Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

11.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56031

⸱

28 Temmuz 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

Bu makalede

Özet

Doğal poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için temel bir araçtır. Geleneksel olarak çoğu deney dikey jel kullanmıştır. Bununla birlikte, yatay jeller elektroforez sırasında kompleksleri izleme fırsatı gibi birçok avantaj sağlar. Yatay doğal jel elektroforezinin üretilmesi ve kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Özet

Yerli poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerinin biyokimyasal analizi için kapsamlı bir şekilde kullanılan moleküler biyolojinin temel bir araçtır. Bu etkileşimler geleneksel olarak iki cam levha arasında üretilen poliakrilamid jelleri ve numuneler dikey olarak elektroforez ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, tepsilerde dökülen ve yatay olarak elektroforez edilen poliakrilamid jeller çeşitli avantajlar sunmaktadır. Örneğin, flüoresans RNA substratları ve spesifik proteinler arasındaki kompleksleri analiz etmek için kullanılan yatay jeller, elektroforez ilerledikçe birçok kez görüntülene edilebilir. Bu, deney sırasında RNA-protein komplekslerini çeşitli noktalarda izlemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, yatay jel elektroforezi birçok numuneyi paralel olarak analiz etmeyi mümkün kılar. Bu, farklı bileşenleri ve koşulları karşılaştırmak için zamanlama deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırabilir ve aynı anda birden fazla reaksiyonu analiz edebilir. İşte biz prRNA-Protein etkileşimlerini analiz etmek için yatay doğal jel elektroforezi üretmek ve kullanmak için ayrıntılı bir protokolü inceleyin.

Giriş

Elektroforetik mobilite kayma testleri (EMSA'lar), spesifik protein-nükleik asit etkileşimleri 1 , 2 , 3'ü analiz etmek için paha biçilemez bir biyokimyasal araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahliller, proteinlerin RNA veya DNA 3'e bağlanma afinitesi hakkında önemli bilgi sağlayabilir ve nükleik asit-protein komplekslerinin 1 bileşen stokiyometrisi 1 ve substrat rekabet deneyleri 1 yoluyla RNA bağlama proteinlerinin bağlanma spesifitesi hakkında önemli yeni bilgiler sağlar 1 .

Bu deneyler için geleneksel deney düzeneği, saflaştırılmış proteinin radyo-etiketli bir RNA substratı ile karıştırılmasından oluşur. Ortaya çıkan kompleksler daha sonra iki cam levha arasına dökülen denatüre edici olmayan (doğal) poliakrilamid jeller ile, ardından dikey bir cihazda 3 numune elektroforeziyle analiz edilir. Bu yaklaşım, proteinlerin nükleik asitlere bağlanmasının temelini oluşturan biyokimyasal mekanizmalarda önemli bilgiler sağlamak için kapsamlı bir şekilde kullanılmış olmakla birlikte, çeşitli sınırlamaları da vardır. Örneğin, bu temel strateji nispeten düşük işlem hacmine sahiptir ve birçok bağlama reaksiyonunu paralel olarak analiz etmeyi gerektiren uygulamalar için kolayca uyarlanamaz. Buna ek olarak, geleneksel dikey aparat ile elektroforez 3 , 4 sırasında kompleksleri birden çok kez potansiyel olarak izlemek zor.

Burada, düz yataklı bir aparatta, yatay elektroforezde ve floresanla etiketlenmiş RNA substratları 4 , 5 , 6 , 7'de yerli poliakrilamid jelleri kullanan EMSA tahlilinin uyarlamasını sunuyoruz. Bu nispeten basit değişikliklerin temel samana dahil edilmesiTegy bazı güçlü avantajlar sağlar. Özellikle yatay masaüstü biçimi, düzinelerce numuneyi eşzamanlı olarak analiz etmeye yardımcı olur 4 . Ayrıca, Bicaudal-C proteini ile RNA substratı arasında oluşan RNA-protein kompleksleri için, yatay bir jelde elektroforez farklı RNA-protein komplekslerini çözmek ve bağlanmamış RNA substrattan ayırmak için artan bir yeteneğe sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Yatay Native Poliakrilamid Jelin Hazırlanması 4 .

  1. Gerekli malzemelerin hazırlanması.
    1. Yatay jel aparatı için 27 cm x 21 cm'lik bir tepsi ve iki adet 24 kuyucuklu tarak için bir jel kutusu (37 cm x 24 cm) kullanın. Bu kurulum, aynı anda analiz edilebilecek toplam 48 örnek sağlar.
    2. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:% 40 Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8.0), TEMED ve% 10 APS (amonyum persülfat).
  2. % 10 yerli akrilamid jelinin üretilmesi.
    1. 500 mL'lik bir şişe içerisinde 80 mL 5x TBE, 100 mL% 40 akrilamid ve su 400 mL'lik bir son hacme ilave edin.
    2. 4 mL% 10 APS ve 400 μL TEMED ekleyin. İyice karıştırın.
    3. Karışımı yatay döküm tepsisine dökün ve jelin 30 dakika boyunca polimerleşmesine izin verin. Jel yaklaşık 2 cm kalınlığında olacaktır.
      NOT: Jel hızlandırmak için bir duman kabına dökebilirUp polimerizasyon. Polimerizasyondan sonra, ince bir tabaka sıvı jelin üzerinde kalacaktır.
    4. Sıvıyı boşaltın ve akan tamponla durulayın. Tarakları dikkatlice çıkarın ve bir şırınga kullanarak oyuklu tamponla oyukları durulayın.
  3. Çalışan tamponun hazırlanması.
    1. Jel kutusu için 2 L 1x TBE akış tamponu hazırlayın. 400 mL 5XTBE'yi 1600 mL ile inceltin ve karıştırın. Soğuk olması için 1x TBE tamponu soğuk odaya yerleştirin.
  4. Jeli önceden çalıştırma
    1. Jel kutusuna 2 L soğuk çalıştıran tampon ekleyin ve jeli takın.
    2. Jeli, soğuk bir odada 4 ° C'de 1 saat 120 V'de önceden çalıştırın. Bu süre zarfında, bağlanma reaksiyonunu hazırlayın.

2. Bağlama Tepkisi 8

  1. 2.1.Aşağıdaki reaksiyon bileşenlerini hazırlayın.
    20 mM DTT
    10 mM BSA
    10 mM maya tRNA'ları
    5X bağlama tamponu (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCI,% 0.2 Tween-20)
    Ticari olarak satın alınan 100 nM floresan etiketli RNA
    Konsantre Bikioz-C proteini
    DEPC ile muamele edilmiş, H2O içinde% 50 gliserol
    DEPC ile muamele edilmiş H2O
  2. Bağlanma reaksiyon bileşenlerini bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin.
    1. Tüp için, 10 mM BSA 5 mcL, 20 mM DTT 5 mcL, 10 mM maya tRNA'lar 5 mcL, 5 x Cilt Tamponu 10 mcL ekleyin.
  3. 50 uL'de 250 nM son konsantrasyona protein ekleyin. 45 μL'lik nihai bir hacme su ilave edin.
  4. 5 μL floresanla işaretlenmiş RNA substratı ekleyin. Ticari olarak satın alınan bir 3 'fluorescein etiketli 32-nukleotid substrat kullanın.
  5. Karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

3. Yerli Yatay Poliakrilamid Jelinde Numunelerin Analizi

  1. Her tepkime için, 15 μL% 50 gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  2. dikkatli bir şekildJellere her reaksiyondan 30 μL ekleyin. Tek bir oyuğa yüklenebilecek numune miktarı, jelin kalınlığına ve oyukların boyutuna bağlı olarak değişir. 24-kuyucuklu bir tarakla yaratılan ve 2 cm'lik bir kalınlığa dökülen tek bir jel jeline 15 μL kadar ve 45 μL kadar hacim yükledik.
  3. Gç kaynağını jel aparatına bağladıktan sonra güç kaynağını açın ve voltajı ayarlayın. Jel 4 ° C'de 120 V'de çalıştırın.
    NOT: Yatay jel aparatı için yaklaşık 5 V / cm kalır. Dikey jel aparatı için, bu 16 V / cm'dir.
    1. Floresanla işaretlenmiş RNA'nın hasar görmesini veya ağartılmasını önlemek için karanlıkta elektroforez yapın.
    2. Analiz edilen RNA-protein kompleksinin özelliklerine bağlı olarak değişen elektroforez zamanı.
      NOT: Yatay EMSA analizinin önemli bir avantajı, elektroforezin durdurulabileceği, jelin görüntülendiği ve daha sonra daCihaza tekrar yerleştirilebilir ve elektroforez daha uzun süre devam edebilir.

4. Jel Görüntüleme

  1. Floresan yüzeyler algılama ve görüntüleme için tasarlanmış herhangi bir enstrüman ile analiz yapın.
  2. Jeli görüntüleyiciye yerleştirin.
  3. Görüntüleyici ayarlarını yapın. Floresein etiketli RNA ligandları için aşağıdaki ayarları kullanın: FAM (dalga boyu 473 nm), 750 Fotomultiplier voltaj (PMT), 100 μm piksel boyutu.
  4. Görüntü yakalamak için jel tarayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yatay doğal jel elektroforezinin gücü ve çok yönlülüğünü göstermek için Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) proteininin bir Bicc1 bağlanma yeri içeren floresanla işaretlenmiş bir RNA'ya bağlandığını analiz ettik. Bicc1 proteinleri, hayvanlarda gelişme 9 , 10 , 11 , 12'nin maternal evreleri boyunca hücre akıbeti kararlarını kontrol etmek için mRNA'ya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yerli poliakrilamid jelleri, protein-RNA etkileşimlerini araştırmak için paha biçilemez bir araçtır ve geleneksel olarak bu jeller dikey olarak 2 , 3 elektroforez edilir. Doğal poliakrilamid jelleri oluşturan ve yatay olarak elektroforez edilen 1 , 4 , 6 , 7 , 15'in yerini alan bir protokol değişi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Rakamlar hazırladığımız için Laura Vanderploeg'e teşekkür ediyoruz. E-Tablolar laboratuarı çalışması, NSF hibe 1050395 ve NIH hibe (R21HD076828) tarafından desteklenmektedir. Ryder laboratuarı NIH hibe R01GM117237 ve R01GM117008 tarafından desteklenmektedir. Megan Dowdle, National Institutes of Health'in Ulusal Tıbbı Bilimler Ulusal Enstitüsü (T32GM008349) aracılığıyla Wisconsin-Madison Enstitüsü ve Biyoteknoloji Eğitim Programı aracılığıyla SciMed GRS İleri Fırsat Fellowitesi tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yatay Jel KutusuOWLN/AÜrün artık üretilmiyor. Benzer jel kutuları Thermo Scientific, A serisi jel kutularında da bulunabilir. Katalog Numarası: A2-BP
24 kuyulu büyük büyük yatay jel elektroforez taraklarıOWLN/AÜrün artık üretilmiyor. Benzer jel kutuları Thermo Scientific, A serisi jel kutu taraklarında da bulunabilir. Katalog Numarası: A2-24C
Powerpac 300Bio-Rad1655050
Mini-Protean II Elektroforez HücresiBio-Rad165-2940
InstaPAGE-19 %40 19:1 Akrilamid/BisIBIIB70015
TEMEDIBIIB70120
APSIBIIB70080
Maya tRNA'larıAmbionAM7119
Floresein etiketli RNAIDTN/ASipariş, uzunluk ve istenen sıraya göre özel olarak yapılabilir
EDTA tetrasodyum tuzu hidratSigma-AldrichE5391-1KG
HEPESSigma-AldrichH4034-500G
Tris Baz Ultra SafABD BiyolojikT8600
Borik AsitFisher ScientificBP168-500
Potasyum KlorürFisher ScientificBP366-1
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
DEPCSigma-Aldrich1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483 12 3 Sığır
Serum Albümini (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8

Kaynaklar

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386(2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yerel PAGERNA Protein Etkile imleriElektroforetik Mobilite Kayma AnaliziFloresan RNA SubstratlarJel G r nt leme AnaliziParalel Numune AnaliziZaman Serisi DeneyleriSo uk Oda ElektroforeziTBE Ko u Tamponu
Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.