekte edin ve yükleyin.
   2. 10.1.2. Peptidleri, 300 nL / dak'lık bir akış hızı ile 95 dakikalık bir degrade kullanarak ayırın. Bu ayırma gradyanında sırasıyla 5 dakika, 50 dakika ve 18 dakika içinde mobil faz B'yi% 4'den% 10'a,% 10'dan% 25'e ve% 25'den% 45'e arttırın. Son olarak, mobil faz B'yi 1 dakika içinde hızla% 95'e yükseltin. SonraHer 95 dakikalık ayırma derecesi, 5 dakika içinde% 4 ila% 95'lik bir 10 dakikalık gradyan içeren özlü bir durulama adımını uygular.
      Not: Mobil faz A 19.92% _H2O,% 80% 99.9 _H2O ve% 0.1 (h / h) FA ve mobil faz B olduğu _CH3CN ve% 0.08 (h / h (ağırlık / hacim) ) FA.
2. Kütle spektrometri deneyi
   1. Kütle spektrometresini 400 ila 1,600 m / z'lik bir kütle aralığına sahip veri bağımlı modda çalıştırın.
   2. Parçalanma spektrumu oluşturmak için MS1'deki en yoğun iyonlardan on tanesini seçin. Çözünürlüğü, MS1 için 3.000.000 ve 1.000.000 iyon otomatik kazanım kontrolü (AGC) hedefi ve MS1 için 256 ve 64 ms'lik maksimum iyon enjeksiyon süresi (IT) ile MS1 için özdeşliği 70.000 tamsayfa (FWHM) ve MS2 için 17.000 olarak ayarlayın Ve MS2, sırasıyla.
   3. En bol iyonların tekrar tekrar parçalanmasını önlemek için dinamik dışlamayı 10 saniyeye ayarlayın.
      NOT: Burada bir veya daha fazla yük içeren iyonlar eMS2 için xcluded.
3. Kalitatif proteomik: peptid ve protein tanımlaması
   1. Peaks studio yazılımı ^{47 , 48 , 49} gibi yazılımları kullanarak parçalanma spektrumlarını analiz edin.
      Not: diğer yazılım paketleri NovoHMM ³⁰ de novo dizileme için PepNovo ³⁷ ve SEQUEST ⁵⁴ ve veritabanı arama için Mascot ⁵⁵ gibi, peptid tanımlanması için kullanılabilir.
   2. Spektrumları, aynı kitleyle (<2 ppm fark) ve tutma sürelerini (<2 dak) birleştirin ve model haline getirilen taksonomi için Swiss-Prot veritabanını (sürüm: Aralık 2013) aramak için yalnızca 0.65'den yüksek bir kalite eşiğindeki spektrumları saklayın Bitki Arabidopsis thaliana . Aşağıdaki arama parametrelerini kullanın: Monitör kullanılarak 10 ppm'lik bir öncül toplu toleransOizotopik kütle; Bir parça kütle toleransı 20 mmu; Sindirim enzimi olarak tripsin, en fazla 2 cevapsız bölünme; Sabit modifikasyon olarak sistein karbamidometilasyon; Değişken modifikasyon olarak metiyonin oksidasyonu; Ve peptit başına azami 3 değişken post-translasyonel modifikasyon. Tanımlamanın ardından, yanlış bir keşif oranının (FDR) <% 5 olması için güvenilir peptid ve protein tanımlaması için skor eşiklerini manuel olarak ayarlayın.
4. Kantitatif proteomik: kütle spektrometresi verilerinin istatistiksel analizi
   1. Proteomik verilerin etiketsiz olarak nicelendirilmesi için LC-MS ( örneğin Progenezis) kullanın.
      NOT: MS1 peptid zirve alanları (veya yoğunluğu), maksimum 10 ppm'de tolere edilen hata ile, kendi kütlelerine göre stüdyo yazılımında tanımlanan peptidlerle bağlantılıdır.
      NOT: Bu yazılım, tüm şarj durumlarının zirve alanlarını 2 ^{+ ve 8 + . Kantitatif veriler, kurum içi bir senaryo ile PEAKS peptid tanımlamasına bağlıdır (maksimum 10 ppm'lik tolere edilebilen hata ile kütle uyumu).}
   2. Her bir peptid için ortalama log2 katlı değişiklikleri (CL / non-CL) hesaplayın. Benzersiz peptidlerin katlanma değişikliklerini protein ile gruplandırın.
      NOT: Her grupta, bir proteinin son kat-değişimi, peptidlerinin ortalama kıvrım değişikliklerine eşittir.
   3. İstatistiksel önemi değerlendirmek için her bir grup için Student's t testi ile p-değerini hesaplayın. Benjamini-Hochberg (BH) yöntemini kullanarak tüm grupların FDR'sinin p değerlerini düzeltmek için R yazılım paketi (sürüm 3.3.0) uygulayın.
   4. Volkan planını, R yazılım paketi (sürüm 3.3.0) ile uyumlu "kalibrasyon" fonksiyon paketini (sürüm 1.7.2) kullanarak çizin.
      NOT: Burada, -log10 tarafından ayarlanan p değerleri (-log10 (adj. P-değeri)), belirlenen tüm proteinlerin log2 katlı değişimlerinin bir fonksiyonudur. ProteinlerLog2 katlı değişiklikleri 2'den büyük ise, mRNA'ya bağlı proteomda pozitif vuruş olarak önemlidir veya önemsiz olarak işlem görürler.

Tanımlanmış mRNA'ya bağlı Proteomun Katalogu

1. 10. adımdaki tanımlanan proteinleri, Gene Ontology (GO) veritabanı ve InterPro veritabanı üzerinden "aile ve alan" aracılığıyla "moleküler işlevler ve biyolojik süreç" öğelerine dayalı olarak üç kategoriye ayırın.
2. Kategori I veya "Ribozomal proteinler", tespit edilen tüm ribozomal proteinleri içerdiğinden, RNA'larla etkileşime giren veya RNA biyolojisinde bilinen veya bilinmeyen fonksiyonlarla RNA bağlanmasına eklenen açıklanan protein alanlarını içeren kategori II'den veya "Ana RBP'ler" den tanımlanan proteinleri tanımlar .
3. RNA biyolojisinde bilinen veya bilinmeyen fonksiyonlara sahip proteinler, açıklamalı RNA bağlayıcı alanlar olmadan kategori III veya "Aday RBP'ler" içine yerleştirildiğinde, I kategorisindeki ek açıklamalara dayanılarak kategori III'ten enzimler tanımlanırNtEnz veritabanı.

Sonuçlar

CL örneğinde boncuk taneciklerini çevreleyen, yıkama basamağı 4.3'de yıkama tamponu 2 ile ( Şekil 1B ) karakteristik bir halo gözlemledik. Araştırılmamış olmasına rağmen, bu fenomen manyetik yakalama esnasında boncuk agregasyonu ile çapraz bağlanmış mRNP komplekslerinin etkileşimi ile muhtemelen açıklanabilir ve daha yaygın bir agreganın oluşmasına neden olur. Oligo-d (T) ₂₅ boncuk yakalama etkisinin ^{14 olduğunu gösterir} . ...

Tartışma

Mayalar ve insan hücreleri için geliştirilmiş mRNA etkileşim yakalamasını yaprak mezofil protoplastlarına başarılı bir şekilde uyguladık. Yaprak yapraklarındaki başlıca zımpara türü mezofil hücreleridir. Bu yöntemin en büyük avantajı, fizyolojik bir ortamdan proteinleri keşfetmek için in vivo çapraz bağlamayı kullanmasıdır.

Bu protokolde, esas olarak birtakım optimize edilmiş deneysel koşulları ( örn., Başlangıç ​​materyali olarak kullanılacak protoplastların sayısı ve UV ı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
REAKTİFLER< / güçlü >
0.8 M Mannitol	Sigma	M1902-500G	Birincil izotonik Enzim çözeltisi & MMg çözeltisi
2 M KCl	MERCK	Art. 4935	Birincil izotonik Enzim çözeltisi & W5 tamponu
0.2 M MES (pH 5.7) (4-morfolineetansülfonik asit)	Sigma-aldrich	M2933	Birincil izotonik Enzim çözeltisi, W5 tamponu & MMg solüsyonu, Filtrasyon sterilizasyonu
Selülaz R10	Yakult İlaç Sanayi A.Ş.	SELÜLAZ " ONOZUKA" R-10, 10 g	Nihai izotonik enzim çözeltisi
Makrozyme R10	Yakult İlaç Sanayi A.Ş.	MACEROZİM R-10, 10g	Nihai izotonik enzim çözeltisi
% 10 ( a / h< / em >) BSA (Sığır Serum Albümini)	Sigma-aldrich	A7906-100G	Son izotonik enzim çözeltisi & Filtrasyon sterilizasyonu
1 M CaCl2	Chem-Lab NV	CL00.0317.1000	Nihai izotonik enzim çözeltisi, W5 tamponu ve Sindirim tamponu
1 M NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60	W5 tamponu
2 M MgCl2	Sigma	M8266-100G	MMg çözeltisi
1 M LiCl (Lityum Klorür)	Acros	199885000	Lizis/bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1, Yıkama tamponu 2 & Düşük tuz tamponu
%5 (a/v) LiDS (Lityum Dodesil Sülfat)	Sigma-aldrich	L4632-25G	Lizis/bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1 & Filtrasyon sterilizasyonu
1 M DTT (Dithiothreitol)	Thermo Fisher Scientific Yıkama tamponu 1 & Yıkama tamponu 2	307866	Lizis/bağlama tamponu,
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hidroksimetil)aminometan, Hidroklorik asit SG (HCl))	Acros & Fisher Kimya	167620010 & H / 1200 / PB15	Lizis / bağlama tamponu, < br / > Yıkama tamponu 1, Yıkama tamponu 2, Düşük tuz tamponu & Elüsyon tamponu
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Etilendiamintetraasetik asit)	Sigma-aldrich	ED-500G	Lizis / bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1. Yıkama tamponu 2. Düşük tuz tamponu & Elüsyon tamponu
Tween 20	MERCK	8.22184.0500	Oligo-d(T)25 boncuklarının rejenerasyonu
0.1 M NaOH	VWR PROLABO CHEMICALS	28244.295	Oligo-d(T)25 boncukların rejenerasyonu
1x PBS (pH 7.4) (Fosfat Tamponlu Salin) içeren (NaCl; Kartal; Na2HPO4; KH2PO4)	Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC	S/3160/60, Madde 4935, 71640-250G & 60230	Oligo-d(T)25 boncuklarının rejenerasyonu
Proteinaz K çözeltisi (2 & mu; g/μ L)	Thermo Fisher Scientific	11789020	Protein sindirimi
Yükleme boyası	Invitrogen	LC5925	SDS-PAGE
qPCR ana karışımı	Promega	A6001	qRT-PCR testi
RNase Kokteyli	Thermo Fisher Scientific	AM2286	RNA sindirimi
Metanol	Sigma-aldrich	322415	Jel fiksasyonu ve jel lekesi
Asetik asit	Sigma-aldrich	537020	Jel fiksasyonu ve jel lekesi
giderme Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Fisher Scientific	20278	Jel boyama
1 M NH4HCO3 (Amonyum bikarbonat)	Sigma-aldrich	09830-500G	Jel nemlendirme & Sindirim tamponu
CH < alt > 3 < / sub > CN < br / > (Asetonitril)	Sigma-aldrich	34851-100ML	Jel dehidrasyon ve Peptit çözme çözeltisi
IAA (İyodoasetik asit)	Sigma-aldrich	I4386-10G	Alkilleyici ajan
TFA (Trifloroasetik asit)	Sigma-aldrich	302031-10X1ML	Peptit çözme çözeltisi
FA (Formik asit)	Sigma-aldrich	06554-5G	Peptit ekstraksiyonu
Tripsin çözeltisi (6 ng/μ L)	Promega	V5280	Sindirim tamponu
İsim	güçlü><Şirket	güçlüKatalog Numarası	Yorumlar
EKİPMANLAR
Toprak	Peltracom	LP2D	Bitki büyümesi
Vermikülit 3	Sibli AS	05VERMICULIET	Bitki büyümesi
Petri kabı (150 x 20 mm)	Sarstedt	82.1184.500	Protoplast süspansiyonu için taşıyıcı
0.22 & mu; m filtre	Kırlangıç	SE2M229104	Son izotonik enzim çözeltisinin homojenizasyonu
Razorblade	Agar Scientific	T585	Rozet yaprağı şeritleri
35-75 & mu; m naylon örgü	SEFAR NITEX	74010	Protoplast süspansiyon filtrasyonu
50 mL yuvarlak tabanlı tüpler	Protoplast süspansiyon	Sigma-aldrich	T1918-10EA
Hemositometre (Bü rker hemositometre)	MARIENFELD	650030	Protoplast hücre sayma
UV çapraz bağlama aparatı (HL-2000 HybriLinker)	UVP, LLC	UVP95003101	in vivo UV çapraz bağlama
UV lambası (Sankyo-Denki G8T5)	SANKYO DENKI	SD G8T5	in vivo UV çapraz bağlama
50 mL cam şırınga	FORTUNA Optima	Z314560	Protoplast lizat Dar iğnenin homojenizasyonu
(0,9 x 25 mm)	Becton Dickinson mikrolans 3	2021-04	Protoplast lizat
Döndürücü Model L26'nın	Labinco BV	26110912
Oligo-d(T)25 manyetik boncuklar (5 mg/mL)	New England BioLabs	S1419S	mRNP'ler ve mRNA'ların bağlanması ve aşağı açılır
Manyetik raf	Invitrogen	CS15000	mRNP'ler ve mRNA'lar bağlama ve aşağı çekme
Santrifüj filtre üniteleri (Amicon Ultra-4 santrifüj filtre üniteleri)	EMD Millipore	UFC800308	mRBP konsantrasyonu
Pierce Gümüş Leke Kiti	Thermo Fisher Scientific	24612	Gümüş boyama testi
RNA saflaştırma kiti (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)	STRATEC Moleküler	1064100300	RNA saflaştırma
Spektrofotometre cihazı (NanoDrop 1000 Spektrofotometre)	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	RNA kalitesi ve miktarı
Gerçek Zamanlı PCR döngüleyici (StepOne Gerçek Zamanlı PCR döngüleyici)	Thermo Fisher Scientific	4376600	cDNA miktar tayini
ve mikro;-C18 sütunları (Millipore Zip Ucu ve mikro;-C18 sütunları)	Sigma-aldrich	720046-960EA	Peptit saflaştırma
Kütle spektrometresi (Q Exactive Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap Kütle Spektrometresi)	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Kütle spektrometresi tabanlı proteomik
Sıvı kromatografi cihazı (Ultimate 3000 ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) cihazı)	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO	Kütle spektrometresi tabanlı proteomik
C18 kolonu (Easy Spray Pepmap RSLC C18 kolonu)	Thermo Fisher Scientific	ES800	Kütle spektrometresi tabanlı proteomik
C18 prekolonu (Acclaim Pepmap 100 C18 prekolon)	Thermo Fisher Scientific	160321	Kütle spektrometresi tabanlı proteomik
Name	Şirket	Katalog Numarası	Comments
qRT-PCR testi için primerler	Sequences
UBQ10 mRNA (Li et al., 2014	)Fw: AACTTTGGTGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA (Durut et al., 2014)	Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA